實驗六多糖的制備與檢測

實驗六多糖的制備與檢測實驗申請實驗項目：從植物種子中分離制備多糖（主要為0葡聚糖）實驗材料：大麥種子實驗器材：（1）萬能粉碎機(jī) （2）恒溫干燥箱（3）電子天平 （ 4）恒溫水浴鍋（5）集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（6）離心機(jī) （ 7）分光光度計（配套比色皿）試劑：淀粉酶、蛋白酶、無水乙醇，Na2CO3,HC1（調(diào)pH用），蔥酮試劑,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（100Mg/mL）。耗材及輔助器材：（1）溫度計（2） 量筒25mlX1,（3） 試管25mlX8（4）pH試紙（5）燒杯200mlX5（6） 50ml容量瓶X5（7） 多種規(guī)格移液管參考文獻(xiàn)：蔣本國，王艷穎，李春斌，劉秋.生物化學(xué)實驗.大連民族學(xué)院.2010.7王鏡巖，朱圣庚等，生物化學(xué)教程，高等教育出版社，2008.6.譚天偉.生物分離技術(shù).北京：化學(xué)工業(yè)出版社.，2007.7劉寶全.生化分離工程實驗講義（內(nèi)部試用版）.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院.2011.6實驗步驟：滅內(nèi)源酶活:將大麥磨成粉（40目）,85r烘30min。2?除淀粉:按大麥粉：水等于1：6加入水,90r糊化30min,然后降溫至70r,調(diào)pH=4.5加2ml淀粉酶處理2h。3去蛋白質(zhì):用胰蛋白酶在37r下pH=7.5處理上述溶液2h。（1000ml去淀粉液加蛋白酶0.5m）4去酶:在90r,水浴10min。5去纖維素:將上述溶液用8000min的離心速度離心10min,（所得上清液為含有0-葡聚多糖、氨基酸或寡肽、單糖、低聚糖、水溶性維生素的溶液。）濃縮、除雜:由于多糖屬大分子物質(zhì),而氨基酸、寡肽、單糖、低聚糖等屬小分子物質(zhì),用超濾法除去,同時也可用作濃縮。將清液用截留分子量為10000的膜，壓力1.2?1.4MPa，溫度30°C,濃縮。分離純化:用飽和硫酸銨溶液將多糖沉淀,然后用無水熱乙醇洗滌,再離心收集,丙酮洗滌,真空干燥,得粗產(chǎn)品0-葡聚糖。蒽酮法檢測。（方法見第5頁）工藝流程圖：實驗記錄操作結(jié)果及記錄：操作結(jié)果及記錄：(1)滅內(nèi)源酶活:將大麥磨成粉(40目)，85°C烘1h。1F⑵除淀粉:將沉淀按1：6比例溶于水,90°C處理，糊化30min，然后降溫至60C，pH值4.0~4.5用糖化酶處理2h。100g大麥粉糊化后加入15ml糖化酶.(3)去蛋白質(zhì):用胰蛋白酶在37C下處理上述溶液2h。(1000ml去淀粉液加蛋白酶0.5m)去酶:在90C，水浴10min。去纖維素:將上述溶液用6000min的離心速度離心10min,(所得上清液為含有0-葡聚多糖、氨基酸或寡肽、單糖、低聚糖、水溶性維生素的溶液。)濃縮、除雜:由于多糖屬大分子物質(zhì),而氨基酸、寡肽、單糖、低聚糖等屬小分子物質(zhì),用超濾法除去,同時也可用作濃縮。將清液用截留分子量為10000的膜，壓力1.2~1.4MPa,溫度30°C,濃縮。分離純化:用飽和硫酸銨溶液將多糖沉淀,然后用無水熱乙醇洗滌,再離心收集,丙酮洗滌，真空干燥，得粗產(chǎn)品0-葡聚糖。（8）蔥酮法檢測。蒽酮比色法：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100卩g/mL）：準(zhǔn)確稱取100mg分析純無水葡萄糖，溶于蒸餾水并定容至100mL，使用時再稀釋10倍（100pg/mL）。蒽酮試劑：稱取1.0g蒽酮，溶于80%濃硫酸（將98%濃硫酸稀釋，把濃硫酸緩緩加入到蒸餾水中）1000mL中，冷卻至室溫，貯于具塞棕色瓶內(nèi)。稱取樣品粉末（5?100mg）,放入大試管中，加入15mL蒸餾水,在沸水浴中煮沸20min，取出冷卻，過濾入100mL容量瓶中，用蒸餾水沖洗殘渣數(shù)次，定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6支大試管，從0?5分別編號，按表24-1加入各試劑。表24-1蒽酮法測可溶性糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量試劑管號012345100pg/mL葡萄糖溶液（ml）00.20.40.60.81.0蒸餾水（ml）1.00.80.60.40.20蔥酮試劑（ml）5.05.05.05.05.05.0葡萄糖量（pg）020406080100將各管快速搖動混勻后，在沸水浴中煮10min，取出冷卻，在620nm波長下，用空白調(diào)零測定光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，含葡萄糖量（pg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測定取待測樣品提取液1.0mL加蒽酮試劑5mL，同以上操作顯色測定光密度。重復(fù)3次。實驗結(jié)果與分析實驗記錄：1、 實驗原料質(zhì)量：10.085g 實驗pH=6.0-6.52、 提取固液比為：1:63、最后一次離心所得液體的體積：V=134ml4、產(chǎn)品OD值測定：稀釋倍數(shù)1001000OD值0.8850.120根據(jù)葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線：0.300 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.249x+0.003OD值為0.885時，y=0.249x+0.003=0.249x0.885+0.003=0.2234(mg/ml)OD值為0.120時，y=0.249x+0.003=0.249x0.120+0.003=0.0329(mg/ml)①根據(jù)稀釋100被數(shù)據(jù)計算：

C產(chǎn)品=C測X稀釋倍數(shù)=0.2234X100=22.34(mg/ml)m(產(chǎn)品X100)C產(chǎn)品XV=22.34X134=2993.56mgm(產(chǎn)品X100)②根據(jù)稀釋1000被數(shù)據(jù)計算：C產(chǎn)品=C測x稀釋倍數(shù)=0.0329x1000=32.9(mg/ml)m(產(chǎn)品”)=C產(chǎn)品XV=32.9x134=4408.6mgm="（產(chǎn)品100）（產(chǎn)品產(chǎn)品21000)=2993.5+4408.62=3701.05mg所以產(chǎn)品的粗提得率為：n=m^品x100%= 3701.05x100%=36.70%m原料 10.085x1000實驗結(jié)果分析：1、在本次實驗的操作中我們只進(jìn)行了淀粉水解與酶失活處理，所以所提取出的多糖為粗提產(chǎn)品，純度不高，含有大量的雜質(zhì)。2、 實驗所得產(chǎn)品的粗提率為36.70%。根據(jù)文獻(xiàn)記載偏高，也說明了所提物質(zhì)中有大量雜質(zhì)，初步分析為一些為除去的淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、水溶性維生素等成分。3、 本次試驗中添加的淀粉酶用量為嚴(yán)格按照比例添加，會導(dǎo)致淀粉清除不徹底，影響實驗結(jié)果。4、本實驗中應(yīng)注意三次離心的目標(biāo)產(chǎn)物與離心的目的：次序目標(biāo)產(chǎn)物目的第1次離心上清液除去不溶于水的物質(zhì)第2次離心沉淀醇沉的多糖物質(zhì)第3次離心上清液除去不溶于水的雜質(zhì)注意：在實驗過程中應(yīng)記錄第一次離心后所得上清液的體積，然后取取部分液體繼續(xù)進(jìn)行以下步驟，這樣既可以減少離心的工作量，同時又可以避免多次離心所帶來的誤差。實驗原理：1、大麥?zhǔn)俏覈爬系乃幨臣嬗弥参铩Ｎ覈篼溬Y源豐富,但70%以上的大麥和大麥麩皮用作飼料,大麥資源利用附加值低。研究表明,大麥具有調(diào)血脂、抗衰老、降血糖等多種藥理活性。多糖作為一種重要的生命物質(zhì),具有多種生物活性。本論文以大麥和大麥麩皮為原料,研究大麥多糖和大麥麩皮多糖的提取、抗氧化活性和體外抑瘤作用,為功能性食品和藥品的研究開發(fā)提供依據(jù),為大麥和大麥麩皮的高效利用提供新途徑。在大麥胚乳細(xì)胞壁(75%)和糊粉層細(xì)胞壁(26%)中含有3%?5%的0-葡聚糖，有些品系可高達(dá)12%0-葡聚糖是一種重要的非淀粉多糖，其結(jié)構(gòu)由均一的D-吡喃葡萄糖(Glcp)單位通過0-(1-3)和0-(1-4)鍵連接而成,其中大約包括58%~72%的由0-(1-3)鍵連接的纖維三糖和20%?34%的纖維四糖單位。0-(1-3)鍵往往單個存在，0-(1-4)鍵則可2個、3個連續(xù)存在，最大可以達(dá)到14個葡萄糖單位［3］。這些結(jié)構(gòu)特點，使得0-葡聚糖表現(xiàn)出可溶性、高黏性、凝膠形成等多種功能特性，因此0-葡聚糖不僅具有降低膽固醇、降血糖、改善腸道功能等保健作用［4，5］;而且還可以作為增稠劑、凝膠劑等應(yīng)用于食品工業(yè)中，是一種重要的可溶性膳食纖維。2、蒽酮法測定可溶性糖原理:糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量測定。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖含量，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等(因為反應(yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng))，所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價值。但在測定水溶性碳水化合物時，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應(yīng)液中，不然會因為細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測定誤差。此外不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。糖類與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為620nm，故在此波長下進(jìn)行比色。實驗材料補充1、測定多糖含量的其他方法苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。（1）此法簡單、快速、靈敏、重復(fù)性好，對每種糖僅制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，顏色持久。（2）制作標(biāo)準(zhǔn)線宜用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)多糖，如用葡萄糖，應(yīng)以校正系數(shù)0.9校正“g數(shù)。（3）對雜多糖，分析結(jié)果可根據(jù)各單糖的組成比及主要組分單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的校正系數(shù)加以校正計算。（4）測定時根據(jù)光密度值確定取樣的量。光密度值最好在0.1——0.3之間。比如：小于0.1之下可以考慮取樣品時取2克，仍取0.2ml樣品液，如大于0.3可以減半取0.1ml的樣品液測定。2、硫酸苯酚法與硫酸蒽酮法測多糖對比：苯酚法測定可溶性糖植物體內(nèi)的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯酚法測定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10—100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160min以上。蒽酮法測定可溶性糖糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等，因為反應(yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)X所以用愈酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下，用意酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價值。但在測定水溶性碳水化合物時，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應(yīng)液中，不然會因為細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與意酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。糖類與蔥酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為630nm,故在此波長下進(jìn)行比色?？偨Y(jié)：硫酸苯酚法不同單糖顯色后產(chǎn)生較好吸收峰,穩(wěn)定性也很好,但不同時間不同操作人員操作時所測數(shù)據(jù)有差異,建議在使用硫酸苯酚法測定多糖含量時,需同時用對照品作對照,并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)計算多糖含量,避免直接由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù),使得不同時間所測數(shù)據(jù)產(chǎn)生較大差異。硫酸蒽酮法穩(wěn)定性較差,線性關(guān)系不理想,重現(xiàn)性、穩(wěn)定性所測數(shù)據(jù)差異較大,并且蒽酮試液穩(wěn)定性也較差,需臨時配制,特別是加熱后最大吸收峰偏移較大,建議在進(jìn)行多糖含量測定時不宜采用此法。3、 多糖相關(guān)介紹多糖(polysacharides,PS)，又稱多聚糖，是由10個以上的單糖通過苷鍵連接而成的,具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布于自然界高等植物、藻類、微生物(細(xì)菌和真菌)與動物體內(nèi)。20世紀(jì)60年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的、多方面的生物活性和功能：(1)多糖可作為廣譜免疫促進(jìn)劑，具有免疫調(diào)節(jié)功能，能治療風(fēng)濕病、慢性病毒性肝炎、癌癥等免疫系統(tǒng)疾病，甚至能抗AIDS病毒。如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強(qiáng)人體免疫功能。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強(qiáng)免疫功能等生物學(xué)作用，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強(qiáng)作用，動物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能。(3)多糖能控制細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能。另外，多糖作為藥物，其毒性極小，因而多糖的研究已引起人們極大的興趣。由于多糖具有的生物活性與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，而多糖的結(jié)構(gòu)又是相當(dāng)復(fù)雜的，所以在這一領(lǐng)域的研究相對緩慢。但人們在多糖的分離提取與純化方面已做出了不少工作。4、 多糖的提?。簾崴岱ㄎ⒉ㄝo助提取法超聲輔助法索氏提取法醇提法其它方法多糖的提取方法還有稀堿液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀堿條件下，易使多糖發(fā)生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發(fā)生水解而使多糖的提取率減少，因而很多試驗中避免采用稀堿液浸提法和稀酸液浸提法。多糖的分析鑒定5、多糖鑒定含量的測定測定方法：硫酸－苯酚法、硫酸－蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、yaphe法、薄層色譜法、酶法、原子吸收法、HPLC法、凝膠電泳法、親和電泳法、連續(xù)流動分析法檢測法、次亞碘酸鹽定量法、蒽酮－硫酸法（總糖）、DNS法（還原法）、磷鉬比色法、鄰鉀苯胺比色法等.每種方法只對某些多糖的測量效果好.比色法、分光光度法、離子交換色譜法、酶法和電泳法等可同時用于多糖的定性定量分析.純度鑒定多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分.多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HLPC法等.現(xiàn)在應(yīng)用較多的是HLPC法，旋光度測定也是純度測定的一種方法.分子量的測定多糖分子量的測定是研究多糖性質(zhì)的一項重要工作.常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC法［47］、MALDI－TOF－MS法.結(jié)構(gòu)測定5.4．1多糖一級結(jié)構(gòu)測定多糖的一級結(jié)構(gòu)分析，主要是分析組成多糖的單糖類型、數(shù)目、連接方式及苷建構(gòu)型.常用化學(xué)法和儀器分析法.多糖組分與分子比例測定法：部分酸解法、完全酶解法、色譜法；吡喃、呋喃環(huán)形式結(jié)構(gòu)的分析：紅外光譜；連接次序：選擇性光譜法糖苷鍵順序水解、核磁共振；a-p—異頭異構(gòu)體：糖苷酶水解、核磁共振；羥基被取代情況：甲基化反應(yīng)、氣相色譜、過碘酸氧化、Smith降解法和測硫酸基法（terho法）、核磁共振、質(zhì)譜法；糖鏈、肽鏈連接方式：單糖與氨基酸組成、稀堿水解法、肼解反應(yīng)；多糖結(jié)構(gòu)的分析方法很多，迄今沒有一種方法可以單獨完成多糖結(jié)構(gòu)的分析.儀器分析與化學(xué)方法相結(jié)合是常用的多糖結(jié)構(gòu)測定方法.5.4．2多糖高級結(jié)構(gòu)測定目前研究多糖的二級結(jié)構(gòu)常用的手段是NMR技術(shù)，如2D—NMR，C譜，通用的方法是將現(xiàn)代NMR技術(shù)與理論計算