2023學(xué)年完整公開課版核酸染色

病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色核酸-染色

一、酸水解-無色品紅法(根據(jù)

Feulgen和

Rossenbeck)

(一)試劑配制1.0.5%的火棉膠液：火棉膠片0.5g、無水乙醇50ml、乙醚50ml先把乙醇與乙醚混合,再加入火棉膠片放置1天,期間輕搖數(shù)次,使其充分溶解2.lmol/L鹽酸3.無色品紅液：堿性品紅1g、蒸餾水200ml、1mol/L鹽酸20ml、偏重亞硫酸鈉1-1.5g、活性炭2g4.0.5%的偏重亞硫酸鈉5.0.1%的固綠一、酸水解-無色品紅法

無色品紅液配制方法:（1）取一個(gè)潔凈的500ml三角燒瓶盛蒸餾水200ml,在電爐上煮沸后取出。（2）加入堿性品紅1g于煮沸后的蒸餾水內(nèi),輕輕搖動(dòng)數(shù)分鐘使堿性品紅徹底溶解,此時(shí)溶液為深紅色。（3）待冷卻至約50℃時(shí),過濾至另一個(gè)潔凈三角燒瓶?jī)?nèi).（4）加入1mol/L鹽酸20ml,稍搖動(dòng)使混勻.（5）再待冷至25℃左右,加入偏重亞硫酸鈉,用塞塞緊,并稍搖動(dòng)使其溶解,這時(shí)堿性的品紅的顏色開始變淡.（6）置于暗處約24小時(shí),此時(shí)溶液應(yīng)呈淡紅色或淡稻草黃色。（7）加入活性炭2g,輕輕搖動(dòng)1-2分鐘后靜置1小時(shí),用雙層濾紙?jiān)龠^濾到另一個(gè)棕色小口砂塞內(nèi),此時(shí)溶液應(yīng)完全無色,故稱無色品紅,又稱

Schift試劑.（8）置4℃的冰箱保存持用,用前取出恢復(fù)至室溫.一、酸水解-無色品紅法

(二)染色步驟1.組織用

Camoy液固定2~6小時(shí),經(jīng)95%的乙醇開始脫水包埋。2.切片厚5μm,常規(guī)脫蠟至無水乙醇。3.新的無水乙醇浸洗2次,每次1分鐘。4.切片轉(zhuǎn)入0.5%的火棉膠浸1分鐘,取出后稍晾干。5.80%的乙醇10分鐘。6.蒸餾水稍洗。7.室溫1mol/L鹽酸稍洗。8.預(yù)熱至60℃的1mol/L鹽酸在60℃水浴中水解8分鐘。9.室溫1mol/L鹽酸稍洗。10.蒸餾水稍洗。一、酸水解-無色品紅法

(二)染色步驟11.無色品紅液(加蓋)于室溫下置暗處作用60~90分鐘。12.不經(jīng)水洗,直接滴入0.5%的偏重亞硫酸鈉浸洗2次,每次2分鐘。13.流水沖洗5分鐘。14.0.1%的固綠復(fù)染1秒。15.稍水洗。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。16.常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。一、酸水解-無色品紅法

（三）結(jié)果脫氧核糖核酸(DNA）呈紅紫色,胞質(zhì)和其他成分呈淡綠色。一、酸水解-無色品紅法

(四)對(duì)照方法1.取另一連續(xù)切片同時(shí)操作至第6步蒸餾水洗后,用蒸餾水代替第8步的1mol/L鹽酸水解后入無色品紅作用液,以后步驟相同。2.另一連續(xù)切片于脫蠟后,先用脫氧核糖核酸酶(

deoxyribonuclease)lmg/ml,于37℃的溫箱內(nèi)消化2小時(shí),再按上法開始進(jìn)行染色。經(jīng)上述方法之一處理后的切片,染色應(yīng)為陰性。

一、酸水解-無色品紅法

(五)注意事項(xiàng)1.一般固定劑都適用于這一反應(yīng),但用

Bouin固定的組織,會(huì)引起過度水解,故不宜采用。2.脫蠟后切片入火棉膠液處理,目的是防止切片在60℃的1mol/L鹽酸水解過程中脫落,如切片粘貼牢固,第3~5步可省去。3.在60℃的1mol/L鹽酸水解前后均經(jīng)1次室溫的1mol/L鹽酸稍洗，,目的是使組織不因驟變太大而松脫。4.如染片用作顯微分光光度計(jì)定量,應(yīng)省去固綠復(fù)染。5.置于1mol/l鹽酸水解時(shí)的溫度很重要,以60℃為合適,水解時(shí)間視所用的固定液而不同,水解時(shí)間不足或過長(zhǎng)都會(huì)影響染色效果。

一、酸水解-無色品紅法

置于60℃1mol/L鹽酸水解時(shí)間固定液所需水解時(shí)間（分鐘）固定液所需水解時(shí)間（分鐘）Carnoy8Zenker510%甲醛8Helly8FAA7Bouin不宜(六)染色機(jī)制脫氧核糖核酸通過用鹽酸水解,第一步是從DNA上的脫氧核糖核酸殘基分解出堿基,第二步是在脫氧核糖殘基的第1~4位碳鍵處打斷糖苷鍵而游離出醛基,后者與無色品紅液形成紅紫色的復(fù)合物把DNA顯示出來。(七)應(yīng)用脫氧核糖核酸是染色體的主要化學(xué)成分,在細(xì)胞增生的病變中(腫瘤、肉芽組織)、核肥大和核深染,是由于DNA合成增加,酸水解-無色品紅法染色可清晰地顯示DNA的量及其分布(如聚集于核膜、核仁四周及散在核內(nèi))。一、酸水解-無色品紅法

二、甲基綠派洛寧法(改良Cook)（一）試劑配制1.0.2mol/L醋酸鹽緩沖液(pH4.8)2.2%的甲基綠水溶液：甲基綠2g、蒸餾水100ml3.1%的派洛寧G4.甲基綠派洛寧染液：2%的甲基綠(已提純)5ml、1%的派洛寧G5ml、蒸餾水10ml、0.2mol/L的醋酸鹽緩沖液(pH4.8)16ml依次混合,輕輕搖動(dòng)使完全溶解后,置4℃的冰箱保存5.正丁醇二、甲基綠派洛寧法(改良Cook)（二）染色步驟1.組織固定于

Carnoy液3-5小時(shí),經(jīng)95%的乙醇開始脫水包理。2.切片厚5μm,常現(xiàn)脫蠟至水,蒸餾水再稍洗。3.甲基綠派洛寧染液于室溫浸染50-60分鐘4.取出切片,用濾紙抹干切片周圍染液5.正丁醇浸洗3次,每次2~3分鐘6.二甲苯透明,中性樹膠封固。二、甲基綠派洛寧法(改良Cook)(三)結(jié)果存在于胞質(zhì)和核仁內(nèi)的核糖核酸呈紅紫色,胞核染色質(zhì)內(nèi)的脫氧核糖核酸呈綠色或藍(lán)綠色。漿細(xì)胞胞質(zhì)也呈較深的紅紫色。二、甲基綠派洛寧法(改良Cook)(四)對(duì)照方法取另一連續(xù)切片用核糖核酸酶(ribonuclease)lmg/ml于37℃的溫箱內(nèi)消化3小時(shí),蒸餾水洗后置入甲基綠派洛寧染液內(nèi)染色，結(jié)果核糖核酸為陰性。切片在10%的高氯酸(perchloricacid)于4℃處理12~18小時(shí),水洗后用1%的碳酸的水溶液中和2分鐘,流水沖洗5分鐘,再用蒸餾水洗后置入甲基綠派洛寧染液內(nèi)染色,結(jié)果核糖核酸應(yīng)為陰性。二、甲基綠派洛寧法(改良Cook)(六)染色機(jī)制對(duì)此法的染色機(jī)制,目前了解得還不夠清楚,一般可從以下兩方面理解1.電離作用脫氧核糖核酸和核糖核酸都既有磷酸基,又有堿基,故為兩性電解質(zhì)。在一定的條件下,可以電離而帶電荷,因此,都有一定的等電點(diǎn)。甲基綠和派洛寧在水中電離后,都產(chǎn)生帶陽(yáng)電荷的離子。甲基綠電離后,在五價(jià)氮處產(chǎn)生兩個(gè)正電荷,堿性較強(qiáng)。派洛寧電離后僅產(chǎn)生一個(gè)正電荷,堿性較甲基綠弱,在染色時(shí)兩者進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng),堿性較強(qiáng)的甲基綠就與胞核(等電點(diǎn)pH3.8-4.2)進(jìn)行極性吸著而結(jié)合,堿性較弱的派洛寧與胞質(zhì)(等電點(diǎn)phH4.6~5.2)吸附結(jié)合。2.聚合作用甲基綠著染脫氧核糖核酸呈綠色,派洛寧著染核糖核酸呈紅色,這不是反映兩種核酸間在化學(xué)上的不同,而是反映兩種核酸的聚合狀態(tài)。甲基綠與聚合高的脫氧核糖核酸有親和力而結(jié)合,派洛寧易與聚合低的核糖核酸有親和力而結(jié)合。因此,甲基綠選染脫氧核糖核酸,而派洛寧選染核糖核酸。二、甲基綠派