酶的分離純化(一)

模塊三、酶的下游生產(chǎn)工藝酶制劑生產(chǎn)技術(shù)生物化工學(xué)院楊芳

細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。引入酶的提取、分離純化技術(shù)路線引入是指將酶從細(xì)胞或培養(yǎng)基中取出，再與雜質(zhì)分開，而獲得與使用目的相適應(yīng)的有一定純度的酶產(chǎn)品的過(guò)程。學(xué)習(xí)情境十二酶的提取與純化工作任務(wù)（一）酶的提取工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（一）酶的提取

酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過(guò)程。也稱為酶的抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。提取目?biāo)將目的酶最大限度地溶解出來(lái)。保持生物活性。提取原則相似相溶。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。工作任務(wù)（一）酶的提取

一般說(shuō)來(lái)，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。

工作任務(wù)（一）酶的提取

注意事項(xiàng)提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過(guò)程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。一般采用低溫下（0-10℃）操作工作任務(wù)（一）酶的提取酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶工作任務(wù)（一）酶的提取沉淀分離離心分離過(guò)濾與膜分離層析分離電泳分離萃取分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法初步純化（roughfractionation）（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。使用各種柱層析法。高度純化（finefractionation）（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)?？捎弥苽涫诫娪净騂PLC。沉淀分離

沉淀分離是通過(guò)改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法沉淀分離沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過(guò)在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法基本原理（鹽溶和鹽析）向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：

1)鹽溶（saltingin）：大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象

2)鹽析（saltingout）：在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。鹽析沉淀工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法沉淀分離不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法沉淀分離鹽析沉淀優(yōu)點(diǎn)：硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。缺點(diǎn)：硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。鹽濃度的表示：硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。鹽析沉淀沉淀分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法加入飽和硫酸銨的體積溶液的總體積飽和度=調(diào)整鹽濃度的方式a.飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時(shí)。配制飽和硫酸銨溶液b.添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來(lái)體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時(shí)。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法沉淀分離鹽析沉淀等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀(isoelectricprecipitation)原理蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)使用方法單獨(dú)使用較少，多與其它方法聯(lián)合使用，因蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法沉淀分離有機(jī)溶劑沉淀

利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。沉淀機(jī)理降低溶液的介電常數(shù)部分地引起蛋白質(zhì)脫水常用有機(jī)溶劑丙酮乙醇甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法沉淀分離優(yōu)點(diǎn)：分辨率比鹽析法高沉淀不需脫鹽溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)變性失活

有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高沉淀分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法有機(jī)溶劑沉淀定義：在酶液中加入某些物質(zhì)，使其與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離。常用復(fù)合沉淀劑：?jiǎn)螌?、聚乙二醇、聚丙烯酸?fù)合沉淀工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法沉淀分離定義：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。pH變性等電點(diǎn)沉淀法是pH變性法中的一種變體。有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。選擇性變性沉淀工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法沉淀分離

離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法離心分離常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī),最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分離純化過(guò)程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法離心分離高速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min，相對(duì)離心力達(dá)到1×104～1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過(guò)程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機(jī)。離心分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速達(dá)(2.5～12)×104r/min，相對(duì)離心力可以高達(dá)5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。離心分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法過(guò)濾是借助于過(guò)濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。過(guò)濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過(guò)濾非膜過(guò)濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過(guò)濾介質(zhì)

膜過(guò)濾：采用各種高分子膜為過(guò)濾介質(zhì)

工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法過(guò)濾與膜分離過(guò)濾分離過(guò)濾的分類及其特性(根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同

)

類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法過(guò)濾與膜分離過(guò)濾分離定義：借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆粒或分子進(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。薄膜類型：主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。薄膜的作用：選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^(guò)，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時(shí)選擇。膜分離過(guò)濾與膜分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法

膜分離加壓膜分離微濾超濾反滲透電場(chǎng)膜分離電滲析離子交換膜電滲析擴(kuò)散膜分離透析工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法過(guò)濾與膜分離根據(jù)膜材料和不同進(jìn)料液的特性，商品應(yīng)用的膜產(chǎn)品通常采取如下幾種結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法過(guò)濾與膜分離微濾(Microfiltration，MF)

一種靜態(tài)過(guò)濾，隨過(guò)濾時(shí)間延長(zhǎng)，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；膜分離微濾工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法過(guò)濾與膜分離超濾(ultrafiltration，UF)

一種動(dòng)態(tài)過(guò)程，由泵提供推動(dòng)力，在膜表面產(chǎn)生兩個(gè)分力：一個(gè)是垂直于膜面的法向分力，使水分子透過(guò)膜面，另一個(gè)是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法過(guò)濾與膜分離膜分離超濾

超濾原理的示意圖

利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過(guò)的方法。超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法過(guò)濾與膜分離膜分離超濾常規(guī)過(guò)濾(A)和超濾(B)的示意圖

AB工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法過(guò)濾與膜分離膜分離超濾

反滲透（Reverseosmosis，RO）利用反滲透膜選擇性地只能透過(guò)溶劑(通常是水)的性