2018年四川省臨檢中心臨床微生物檢驗(yàn)培訓(xùn)班 9-蔣黎-二代測序在感染性疾病診治中的應(yīng)用

二代測序在感染性疾病診治中的應(yīng)用蔣

黎四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院?四川省人民醫(yī)院四川省臨床檢驗(yàn)中心提

綱??

二代測序（NextGenerationSequencing，NGS）??

NGS在臨床微生物學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域及優(yōu)勢病毒、細(xì)菌、真菌??

NGS在感染性疾病診治中的應(yīng)用要求??

總結(jié)Loman

&

Pallen，Nature

Reviews

Microbiology

2015NGS原理及儀器建庫擴(kuò)增測序Loman

&

Pallen，Nature

Reviews

Microbiology

2015IlluminaNGS平臺(tái)儀器

讀長

讀數(shù)/運(yùn)行

時(shí)長

成本宏基因組/運(yùn)行注釋Goldberg

B,

mBio.

2015;6(6):e01888‐15.454-GSNGS平臺(tái)儀器

廠商

測序方法讀長（bp）

通量

運(yùn)行時(shí)間Lefterova

MI，.

J.

Mol.

Diagn.

(2015)Ion

Torrent

NGS平臺(tái)儀器讀長讀數(shù)/運(yùn)行時(shí)長成本基因組/運(yùn)行注釋Goldberg

B,

mBio.

2015;6(6):e01888‐15.單分子測序平臺(tái)儀器廠商測序方法讀長（bp）通量運(yùn)行時(shí)間Lefterova

MI,J.

Mol.

Diagn.

(2015)現(xiàn)有NGS平臺(tái)的特點(diǎn)比較儀器讀長讀數(shù)/運(yùn)行時(shí)長

成本

基因組/運(yùn)行注釋Goldberg

B，mBio.

2015;6(6):e01888‐15.Loman

&

Pallen，Nature

Reviews

Microbiology2015微生物基因組學(xué)分析及感染性疾病Relman

DA.

N

Engl

J

Med

2011;365:347-357.NGS在臨床微生物學(xué)的應(yīng)用??

病毒診斷學(xué)??

病毒的耐藥突變檢測??

臨床樣本的病毒鑒定??

細(xì)菌學(xué)??

病原體的鑒定??

耐藥和毒力的遺傳標(biāo)志??

分型??

真菌學(xué)??

病原體鑒定NGS在臨床微生物應(yīng)用的優(yōu)勢1.

生長緩慢的致病微生物2.

培養(yǎng)樣本無生長3.

使用的培養(yǎng)條件不支持致病微生物生長4.

珍貴樣本，腦脊液5.

石蠟包埋組織，但沒有樣本送檢培養(yǎng)6.

新型或少見病原體的鑒定NGS應(yīng)用于微生物的兩種策略目標(biāo)擴(kuò)增物測序全基因組測序(GWS)Goldberg

B，mBio.

2015;6(6):e01888‐15.病毒學(xué)診斷中的應(yīng)用??

耐藥突變（DRM）的檢測??

臨床樣本的病毒鑒定病毒耐藥突變（DRM）的檢測??

DRM對某些重要臨床病毒感染的治療具有重要意義??

特異性病毒基因的檢測–?

Sanger測序–?

NGS??

臨床應(yīng)用–?

人類免疫缺陷病毒（HIV）、巨細(xì)胞病毒(CMV),乙肝病毒，丙肝病毒，流感病毒HIV-1??

抗病毒治療的耐藥突變檢出可預(yù)測療效，評估治療失敗風(fēng)險(xiǎn)??

突變檢出率：NGS比Sanger測序高一倍??

適用：初次進(jìn)行治療之前、治療后出現(xiàn)藥物耐受??

假突變產(chǎn)生的原因及解決方法–?

原因：PCR擴(kuò)增、建庫、測序；低病毒載量–?

解決途徑：設(shè)置變異的最低檢出限、用隨機(jī)序列標(biāo)記的引物建庫、用多個(gè)獨(dú)立PCR產(chǎn)物混合物建庫、更有效的生物信息工具HIV耐藥性的NGS分析1.?

DEEPGENHIV

(UniversityHospitalsCaseMedicalCenter,Cleveland,USA)–?

輔助受體易感性、蛋白酶、反轉(zhuǎn)錄酶及整合酶基因的耐藥突變–?

錯(cuò)誤率0.37%-0.39%；靈敏度

5%；通量96個(gè)樣本/測試2.?

HIV-1

CCR5

Tropism

Test

(V3)（BritishColumbiaCenterforExcellenceinHIV/AIDS，Canada）輔助受體易感性基因的耐藥突變3.?

HIV-1

Co-receptor

Tropism

withReflextoUltradeepSequencing（QuestDiagnostics，USA）輔助受體易感性基因的耐藥突變HIV耐藥性NGS分析的方法學(xué)特性??

對non-CCR5tropism的預(yù)測準(zhǔn)確性與表現(xiàn)型金標(biāo)準(zhǔn)（Trofile；MonogramBiosciences，USA）一致??

對少見的CXCR4-tropic變異檢出靈敏度高于Sanger測序??

NGS檢出低豐度HIV-1耐藥突變的臨床意義還有待進(jìn)一步研究CMV??

CMVDRM的檢出具有重要臨床意義，尤其是對于移植受體–?

群體耐藥性：實(shí)體腫瘤移植受體5%-12.5%；骨髓干細(xì)胞移植受體2%-5%–?

耐藥性可使移植存活率降低、死亡率升高??

CMVDRM的及時(shí)檢出可指導(dǎo)治療，快速清除病毒CMV耐藥性的NGS分析??

目前已知的CMVDRM存在于兩個(gè)基因–?DNA多聚酶UL54–?磷酸轉(zhuǎn)移酶UL97??

NGS檢出CMVDRM的錯(cuò)誤率0.189%??

發(fā)展方向：–?其他少見耐藥突變的臨床意義還需大樣本量臨床試驗(yàn)評估–?NGS可檢出新的CMVDRM，擴(kuò)增數(shù)據(jù)庫–?自動(dòng)化分析工具臨床樣本的病毒鑒定及分型??

NGS能夠檢出一般分子檢測陽性的病毒??

NGS能檢出常規(guī)方法不能檢出的可疑病毒性病原體–?

難以培養(yǎng)或傳統(tǒng)分子技術(shù)不能檢出的病毒–?

克隆后測序太費(fèi)時(shí)–?

靶向已知病毒保守區(qū)的芯片不能檢出新的病原體??

可直接應(yīng)用于臨床樣本的病毒鑒定及分型??

NGS高效、靈敏、無偏差檢測臨床樣本中的病毒–?

不能用特異性引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增-富集病毒RNA/DNA–?

沒有新病毒的參考序列-全新組裝病毒基因組病毒顆粒的純化和富集??

培養(yǎng)、超速離心、密度梯度離心??

核酸酶處理去除宿主核酸，但保留病毒顆粒??

滾動(dòng)環(huán)形擴(kuò)增病毒基因組??

酶切并連結(jié)配體后進(jìn)行PCR擴(kuò)增??

用宿主核酸特異寡核苷酸干擾轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增??

用反義寡核苷酸雜交捕獲病毒核酸??

利用信息學(xué)工具濾除人和微生物序列（病毒序列<初始讀數(shù)的1%）全新組裝病毒基因組??

提取總核酸（RNA和DNA）??

隨機(jī)引物??

組裝要求的測序長度和深度決定測序平臺(tái)的選擇??

生物信息學(xué)工具的選擇–?

沒有可使用的公共數(shù)據(jù)庫–?

通過序列重疊組裝成序列集，然后基因組–?

長讀數(shù)的連鎖信息有利于組裝–?

重復(fù)序列干擾組裝HPV分型的NGS與qPCR方法比較NGSqPCR??

靶向：7種亞型??

報(bào)告時(shí)間：2天??

價(jià)廉??

完整：179種亞型??

報(bào)告時(shí)間：4-7天??

測序方法決定成本??

分析需要生物信息學(xué)專家??

結(jié)果解釋直接??

相對直接的臨床應(yīng)用??

臨床應(yīng)用需要大量試驗(yàn)、生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)開發(fā)工作及質(zhì)量控制感染性臨床樣本病毒性病原體的NGS鑒定Goldberg

B，mBio.

2015;6(6):e01888‐15.NGS在臨床細(xì)菌學(xué)及真菌學(xué)的應(yīng)用??

病原體鑒定–?

靶向測序：靶向特異性PCR擴(kuò)增、富集目標(biāo)基因組區(qū)域、選擇性測序–?

全基因組測序：宏基因組鳥槍法測序及全基因組鳥槍法測序??

病原體特性的基因分析–?

毒力因子鑒定–?

菌株分型–?

抗生素耐藥標(biāo)志物的基因分析病原體鑒定法則（Kochpostulates）??

傳統(tǒng)病原體確定遵從柯赫法則1.?

病原體存在于患病宿主，但不存在于健康對照個(gè)體；2.?

能離體培養(yǎng)；3.?

當(dāng)健康個(gè)體注入培養(yǎng)物能復(fù)制該疾病；4.?

并能在復(fù)制疾病的個(gè)體中重新分離到相同病原體。??

傳統(tǒng)法則的修訂：–?

對于難以培養(yǎng)的病原體，不要求分離培養(yǎng)–?

需要嚴(yán)格建立微生物與疾病的相關(guān)性??

免疫學(xué)或分子生物學(xué)方法證明病原體在感染組織的存在??

建立病原體拷貝數(shù)與疾病嚴(yán)重度的相關(guān)性??

顯示從急性到恢復(fù)期樣本的血清轉(zhuǎn)換傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定流程鑒定疑似菌測定分型培養(yǎng)基培養(yǎng)不同樣本Hasman

h

et

al.

J.

Clin.

Microbiol.

2014;52:139-146培養(yǎng)分離物的全基因組測序流程鑒定疑似菌測定及分型培養(yǎng)基培養(yǎng)Hasman

h

et

al.

J.

Clin.

Microbiol.

2014;52:139-146臨床樣本直接全基因組測序流程鑒定、疑似菌測定及分型Hasman

h

et

al.

J.

Clin.

Microbiol.

2014;52:139-146靶向測序或全基因測序鑒定??

傳統(tǒng)微生物學(xué)方法–?分離培養(yǎng)，生化鑒定，MALD-TOF–?價(jià)廉、快速–?適合于一線診斷學(xué)??

NGS用于臨床樣本直接微生物鑒定–?rRNA測序的靶向測序–?全基因組測序（GWS）??

NGS用于病原特性的基因分析16SrRNA測序??

rRNA的Sanger測序常規(guī)用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌及真菌的鑒定??

rRNA的NGS是研究微生物組學(xué)的基礎(chǔ)??

影響鑒定和分型的因素–?

測序讀數(shù)的長讀、數(shù)量及質(zhì)量–?

試劑的微生物污染信息學(xué)是解讀NGSrRNA序列的關(guān)鍵??

數(shù)據(jù)分析工具：錯(cuò)誤更正、剔除擴(kuò)增來源的嵌合序列??

專用數(shù)據(jù)分析流程：QIIME、RDP、mothur??

分析流程標(biāo)準(zhǔn)化??

參考數(shù)據(jù)庫的范圍和完整性??

現(xiàn)有16SrRNA序列數(shù)據(jù)庫：–?

SI

LVA

含有>3百萬小亞組和>25萬大亞組的細(xì)菌rRNA基因序列

http://www.arb-silva.de/documentation–?

Greengenes含有>40萬16SrRNA

序列/downloads/Food/FoodScienceResearch/WholeGenomeSequencingProgramWGS/ucm403550.htm/Food/FoodScienceResearch/WholeGenomeSequencingProgramWGS/ucm403550.htm16SrRNA靶向NGS測序的臨床應(yīng)用??

鑒定混合感染，特別是不能培養(yǎng)或未存活微生物??

直接應(yīng)用臨床樣本的微生物鑒定：腦膿腫物、淋巴結(jié)活檢組織、囊性纖維化液、乳突膿腫物??

研究疾病中菌群基因多樣性及細(xì)菌組學(xué)的改變?nèi)蚪M測序（WGS）??

可進(jìn)行更細(xì)致的功能和分類學(xué)研究??

用于常規(guī)方法失敗的病原微生物鑒定??

感染病原體不明的臨床樣本直接測序分析48小時(shí)內(nèi)從腦脊液檢出鉤端螺旋體序列WGS的臨床應(yīng)用難點(diǎn)??

序列分析更具挑戰(zhàn)性–?

濾除人類序列和錯(cuò)誤序列–?

對比參考數(shù)據(jù)庫或重新組裝–?

數(shù)據(jù)分析工具??

RAST

server(）??

SURPIpipeline–?

分類及功能解析??

人類細(xì)菌宏基因組學(xué)項(xiàng)目：HMP、MHT??

方法學(xué)特性：符合性

88.5%，速度慢、費(fèi)用昂貴應(yīng)用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室??

對實(shí)驗(yàn)室一天分離的每一個(gè)微生物進(jìn)行基因組測序（130個(gè)樣本）??

其中115個(gè)樣本與常規(guī)方法的鑒定結(jié)果一致（88.5%）??

運(yùn)行時(shí)間需要縮短??

試劑成本需要降低??

需要建立參考數(shù)據(jù)庫以保障上傳的是高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)Long

SW,

et

al.

Journal

of

Clinical

Microbiology.

2013;51(4)

1272‐1277.CNS感染的檢測??

神經(jīng)系統(tǒng)鉤端螺旋體的診斷??

3/10大腦和脊髓活檢及神經(jīng)系統(tǒng)問題表明可能感染的患者，常規(guī)臨床和微生物學(xué)檢查為陰性或無結(jié)果??

未預(yù)測的人皰疹病毒1型檢測，同時(shí)尋找RNA病原體??

神經(jīng)系統(tǒng)侵入性的星狀病毒感染的診斷Wilson

MR,

The

New

England

journal

of

medicine.

2014;370(25):2408‐2417.Salzberg

SL,

Neurology?

Neuroimmunology

&

Neuroinflammation.

2016;3(4):e251Perlejewski

K,

J

Virol

Methods

2015;226:1–6.Naccache

SN,

Clinical

Infectious

Diseases

2015;

60(6):919‐92血源性病原體檢測Susilawati,

T

et

al..

Eur

J

Clin

Microbiol

Infect

Dis

(2016)

35:

113血源性病原體檢測??

評估3個(gè)二代測序平臺(tái)檢測血液中低水平病原體（病毒或細(xì)菌）的能力??

Roche‐454

Titanium

平臺(tái)能夠檢測登革病毒的最低濃度為1x102.5

pfu/mL,最多相當(dāng)于大約5.4x104基因組拷貝/mL??

Ion

Torrent

PGMandIlluminaMiSeq平臺(tái)能夠檢測的病毒最低濃度為1x104基因組拷貝/mL??

MiSeq平臺(tái)能夠直接從樣本中鑒定炭疽芽孢桿菌來源Frey

KG,

BMC

Genomics.

2014;15:96.血源性病原體檢測??

利用MinION納米小孔測序從4個(gè)人血液樣本中通過無偏差宏基因組檢測區(qū)曲病毒，埃博拉病毒，及丙肝病毒??

報(bào)告時(shí)間在6小時(shí)以內(nèi)??

利用時(shí)間表以適應(yīng)實(shí)際的臨床和公共健康診斷Greninger

AL,

Genome

Medicine.

2015;7:99.在臨床真菌診斷中的應(yīng)用??

通過真菌核小體基因的ITS區(qū)域擴(kuò)增物的靶向測序獲得真菌組學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)??

真菌分離物的核小體ITS區(qū)域擴(kuò)增物測序及全基因組測序用于基因研究和作為分類學(xué)鑒定的工具??

超越IlluminaNextSeqandHiSeq的真菌組學(xué)的全基因組測序用于診斷Zoll

J，

Current

Fungal

Infection

Reports.

2016;10:37‐42.真菌感染的診斷??

引物靶向內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔??

利用DNA元條碼標(biāo)記物定義真菌的多樣性和構(gòu)成真菌鑒定的NGS分析Universal

sequenceITS‐1/ITS‐2

PrimersIllumina

adapter真菌鑒定的NGS分析性能評估??

用二代測序檢測61個(gè)預(yù)先用培養(yǎng)鑒定真菌狀況的培養(yǎng)分離樣本和15個(gè)預(yù)先用一代測序鑒定真菌狀況的FFPE包埋樣本??

被測樣本結(jié)果顯示47%(36/76)的一致性真菌鑒定的NGS分析性能評估4個(gè)結(jié)果不符的病例Epicoccumnigrumand

Aspergilusniger非常接近Scedosporiumapiospermum是Pseudoallescheriaboydii的無性形式真菌鑒定的NGS分析結(jié)論??

檢測真菌的其他區(qū)域，如D1/D2，beta‐tubulinandcalmodulin的序列可能提高檢測的分辨率和準(zhǔn)確性??

專門的數(shù)據(jù)庫也可能有助于提高分型??

為了優(yōu)化分析應(yīng)用于臨床需要更多的工作病原體特性的基因分析??

抗生素耐藥性的基因分析??

毒力因子鑒定??

菌株分型抗生素耐藥性的基因分析??

常規(guī)抗生素耐藥性分析-?

表型檢測：部分，已標(biāo)準(zhǔn)化，但有些較費(fèi)時(shí)（結(jié)核桿菌）-?

分子檢測：部分，靈敏度和速度提高??

WGS為基礎(chǔ)的耐藥性分析優(yōu)勢-?

流程簡化：同時(shí)進(jìn)行多個(gè)耐藥基因檢測、同時(shí)進(jìn)行分型和毒力基因檢測-?

發(fā)現(xiàn)新的耐藥機(jī)制，擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫-?

ResFinder、ARG-ANNOTNGS耐藥性分析的局限性??

NGS不能定量分析抗菌藥物的敏感性，耐藥分析陽性的必須進(jìn)行表型分析??

必須依賴已知基因特點(diǎn)和數(shù)據(jù)庫預(yù)測耐藥性??

不能完全替代表型和分子檢測??

適用范圍：生長緩慢、多重耐藥、表型分析復(fù)雜/數(shù)量有限、分子檢測復(fù)雜（基因數(shù)量和區(qū)域太大）NGS應(yīng)用于菌株分型??

菌株分型常用于醫(yī)感爆發(fā)??

傳統(tǒng)的菌株分型方法–?

片段分析法-脈沖凝膠電泳–?

測序技術(shù)-多位點(diǎn)測序分型–?

能分型的微生物數(shù)量有限，且局限于參考實(shí)驗(yàn)室和公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室??

WGS分析微生物SNP–?

可在爆發(fā)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行–?

分辨率比現(xiàn)有方法高–?

成本效益比有待研究NGS的臨床應(yīng)用要求??

方法學(xué)驗(yàn)證及臨床驗(yàn)證??

監(jiān)測和記錄質(zhì)量控制和能力驗(yàn)證試驗(yàn)??

NGS的臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)-

AmericanCollegeforMedicalGeneticsandGenomic