醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)筆記

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（medicalmolecularbiology）：醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重要從分子水平研究人體在正常和疾病狀態(tài)下的生命活動(dòng)及其規(guī)律的一門學(xué)科；重要研究人體生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能、互相作用及其同疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。第一章基因（gene）的概念及其發(fā)展1、基因的物質(zhì)載體是染色體2、基因的生化作用本質(zhì)是控制酶的合成3、DNA是重要的遺傳物質(zhì)4、基因的概念：基因(gene)是核酸分子中儲(chǔ)存遺傳信息的遺傳單位，是指儲(chǔ)存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息及表達(dá)這些信息所必需的所有核苷酸序列.第二節(jié)基因的結(jié)構(gòu)1、原核生物：類核2、真核生物：染色質(zhì)，基本結(jié)構(gòu)單位——核小體第三節(jié)基因的功能1、功能：=1\*GB3①運(yùn)用四種堿基（A、T、G、C）不同排列負(fù)荷遺傳信息；=2\*GB3②通過復(fù)制將遺傳信息傳遞給子代細(xì)胞；=3\*GB3③作為基因表達(dá)模板結(jié)構(gòu)基因：=1\*GB2⑴概念：結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）是指可以編碼特定RNA分子或蛋白質(zhì)分子的遺傳單位。具有編碼序列和非編碼序列（與轉(zhuǎn)錄后加工、修飾及翻譯過程相關(guān)）=2\*GB2⑵特點(diǎn)：=1\*GB3①原核生物結(jié)構(gòu)基因編碼序列連續(xù)=2\*GB3②真核生物結(jié)構(gòu)基因編碼序列是不連續(xù)的，稱為斷裂基因（splitgene）。通常需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后剪接加工=3\*GB3③病毒結(jié)構(gòu)基因編碼序列取決于侵襲的宿主=3\*GB2⑶外顯子（exon）和內(nèi)含子（intron）：可以在成熟RNA分子中保存的序列稱為外顯子（exon），而不能在成熟RNA分子中保存的序列稱為內(nèi)含子（intron）=4\*GB2⑷內(nèi)含子數(shù)目=外顯子-1（組蛋白編碼基因無內(nèi)含子）調(diào)控序列：=1\*GB2⑴概念：與結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控相關(guān)的非編碼序列稱為調(diào)控序列（regulatingsequence），或調(diào)控基因（regulatinggene）=2\*GB2⑵原核生物：=1\*GB3①啟動(dòng)子（promoter）：指位于結(jié)構(gòu)基因上游，并與RNA聚合酶辨認(rèn)、結(jié)合和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一段特殊DNA序列（啟動(dòng)子序列不出現(xiàn)于RNA產(chǎn)物中）。轉(zhuǎn)錄起始辨認(rèn)部位+核心啟動(dòng)子（核心啟動(dòng)子=Pribnow盒+轉(zhuǎn)錄起始部位）=2\*GB3②終止子（terminater）：指位于結(jié)構(gòu)基因下游的一段富含GC的具有回文特性的特殊DNA序列，該序列轉(zhuǎn)錄生成的RNA可以形成特殊的發(fā)卡結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致RNA聚合酶從DNA模板上脫離，促使轉(zhuǎn)錄過程終止。=3\*GB3③操縱元件（operator）：指位于結(jié)構(gòu)基因上游的一段DNA序列，該序列可以被阻遏蛋白辨認(rèn)并結(jié)合，從而阻止結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。=4\*GB3④正調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)：指常出現(xiàn)于弱啟動(dòng)子附近的一段特殊的DNA序列，能與某些具有轉(zhuǎn)錄激活作用的正調(diào)控蛋白辨認(rèn)結(jié)合，從而加快轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)=3\*GB2⑶真核生物：=1\*GB3①啟動(dòng)子（promoter）：Ⅰ類啟動(dòng)子、聚合酶Ⅰ、rRNA；Ⅱ類啟動(dòng)子、聚合酶Ⅱ、mRNA和miRNA；Ⅲ類啟動(dòng)子、聚合酶Ⅲ、5SrRNA、tRNA、snRNA=2\*GB3②增強(qiáng)子（enhancer）：是位于結(jié)構(gòu)基因上游（-100~-300bp）、基因之外或內(nèi)含子中的特殊DNA序列，該序列能被蛋白因子辨認(rèn)結(jié)合，促進(jìn)鄰近基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。=3\*GB3③沉默子(silencer)：負(fù)性調(diào)節(jié)元件，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用=4\*GB3④poly(A)信號(hào)：位于結(jié)構(gòu)基因下游的加尾信號(hào)，其保守序列為AATAAA。該序列也參與RNA轉(zhuǎn)錄終止。第二章基因組的結(jié)構(gòu)與功能基因組：細(xì)胞或者生物體一套完整的單倍體遺傳物質(zhì)的總和?；蚪M的結(jié)構(gòu)：不同的基因功能區(qū)域在核酸分子中的分布與排列情況；基因組的功能：貯存和表達(dá)遺傳信息原核生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能：=1\*GB2⑴原核生物基因組的特點(diǎn)：=1\*GB3①基因組相對(duì)較小，由DNA組成，涉及染色體DNA和質(zhì)粒DNA兩種DNA分子，均為環(huán)狀雙鏈。染色體DNA為單拷貝。=2\*GB3②每個(gè)DNA分子（染色體DNA和質(zhì)粒DNA）只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。=3\*GB3③結(jié)構(gòu)基因通常為連續(xù)基因（無內(nèi)含子），很少重疊基因，非編碼序列和編碼序列各占50%=4\*GB3④含可轉(zhuǎn)移的序列（插入序列、轉(zhuǎn)座子？）：引起插入突變基因，攜帶標(biāo)志基因使受體增添新基因A、轉(zhuǎn)座（transposition）：轉(zhuǎn)座因子在基因組不同位置間的移動(dòng)。B、轉(zhuǎn)座因子（transposableelement）：可以在一個(gè)DNA分子內(nèi)部或兩個(gè)DNA分子之間移動(dòng)的DNA片段。=5\*GB3⑤功能相關(guān)的基因經(jīng)常組織形成操縱子結(jié)構(gòu)，操縱子結(jié)構(gòu)是原核基因組的一個(gè)突出的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：A、操縱子：功能上相關(guān)的若干結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，由一套調(diào)控序列控制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，構(gòu)成基本轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱子（operon）。（即調(diào)控序列+結(jié)構(gòu)基因）（區(qū)別操縱元件）B、多順反子mRNA(polycistronicmRNA):原核生物的一個(gè)mRNA分子帶有幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因的遺傳信息，運(yùn)用共同的啟動(dòng)子及終止信號(hào)，組成操縱子的基因表達(dá)調(diào)控單元。（相應(yīng)于只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)）=2\*GB2⑵質(zhì)粒（plasmid）是指存在于細(xì)菌中獨(dú)立于染色體DNA外的雙鏈環(huán)狀小分子DNA，可進(jìn)行自主復(fù)制。特點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)可自主復(fù)制；所攜帶的遺傳信息能賦予宿主特定的遺傳性狀；細(xì)胞分裂時(shí)恒定地傳給子代；質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)移真核生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能（染色體DNA+線粒體DNA）：=1\*GB2⑴真核生物基因組的特點(diǎn)：1.每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目；2.遠(yuǎn)大于原核基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大；3.真核生物基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，無操縱子結(jié)構(gòu)；4.有大量反復(fù)序列;5.真核基由于斷裂基因;6.非編碼序列遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于編碼序列;7.功能相關(guān)基因構(gòu)成各種基因家族。=1\*GB3①真核生物基因組都是由大分子雙鏈線狀DNA構(gòu)成。染色體通常成對(duì)出現(xiàn)（雙倍體）。=2\*GB3②基因組非常龐大，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。=3\*GB3③基因組中存在大量的反復(fù)序列以及非編碼序列。非編碼序列占90%以上，是與細(xì)菌、病毒的重要區(qū)別，在一定限度上也是生物進(jìn)化的標(biāo)尺。=4\*GB3④真核生物基因組中也存在一些轉(zhuǎn)座元件。=2\*GB2⑵反復(fù)序列分類：=1\*GB3①高度反復(fù)序列highlyrepetitivesequences：反向反復(fù)序列（invertedrepeats）：是由兩個(gè)相同順序的互補(bǔ)拷貝在同一DNA雙鏈上反向排列而成。衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）：有相同的核心序列,多為2～10bp，成串排列。（大衛(wèi)星DNA（macrosatelliteDNA）染色體的著絲粒區(qū)；小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA）常染色體；微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA）常染色體）復(fù)雜反復(fù)序列（complexrepeats）：這種高度反復(fù)序列的反復(fù)單位是較為復(fù)雜的核苷酸序列，多見于哺乳動(dòng)物。功能：參與復(fù)制水平的調(diào)節(jié)；參與基因表達(dá)的調(diào)控；參與染色體配對(duì)（大衛(wèi)星DNA位于著絲粒區(qū)）；參與轉(zhuǎn)位作用；與進(jìn)化有關(guān)；同一種屬中不同個(gè)體的高度反復(fù)順序的反復(fù)次數(shù)不同樣，這可以作為每一個(gè)體的特性，即DNA指紋。=2\*GB3②中度反復(fù)序列：一部分是編碼rRNA、tRNA、組蛋白及免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)基因，另一部分也許與基因調(diào)控有關(guān)。短散在核元件（shortinterspersednuclearelements，SINEs）Alu反復(fù)序列家族長散在核元件（longinterspersednuclearelements，LINEs）KpnⅠ反復(fù)序列家族=3\*GB3③低度反復(fù)序列（單拷貝序列）：在單倍體基因組中只出現(xiàn)一次或數(shù)次，結(jié)構(gòu)基因重要是單拷貝序列。編碼不同功能的蛋白質(zhì)。=3\*GB2⑶多基因家族（multigenefamily）：=1\*GB3①概念：指DNA序列具有較高的同源性（通常大于50%），并且其編碼產(chǎn)物具有相同或相似生理功能的一組結(jié)構(gòu)基因。通常是由同一祖先基因經(jīng)進(jìn)化或變異而來。基因家族成簇地分布在同一染色體上并同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，如組蛋白基因家族基因家族成簇地分布于不同的染色體上并分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，且不同基因編碼的蛋白質(zhì)在功能上相關(guān)，如珠蛋白基因家族。=4\*GB2⑷假基因（pseudogene）：加工基因或非功能基因。:這類基因的核苷酸順序雖然與正常的結(jié)構(gòu)基因很相似，但基本上不能表達(dá)。因素：假基因是由于在進(jìn)化過程中，某些DNA片段發(fā)生了缺失、倒位或點(diǎn)突變，導(dǎo)致調(diào)控基因丟失；或無剪接加工信號(hào)；或編碼區(qū)出現(xiàn)終止信號(hào)；或編碼無功能或不完整的基因。=5\*GB2⑸線粒體DNA的結(jié)構(gòu)：可獨(dú)立編碼存在于線粒體中的多肽鏈、rRNA:或tRNA。編碼13種蛋白（呼吸鏈酶復(fù)合物的單位）、22種tRNA和2種rRNA。病毒基因組的特點(diǎn)：=1\*GB2⑴較小，但不同病毒基因組大小相差較大=2\*GB2⑵不同病毒基因組可以是不同結(jié)構(gòu)的核酸=3\*GB2⑶除逆轉(zhuǎn)錄病毒外，通常為單倍體基因組=4\*GB2⑷有的病毒基因組存在節(jié)段=5\*GB2⑸病毒基因組基因有連續(xù)的和間斷的（有內(nèi)含子）=6\*GB2⑹功能相關(guān)基因可以轉(zhuǎn)錄成多順反子mRNA=7\*GB2⑺基因重疊（Geneoverlap）即同一段DNA片段可以以兩種或兩種以上的閱讀方式進(jìn)行閱讀，因而可編碼兩種或兩種以上的多肽基因的表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控的基本規(guī)律基因表達(dá)（geneexpression）：是指在一定調(diào)節(jié)因素的作用下，生物基因組中的結(jié)構(gòu)基因被激活并轉(zhuǎn)錄生成特定的RNA，或由此引起特異性蛋白質(zhì)合成的過程。本質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄或者翻譯的過程?；虮磉_(dá)調(diào)控（geneexpressionregulation）：是指生物體通過特定的蛋白質(zhì)與DNA，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的互相作用來調(diào)控基因是否表達(dá)，或調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物的多少以滿足生物體的自身需求以及適應(yīng)環(huán)境變化的過程。基本規(guī)律：基因表達(dá)具有時(shí)空特異性：=1\*GB3①某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按照特定的時(shí)間順序發(fā)生。=2\*GB3②即空間分布差異，某一基因只在特定的細(xì)胞或組織中表達(dá)，或者不同的細(xì)胞或組織中的表達(dá)量不同誘導(dǎo)表達(dá)和阻遏表達(dá)是基因表達(dá)調(diào)控的普遍方式：=1\*GB3①組成性表達(dá)（constitutivegeneexpression）：指?jìng)€(gè)體發(fā)育的任一階段都能在大多數(shù)細(xì)胞中連續(xù)進(jìn)行表達(dá)的基因，不受環(huán)境的影響。管家基因：在一個(gè)生物體所有細(xì)胞中連續(xù)表達(dá)，且較少受環(huán)境因素的影響，這類基因通常被稱為管家基因（house-keepinggene）。如各種組蛋白基因=2\*GB3②可調(diào)控型表達(dá)（adaptiveexpression）：A誘導(dǎo)：在特定環(huán)境因素刺激下，相應(yīng)的基因被激活，從而使基因的表達(dá)產(chǎn)物增長的過程，稱為誘導(dǎo)(induction)，這類基因稱為可誘導(dǎo)基因(induciblegene)。可以誘導(dǎo)基因表達(dá)的分子稱為誘導(dǎo)劑。B克制：在特定環(huán)境因素刺激下，基因被克制，從而使基因的表達(dá)產(chǎn)物減少的過程稱為阻遏(repression)，這類基因稱為可阻遏基因(repressiblegene)。可以阻遏基因表達(dá)的分子成為阻遏劑。C奢侈基因(luxurygene)：在特別細(xì)胞類型中大量表達(dá)并編碼特殊功能產(chǎn)物的基因。這類基因指導(dǎo)合成組織特異性蛋白，對(duì)分化有重要影響。如肌肉細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白基因和肌球蛋白基因、紅細(xì)胞的血紅蛋白基因等?；虮磉_(dá)受順式作用元件和反式作用因子共同調(diào)節(jié)：順式作用元件為調(diào)控序列（基因），與結(jié)構(gòu)基因位于同一DNA鏈上。反式作用因子為轉(zhuǎn)錄因子（蛋白質(zhì)），辨認(rèn)結(jié)合順式作用元件而發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)-DNA以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的互相作用是基因表達(dá)調(diào)控的分子基礎(chǔ)基因表達(dá)調(diào)控是多層次的復(fù)雜調(diào)節(jié)：基因、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后第二節(jié)原核生物的基因表達(dá)調(diào)控1、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控重要在轉(zhuǎn)錄水平，即對(duì)RNA合成的調(diào)控2、兩種方式：起始調(diào)控，即啟動(dòng)子調(diào)控；終止調(diào)控，即衰減子調(diào)控3、轉(zhuǎn)錄起始的負(fù)調(diào)控：Lac操縱子的調(diào)控機(jī)制：=1\*GB3①阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控機(jī)制=2\*GB3②CAP的正調(diào)控機(jī)制=3\*GB3③復(fù)合調(diào)控機(jī)制=4\*GB3④乳糖操縱子的基本結(jié)構(gòu)=5\*GB3⑤體內(nèi)生理誘導(dǎo)劑涉及乳糖及其代謝物別乳糖，體外實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)劑是人工合成底物異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控：色氨酸操縱子（trpoperon）=1\*GB3①色氨酸操縱子參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的調(diào)控。=2\*GB3②調(diào)控方式：通過阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控；通過衰減子作用（attenuation）=3\*GB3③色氨酸操縱子是通過轉(zhuǎn)錄衰減作用實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控的典型例子=4\*GB3④轉(zhuǎn)錄衰減是一種將轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián)的調(diào)節(jié)機(jī)制。真核生物基因表達(dá)的調(diào)控特點(diǎn)：=1\*GB3①多層次多水平；=2\*GB3②無操縱子和衰減子；=3\*GB3③個(gè)體發(fā)育復(fù)雜；=4\*GB3④需在特定的時(shí)間，特定的細(xì)胞中激活特定的基因，從而實(shí)現(xiàn)“預(yù)定”的、有序的、不可逆轉(zhuǎn)的分化過程，并使生物的組織和器官保持正常的功能=5\*GB3⑤受環(huán)境影響??；正性調(diào)控占主導(dǎo)。真核生物染色體水平的調(diào)控概述：=1\*GB3①染色體的轉(zhuǎn)錄基本單位核小體的改變：使基因組發(fā)生了改變組蛋白修飾：如磷酸化、乙?；?、泛素化DNA改變：基因丟失、擴(kuò)增、重排和移位，可以消除或變換某些基因并改變其活性=2\*GB3②染色體自身結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，調(diào)控真核生物的基因表達(dá)=1\*GB3①染色質(zhì)的活化：活性染色質(zhì)的核小體發(fā)生構(gòu)象改變，具有疏松的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而便于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與順式調(diào)控元件結(jié)合和RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄模板上滑動(dòng)活性染色質(zhì)重要特性：A、活性染色質(zhì)具有DNaseI超敏位點(diǎn)（DNaseIhypersensitivesite）；B、活性染色質(zhì)很少有組蛋白H1與其結(jié)合；C、活性染色質(zhì)的組蛋白乙?；薅雀?；D、活性染色質(zhì)的核小體組蛋白H2B很少被磷酸化；E、活性染色質(zhì)中核小體組蛋白H2A在許多物種很少有變異形式=2\*GB3②RNA聚合酶組合位點(diǎn)的上游和下游具有不同的超螺旋構(gòu)象=3\*GB3③基因的甲基化修飾（DNAmethylation）：CpG島的高甲基化促進(jìn)染色質(zhì)形成致密結(jié)構(gòu)：甲基化限度高，基因表達(dá)水平減少；去甲基化限度高，基因表達(dá)增強(qiáng)。（CpG島是位于基因5′端富含CG堿基的調(diào)控序列，這些序列常位于啟動(dòng)子附近。在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶。）B、甲基化可以遺傳形成，也可以后天獲得且具有可逆性C、表觀遺傳：依靠親本DNA鏈的甲基化位置催化子鏈DNA在相同位置發(fā)生甲基化的現(xiàn)象。表觀遺傳學(xué)（epigenetics）：重要研究不涉及DNA序列改變的可遺傳的基因表達(dá)的改變。涉及：DNA甲基化、基因組印記、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和基因沉默。=4\*GB3④染色質(zhì)丟失=5\*GB3⑤基因擴(kuò)增：?jiǎn)渭兛空{(diào)節(jié)其表達(dá)活性局限性以滿足需要=6\*GB3⑥基因重排（generearrangement）：免疫球蛋白的重排3、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控(轉(zhuǎn)錄速度決定RNA合成效率)（最重要）=1\*GB3①順式作用元件與基因表達(dá)順式作用元件（cis-actingelement）：參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA序列統(tǒng)稱。真核生物中涉及啟動(dòng)子（地中海貧血啟動(dòng)子區(qū)TATA盒）、增強(qiáng)子（無基因特異性；增強(qiáng)效應(yīng)與位置和取向無關(guān)；可遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用；有組織或細(xì)胞特異性，成環(huán)模型）、沉默子（沉默子、絕緣子是負(fù)調(diào)控元件，與反式作用因子互相結(jié)合而起作用。不受距離和方向的限制，可對(duì)異源基因的表達(dá)起作用。）、polyA信號(hào)等=2\*GB3②反式作用因子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控反式作用因子（trans-actingfactor）：參與基因表達(dá)調(diào)控的蛋白質(zhì)因子統(tǒng)稱涉及RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子通用轉(zhuǎn)錄因子（generaltranscriptionfactor）：RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子所必需的一組蛋白因子，如TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE等。特異轉(zhuǎn)錄因子（specialtranscriptionfactor）：個(gè)別基因轉(zhuǎn)錄所必需的轉(zhuǎn)錄因子，如淋巴細(xì)胞中特異的OCT-2.D、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（酸性激活域、谷氨酰胺富含域、脯氨酸富含域）、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（鋅指結(jié)構(gòu)（zincfingermotif）、螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)（helix-loop-helix，HLH）、螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋結(jié)構(gòu)（helix-turn-helix，HLH）、亮氨酸拉鏈（leucinezipper）、堿性α螺旋（alkalineα-helix））鋅指（Zincfinger）模體：螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）模體：2個(gè)α螺旋和一個(gè)短肽段形成的環(huán)相連c、亮氨酸拉鏈（leucinezipper）模體：肽鏈上每隔6個(gè)殘基就有1個(gè)疏水的Leu殘基d、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域：富含酸性氨基酸、富含Gln和富含Pro轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)也是基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)（控制mRNA的結(jié)構(gòu)與功能）=1\*GB3①mRNA前體的剪切：加帽、加尾、去除內(nèi)含子=2\*GB3②選擇性剪接（alternativesplicing）/可變剪接：mRNA前體可按不同方式剪接產(chǎn)生多種mRNA。真核基因內(nèi)含子的存在是選擇性剪接的分子基礎(chǔ)=3\*GB3③5’端非翻譯區(qū)和3’端非翻譯區(qū)結(jié)構(gòu)：5’端非翻譯區(qū)翻譯克制蛋白，3’端非翻譯區(qū)AU豐富序列mRNA降解=4\*GB3④轉(zhuǎn)錄后基因沉默：RNA干擾作用引起特異性的mRNA模板的降解翻譯水平的調(diào)控決定蛋白質(zhì)合成的速度=1\*GB3①磷酸化/脫磷酸化的調(diào)控=2\*GB3②mRNA損傷對(duì)翻譯的影響基因表達(dá)調(diào)控異常與疾病遺傳性維生素D3抵抗性佝僂?。壕S生素D3受體基因上與DNA結(jié)合的部位發(fā)生點(diǎn)突變HOH-Dream綜合癥：轉(zhuǎn)錄因子TBX5基因的突變?cè)l(fā)性腫瘤：不適當(dāng)?shù)腄NA共價(jià)修飾引發(fā)疾病，如低甲基化基因組學(xué)及相關(guān)組學(xué)第一節(jié)基因組學(xué)1、基因組學(xué)（genomics）是指對(duì)整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及基因之間互相作用進(jìn)行探索的一門科學(xué)2、人類基因組計(jì)劃（humangenomeproject，HGP）：測(cè)定出人類基因組DNA的所有堿基序列。（美國、英國、日本、法國、德國、中國）（遺傳圖、物理圖、轉(zhuǎn)錄圖、序列圖）第三節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)1、蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）：重要研究某種生物體、器官、組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)在特定條件下所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量。2、三大技術(shù)：雙向電泳分離技術(shù)、生物信息學(xué)解決技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)細(xì)胞增殖分化的分子機(jī)制第一節(jié)細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)1、細(xì)胞增殖(cellproliferation)：指細(xì)胞通過細(xì)胞生長（cellgrowth）和細(xì)胞分裂（celldivision）使細(xì)胞數(shù)目增長,并使子細(xì)胞獲得和母細(xì)胞相同遺傳特性的過程，是個(gè)體生長發(fā)育的重要過程之一。細(xì)胞增殖是生長的重要因素之一：細(xì)胞數(shù)目增多、細(xì)胞體積增大、細(xì)胞外基質(zhì)合成細(xì)胞周期是細(xì)胞分裂過程中的有序事件：=1\*GB3①細(xì)胞周期（cellcycle）：指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個(gè)過程。（M期,G1期,S期,G2期）細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中不同時(shí)相的對(duì)的轉(zhuǎn)換：=1\*GB3①細(xì)胞周期蛋白（cyclin）：一類隨著細(xì)胞周期不同時(shí)相的轉(zhuǎn)換，其濃度也隨之發(fā)生變化的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)通過與相應(yīng)的蛋白激酶的結(jié)合對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。=2\*GB3②細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependentkinase，CDK）：是一類cdc基因編碼的蛋白的總稱，只有與周期蛋白結(jié)合，并將周期蛋白作為其調(diào)節(jié)亞單位，進(jìn)而才干表現(xiàn)出蛋白激酶活性。（調(diào)節(jié)亞單位Cyclin+催化亞單位CDK）=3\*GB3③Cyclin-CDK復(fù)合體的特點(diǎn)：不同的CDK激酶所規(guī)定結(jié)合的周期蛋白不同，在細(xì)胞周期中執(zhí)行的調(diào)節(jié)功能也不同B、Cyclin不總是與CDK結(jié)合在一起而是在細(xì)胞周期不同階段有規(guī)律的降解使CDK周期性失活。=4\*GB3④周期蛋白的泛素化降解：周期蛋白合成后其N端發(fā)生多泛素化（polyubiquitination）=5\*GB3⑤細(xì)胞周期蛋白激酶的克制因子（CKI）：大部分CKI都是抑癌基因的編碼產(chǎn)物。（INK4家族克制CDK4-cyclinD和CDK6-cyclinD）（CIP/KIP家族克制CDK2-cyclinA和CDK2-cyclinE）細(xì)胞周期的調(diào)控：=1\*GB3①關(guān)卡（checkpoint）：A、G1關(guān)卡(G1-S)：稱start或R點(diǎn)。B、G2關(guān)卡(G2-M)：決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)。C、中期關(guān)卡(M后期-胞質(zhì)分裂，紡錘體組裝檢查點(diǎn))：任何一個(gè)著絲點(diǎn)沒有對(duì)的連接到紡錘體上，都會(huì)引起細(xì)胞周期中斷。=2\*GB3②細(xì)胞周期調(diào)控：G1到S期轉(zhuǎn)折---進(jìn)入DNA合成期：CyclinD與CDK結(jié)合使Rb釋放結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F啟動(dòng)DNA的復(fù)制，并防止組裝新的復(fù)合體，保證S期中DNA僅復(fù)制一次B、G2→M期轉(zhuǎn)折---進(jìn)入有絲分裂期：促有絲分裂因子（mitosis-promotingfactor，MPF），即CyclinB/CDK1蛋白復(fù)合體可促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期，激活A(yù)PC，介導(dǎo)降解克制因子。a、細(xì)胞分裂后期促進(jìn)復(fù)合體APC：APC介導(dǎo)CyclinB多聚泛素化，CyclinB降解，使MPF失活。生長因子（growthfactor）：=1\*GB3①概念：是一類由細(xì)胞分泌的、類似于激素的信號(hào)分子，多數(shù)為肽類（含蛋白質(zhì)）物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化的作用=2\*GB3②作用方式：旁分泌、自分泌、內(nèi)分泌=3\*GB3③重要來自血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子是：ET重要來自胎盤或再生肝的生長因子是：HGF重要來自腫瘤等惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長因子是：TGF細(xì)胞分化的分子機(jī)制細(xì)胞分化（celldifferentiation）：指胚胎細(xì)胞獲得不同形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能特性的過程。細(xì)胞分化的特點(diǎn)：=1\*GB3①細(xì)胞分化貫穿生命的全過程:。=2\*GB3②細(xì)胞分化隨著特異性基因的階段性表達(dá)：細(xì)胞分化的可逆性：在一定條件下，具有增生能力的組織中，已經(jīng)分化的細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)，并回復(fù)到胚性的狀態(tài)（可分化狀態(tài)），這種現(xiàn)象稱為去分化。（細(xì)胞分化的穩(wěn)定性是普遍的，可逆性是有條件的）細(xì)胞分化的普遍性：細(xì)胞分化是一種普遍的生命現(xiàn)象，整個(gè)個(gè)體的生長中都有細(xì)胞分化，其中以胚胎期為主。=3\*GB3③細(xì)胞分化受到一系列信號(hào)分子的調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化的全能性：=1\*GB3①干細(xì)胞（stemcell）：是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體分類：a、全能干細(xì)胞（如胚胎干細(xì)胞、受精卵）b、多能干細(xì)胞（造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等）c、專能干細(xì)胞（如腸上皮干細(xì)胞）B、特點(diǎn)：a、終生保持未分化或低分化特性；b、在機(jī)體的中的數(shù)目、位置相對(duì)恒定；c、具有自我更新能力；d、能無限制的分裂增殖；e、具有多向分化潛能。=2\*GB3②胚胎干細(xì)胞(Embryoucstemcell，ES)：當(dāng)受精卵分裂發(fā)育時(shí)，內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞在體外通過培養(yǎng)即成為胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是一種全能干細(xì)胞，它具有發(fā)育的全能性，能分化成人體的所有組織和器官。=3\*GB3③全能性（totipotency）：受精卵或者胚胎干細(xì)胞能分化形成生物個(gè)體內(nèi)所有的不同類型細(xì)胞的能力稱為全能性=4\*GB3④多能性（pluripotency）：多能干細(xì)胞能分化為體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞類型的能力。造血干細(xì)胞細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞就屬于多能干細(xì)胞=5\*GB3⑤單能性（unipotent）：只能分化為一種終末細(xì)胞的能力。如精原干細(xì)胞。成體細(xì)胞的橫向分化：=1\*GB3①橫向分化或轉(zhuǎn)分化（transdifferentiation）：一種已經(jīng)分化的細(xì)胞類型不可逆的轉(zhuǎn)化為另一種正常分化的細(xì)胞類型。第十章基因變異與疾病基因變異的基本概念1、基因變異（GeneVariation）：基因變異是指DNA的序列組成或結(jié)構(gòu)在傳遞過程中發(fā)生了改變，也稱基因突變（是人類遺傳病產(chǎn)生的根源）=1\*GB3①生殖系突變：遺傳病的本質(zhì)所在=2\*GB3②體細(xì)胞突變：引發(fā)腫瘤的重要因素基因變異涉及DNA多態(tài)性和致病突變：=1\*GB3①DNA多態(tài)性：某DNA序列的變異在人群中出現(xiàn)的頻率>1%，有的與疾病相關(guān)。=2\*GB3②致病突變：出現(xiàn)頻率<<1%，引起基因功能的顯著改變，多發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因，導(dǎo)致遺傳病的發(fā)生人基因組中三類常見的DNA多態(tài)性：=1\*GB3①SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性，給定人群基因組的給定位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的單個(gè)核苷酸變異=2\*GB3②CNV：拷貝數(shù)變異，DNA片段的拷貝數(shù)的變異，涉及倒位、缺失、插入反復(fù)等，人群中的反復(fù)概率>1%時(shí)稱為拷貝數(shù)多態(tài)性=3\*GB3③STR：短串聯(lián)反復(fù)序列，反復(fù)單位1-6bp，反復(fù)次數(shù)可變，反復(fù)總長度<200bp4、人基因組中的基因變異類型（都包含DNA多態(tài)性和致病突變）：點(diǎn)突變：pointmutation大片段突變：grossmutation短串聯(lián)反復(fù)突變：shorttandemrepeatmutation,STR拷貝數(shù)變異：copynumbervariant，CNV基因變異的生物學(xué)效應(yīng)突變對(duì)基因功能的影響：功能失去性、獲得性突變，對(duì)于維持細(xì)胞的正常代謝和生命活動(dòng)都是不利的，嚴(yán)重時(shí)就會(huì)導(dǎo)致疾病2、DNA變異與基因功能減弱：=1\*GB3①單倍型局限性：指給定兩個(gè)拷貝中的一個(gè)等位基因發(fā)生突變或缺失，另一個(gè)拷貝的表達(dá)產(chǎn)物局限性以維持正常的細(xì)胞功能HDR綜合征（甲狀旁腺功能減退-感覺神經(jīng)性耳聾-腎發(fā)育異常綜合征）HDR是一種常染色體顯性遺傳的綜合癥GATA3基因的單倍型局限性患兒以聽力減退、手足搐搦為重要表現(xiàn)=2\*GB3②反義RNA轉(zhuǎn)錄/基因組修飾：結(jié)構(gòu)完整的基因，由于反義RNA封閉和甲基化作用而轉(zhuǎn)錄沉默b、α-地中海貧血=3\*GB3③轉(zhuǎn)錄因子基因變異：兒童遺傳性白內(nèi)障由于HSF4基因突變=4\*GB3④影響mRNA穩(wěn)定性的變異：mRNA非翻譯區(qū)的變異導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性下降（α-地中海貧血）=5\*GB3⑤顯性負(fù)效應(yīng)：突變型蛋白與野生型蛋白，仍然可以形成蛋白復(fù)合體，但是此復(fù)合體的功能完全或部分喪失遺傳性長Q-T間期綜合癥3、DNA變異與基因功能增強(qiáng)：=1\*GB3①轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)作用：部分調(diào)節(jié)序列的變異使基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，表達(dá)水平提高；一些克制轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因發(fā)生變異。遺傳性胎兒血紅蛋白連續(xù)增多癥HPFH：?jiǎn)?dòng)子變異上調(diào)了γ基因的表達(dá)水平，成人期表達(dá)了胎兒珠蛋白γ鏈=2\*GB3②增強(qiáng)子的位置效應(yīng)：DNA序列的大片段缺失（涉及結(jié)構(gòu)基因，如β），下游增強(qiáng)子通過距離效應(yīng)(遠(yuǎn)程效應(yīng))激活上游結(jié)構(gòu)基因中國人δβ地貧（成人期HbF異常升高）=3\*GB3③劑量效應(yīng)：基因拷貝數(shù)增多，導(dǎo)致產(chǎn)物過度表達(dá)。腓骨肌萎縮癥CMT：正常人單倍體PMP22基因2個(gè)拷貝，患者有3、4個(gè)=4\*GB3④SNP發(fā)明新啟動(dòng)子：廣泛存的SNP點(diǎn)突變，不直接影響編碼功能，但也許產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用（rSNP），與本來啟動(dòng)子競(jìng)爭(zhēng)，使原有的蛋白表達(dá)量減少（α地貧）=5\*GB3⑤獲得性RNA堆積：如強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥，DMPK和ZNF9基因突變，可以轉(zhuǎn)錄，但不能翻譯，導(dǎo)致RNA堆積，RNA克制肌細(xì)胞分化，并損傷肌細(xì)胞細(xì)胞異常增生性疾病分子機(jī)制1、腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素（環(huán)境、遺傳），多基因（很少數(shù)為單基因遺傳?。嚯A段，多途徑的過程。第一節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制1、癌基因(oncogene)：=1\*GB3①概念指細(xì)胞或病毒內(nèi)存在的、編碼產(chǎn)物能促使正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因。（凡能編碼生長因子、生長因子受體、細(xì)胞內(nèi)生長信號(hào)傳遞分子以及與生長有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的基因，均屬于癌基因。）=2\*GB3②分類：A、病毒癌基因（virusoncogene,v-onc）：指存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中的癌基因。（這種基因不編碼結(jié)構(gòu)成分，對(duì)病毒的復(fù)制無作用，但可使細(xì)胞連續(xù)增殖）B、細(xì)胞癌基因(cellular-oncogene,c-onc)：又叫原癌基因（protooncogene），指存在于正常細(xì)胞的基因組中的癌基因。（都是一些具有重要功能的管家基因，對(duì)維持細(xì)胞正常功能具有重要作用，異常表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)物可使細(xì)胞無限制分裂）2、抑癌基因(cancersuppressivegene)：能克制細(xì)胞過度生長、增殖并具有潛在抗癌作用的基因。=1\*GB3①在G1期Rb與E2F結(jié)合，克制E2F的活性，在G1/S期Rb被細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2）磷酸化失活而釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，使細(xì)胞周期運(yùn)營。=2\*GB3②p16基因：又稱MTS(multipletumorsuppressor1），位于人染色體9p21，與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)。p16的作用是,克制CDK-Cyclin復(fù)合物的激酶活性，保護(hù)Rb不被磷酸化失活，從而避免引發(fā)癌癥=3\*GB3③p53蛋白：A、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及克制細(xì)胞生長的作用：促進(jìn)p21表達(dá),使細(xì)胞周期停滯于G1期。B、促進(jìn)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞促凋亡基因表達(dá)，使已通過G1-S關(guān)卡的損傷DNA細(xì)胞自然凋亡。腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制：=1\*GB3①原癌基因點(diǎn)突變(pointmutation)：癌基因在編碼順序的特定位置上的某一個(gè)核苷酸發(fā)生突變，使其表達(dá)蛋白質(zhì)中相應(yīng)的氨基酸發(fā)生變化，從而獲得了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的活性（錯(cuò)義突變）=2\*GB3②基因擴(kuò)增：某些癌基因通過一些機(jī)制在本來的染色體上復(fù)制多個(gè)拷貝，超過了正常細(xì)胞的癌基因劑量，導(dǎo)致基因產(chǎn)物的增長，從而使細(xì)胞正常功能紊亂=3\*GB3③基因易位或重排：有些癌基因從其染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到另一染色體的某個(gè)位置，由于調(diào)控環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致從相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)變成激活狀態(tài)，使原癌基因表達(dá)產(chǎn)物顯著增長而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。（慢性粒細(xì)胞白血?。褐匾苡绊懙募?xì)胞為B、T淋巴細(xì)胞）=4\*GB3④病毒基因啟動(dòng)子及增強(qiáng)子的插入：在原癌基因的上游插入外源性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可激活原癌基因，使其表達(dá)產(chǎn)物增多。=5\*GB3⑤抑癌基因失活：A、Rb基因的失活：Rb基因幾乎在人體的所有細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)其突變或缺失，致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和骨肉瘤等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Rb基因缺失B、p53基因的失活：顯性負(fù)突變，錯(cuò)義突變產(chǎn)物與正常p53蛋白形成無功能的四聚體C、p16基因的失活：又稱為多腫瘤克制基因，克制Rb蛋白的磷酸化，克制細(xì)胞通過G1檢查點(diǎn)；純合性缺失（一對(duì)染色體上兩個(gè)等位基因均缺失）基因操作第一節(jié)核酸的理化性質(zhì)核酸凝膠電泳：=1\*GB3①基本原理：核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度的電場(chǎng)中，它們會(huì)向正電極方向遷移聚丙烯酰胺凝膠電泳：=1\*GB3①丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑過硫酸銨或核黃素作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。SDS(十二烷基硫酸鈉)是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。核酸分子雜交與印跡技術(shù)：=1\*GB3①OD：OD260單核苷酸>ssDNA(RNA)>dsDNADNA純品：OD260/OD280=1.8RNA純品：OD260/OD280=2.0=2\*GB3②DNA的變性（denaturation）：定義：在某些理化性質(zhì)作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈過程。方法：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、變性試劑如尿素、酰胺及乙醇、丙酮及高鹽等。本質(zhì)：本質(zhì)是雙鏈之間的氫鍵斷裂增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。減色效應(yīng)：DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260減少Tm：變性是在一個(gè)相稱窄的溫度范圍內(nèi)完畢。在這一范圍內(nèi)，紫外線吸取值達(dá)成最高值的50%時(shí)的溫度稱為解鏈溫度，或稱為融解溫度（meltingtemperature，Tm）。其大小與G+C含量成正比。退火（annealing）：熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火雜交（hybridization）：=1\*GB3①概念：指兩條不同來源的互補(bǔ)核酸單鏈在一定條件下按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過程。=2\*GB3②原理：堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性=3\*GB3③雜交雙鏈分別為待測(cè)的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用同位素或非同位素示蹤標(biāo)記，稱為探針（probe），雜交后形成的異源雙鏈分子稱為雜交子。分子探針：探針是指一段已知序列的，能與目的基因互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列核酸分子雜交的基本類型：=1\*GB3①液相雜交：反映速度快，但不能簡(jiǎn)樸分離雜交體和游離核酸探針。=2\*GB3②固相雜交：Southern印跡雜交（Southernblothybridization）：指DNA-DNA雜交Northern印跡雜交（Northernblothybridization）：指DNA-RNA雜交，應(yīng)用特異性基因探針分析基因的轉(zhuǎn)錄水平原位雜交（insituhybridization）：原位雜交可以用來擬定被測(cè)定序列在細(xì)胞內(nèi)的空間位置。Western免疫印跡（WesternBlot）：基因結(jié)構(gòu)的分析與改造技術(shù)=1\*GB3①雙脫氧末端終止法（分析DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)）：原理核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧三磷酸核苷酸存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，假如在四管反映系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。如此每管反映體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反映終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳。以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個(gè)堿基)，根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。=2\*GB3②基因定點(diǎn)突變（site-directedmutagenesis)：定義：改變基因序列中的特定堿基稱為基因定點(diǎn)突變?；虻墨@取1、PCR是一種體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱基因的體外擴(kuò)增法。2、反映體系：=1\*GB3①模板DNA：長度不宜大于10kb的單、雙鏈均可=2\*GB3②兩種引物：3’—5’引物，5’—3’引物。引物決定了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及其特異性=3\*GB3③耐熱Taq-DNA聚合酶（Taq酶）=4\*GB3④四種脫氧核糖核苷酸3、反映原理：是一種在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，反映體系較為簡(jiǎn)樸。以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶作用下，按照半保存復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完畢新的DNA合成。不斷反復(fù)這一過程，可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。因新合成的DNA也可以作為模板，因而PCR可使DNA的合成呈指數(shù)增長。4、反映過程：變性（95℃解鏈）-復(fù)性（55℃引物結(jié)合）-延伸（72℃dNTP結(jié)合）三步循環(huán)反映。5、逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV/AMV）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。6、定量PCR(quantifiedPCR，real-timePCR)：=1\*GB3①在PCR反映體系中加入熒光基團(tuán)，運(yùn)用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。=2\*GB3②幾種不同的熒光定量PCR技術(shù)：A、SYBRGreenB、TaqMan技術(shù)（探針法）C、分子BEACON基因文庫：基因文庫是一種載體中抱負(fù)地包含著某種生物體所有遺傳信息的隨機(jī)DNA片段的總和。=1\*GB3①基因組文庫genomiclibrary：包含某種生物體所有基因片段的重組DNA克隆群體。=2\*GB3②cDNA文庫cDNAlibrary：指某種特定的細(xì)胞及特定狀態(tài)下的所有cDNA克隆，cDNA序列與成熟的mRNA相稱，沒有內(nèi)含子?；蚬こ蹋荷婕疤囟ɑ虻闹苽?、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)與DNA分子相關(guān)的技術(shù)。又稱DNA重組(DNArecombination)，DNA克隆(DNAcloning)，分子克隆（molecularcloning）。（狹義）=1\*GB3①基因工程載體（Vector）：定義：能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，使之能得到復(fù)制和進(jìn)行表達(dá)的一類DNA分子特性：在宿主細(xì)胞內(nèi)行獨(dú)立和穩(wěn)定的DNA自我復(fù)制。載體DNA序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，最佳是單一的酶切位點(diǎn)。具有能觀測(cè)的表型特性，可作為DNA選擇的遺傳標(biāo)志。易于從宿主細(xì)胞中分離純化。常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、酵母細(xì)胞克隆載體與人工染色體C、噬菌體：a、λ-噬菌體：顆粒中的DNA是一線性雙鏈DNA分子，可通過兩端的黏性末端環(huán)化。b、M13噬菌體：?jiǎn)捂湱h(huán)狀正鏈DNA基因組。無包裝限制問題（可6倍于M13基因組）c、粘性質(zhì)粒：具有侵蝕性和感染性D、酵母人工染色體是可以裝載最長目的基因的載體（可長達(dá)1000bp）=2\*GB3②工具酶：A、限制性內(nèi)切酶（Ⅱ型）：辨認(rèn)雙鏈DNA的特異序列,并在辨認(rèn)位點(diǎn)或其周邊切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。B、DNA連接酶（DNAligase）：催化雙鏈DNA或RNA中并列的5′-磷酸和3′-羥基之間形成磷酸二酯鍵的酶。C、DNApolymerase：以DNA為模板催化在體外合成DNA的酶類。=3\*GB3③導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化transformation：質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處在感受態(tài)的受體細(xì)胞（原核細(xì)胞），并使其獲得新的遺傳表型的過程，稱為轉(zhuǎn)化。（將載體或其他外源DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞）感染infection：以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外通過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。（載體具侵蝕能力）轉(zhuǎn)染transfection：將噬菌體、病毒或其他載體的重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（真核細(xì)胞），使之獲得新的表型的過程。D、重組體分子導(dǎo)入原核細(xì)胞：CaCl2轉(zhuǎn)化、電擊法重組體分子導(dǎo)入真核細(xì)胞：CaCl2轉(zhuǎn)化、電擊法、病毒感染法（高效率）、脂質(zhì)體法（培養(yǎng)細(xì)胞）、顯微注射法（轉(zhuǎn)基因）、磷酸鈣共沉淀法=4\*GB3④基因工程基本過程：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩A、目的基因的獲?。篜CR法，逆轉(zhuǎn)錄法，基因文庫篩選法，人工合成法B、基因載體的選擇和構(gòu)建C、目的基因與載體的連接D、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染E、篩選、擴(kuò)增、表達(dá)目的基因基因克隆的表達(dá)原核、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)比較：=1\*GB3①原核表達(dá)系統(tǒng)：優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)樸，容易操作成本低，易于大量生產(chǎn)生長周期短缺陷：需要翻譯后修飾的蛋白，不能用此表達(dá)系統(tǒng)=2\*GB3②真核表達(dá)系統(tǒng)：A、優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)需要翻譯后修飾的蛋白（糖基化）B、缺陷：表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜成本高生長周期長第七節(jié)基因表達(dá)的分析1、（Northernblothybridization）：=1\*GB3①定義：指DNA-RNA雜交，應(yīng)用特異性基因探針分析基因轉(zhuǎn)錄水平=2\*GB3②環(huán)節(jié)：提取組織、細(xì)胞總RNA→提純分離mRNA→瓊脂糖凝膠電泳分離RNA→轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜→雜交檢測(cè)RT-PCR定量分析實(shí)時(shí)RT-PCR定量分析基因功能的分析1、基因打靶：通過同源重組定向地從細(xì)胞染色體上移除或移入特定基因的過程。基因敲除KO：定向移除特定基因；基因敲入KI定向移入特定基因基因改造：改變基因序列中的特定堿基。第二十一章基因診斷基因的改變才是導(dǎo)致各種表型改變，進(jìn)而引起疾病的主線因素第一節(jié)基因診斷概述基因病：?jiǎn)位虿。喝绲刂泻Ｘ氀?、血友病、白化??；多基因?。喝缣悄虿　⒏哐獕?、哮喘；染色體?。喝缦忍煊扌巍⒇埥芯C合癥；線粒體病：如Leber遺傳性視神經(jīng)病、肌陣攣性癲癇伴碎紅纖維?。∕ERRF）；體細(xì)胞遺傳?。喝缒[瘤；獲得性遺傳?。喝缫恍└腥拘约膊。℉BV、AIDS）基因診斷的概念：基因診斷（genediagnosis）是以DNA或RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法與過程?；蛟\斷的基本原理：檢測(cè)DNA或RNA的結(jié)構(gòu)變化與否，量的多少及表達(dá)功能是否正常，以擬定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為基因診斷的依據(jù)。也就是檢測(cè)DNA或RNA質(zhì)和量的變化。常用技術(shù)：PCR技術(shù)、核酸分子雜交、DNA序列分析,、遺傳多態(tài)性分析（涉及RFLP、STR、SNP分析）等基因診斷技術(shù)的方法學(xué)基因診斷技術(shù)方法：運(yùn)用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析的間接診斷方法；直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常的直接診斷方法。運(yùn)用遺傳標(biāo)志連鎖分析間接檢測(cè)遺傳病：=1\*GB3①連鎖是指同一條染色體上相鄰近的基因一起被遺傳。=2\*GB3②連鎖分析就是運(yùn)用與致病基因相連的某些基因作為遺傳標(biāo)志，通過鑒定遺傳標(biāo)志的存在來判斷個(gè)體是否帶有致病基因。=3\*GB3③遺傳標(biāo)志特點(diǎn)：A、不同個(gè)體之間存在高度的多態(tài)性；B、需要獲得足夠數(shù)量的家系成員樣本；C、標(biāo)志基因與致病基因相連鎖，兩者之間的距離盡也許靠的近，減少重組或互換現(xiàn)象導(dǎo)致的錯(cuò)誤診斷。多態(tài)性：是指在一個(gè)特定的基因位座上，存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的等位基因，且其中任何一個(gè)在人群中的頻率大于1%（如小于1%常認(rèn)為是異常突變）。連鎖遺傳標(biāo)記：=1\*GB3①第一代遺傳標(biāo)記—限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP)：當(dāng)DNA序列的差異發(fā)生在限制性內(nèi)切酶的辨認(rèn)位點(diǎn)時(shí)使基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶水解發(fā)生片段數(shù)目改變時(shí)稱為點(diǎn)多態(tài)性，而當(dāng)DNA片段的插入、缺失或反復(fù)致使基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶水解發(fā)生片段長度改變時(shí)稱為序列多態(tài)性。（亨廷頓舞蹈癥（Huntington）成為第一個(gè)使用RFLP定位的遺傳?。?2\*GB3②第二代遺傳標(biāo)記—短串聯(lián)反復(fù)序列(STR)（采用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP)）=3\*GB3③第三代遺傳標(biāo)記—單核苷酸多態(tài)性(SNP)（直接以序列的變異作為標(biāo)記）遺傳病致病突變的直接診斷：點(diǎn)突變的診斷、小片段缺失或插入的診斷、基因大片段缺失或插入的診斷、動(dòng)態(tài)突變的診斷6、點(diǎn)突變的診斷：=1\*GB3①等位基因特異性寡核苷酸分子雜交：前提條件：被測(cè)點(diǎn)突變的確切位置及其基因序列已闡明分別合成野生型和突變型探針雜交如苯丙酮尿(Phenyketonuria，PKU)是由苯丙氨酸羥化酶(PAH)的遺傳性缺陷=2\*GB3②反向點(diǎn)雜交：多個(gè)點(diǎn)突變的篩查=3\*GB3③DNA芯片：指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交。超微化、高度集成、信息貯存量大原位合成芯片、DNA微集陣列=4\*GB3④單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP)：DNA變性形成單鏈，在中性條件下長度相同的單鏈DNA，假如堿基組成和(或)排列順序不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了SSCP=5\*GB3⑤變性高效液相色譜分析技術(shù)7、小片段缺失或插入的診斷大片段缺失或插入的診斷：Southern印跡雜交、gap-PCR動(dòng)態(tài)突變的診斷：代表疾?。篐utington舞蹈病(CAG)n、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良，脆性X綜合征(CGG)n。腫瘤特異性基因：肝癌—甲胎蛋白（AFP），結(jié)腸癌—癌胚抗原（CEA）腫瘤相關(guān)病毒的基因：鼻咽癌—EB，宮頸癌—HPVDNA指紋：高度的特異性、遺傳穩(wěn)定性、體細(xì)胞穩(wěn)定性二十三章基因治療基因治療（genetherapy）：指以改變?nèi)说倪z傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)治療。即通過一定方式將正常基因或有治療作用的DNA片段導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以矯正或置換致病基因的治療方法。針對(duì)的是疾病的根源——異常的基因自身。首例基因治療:ADA-缺少的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)基因治療的策略和基本程序基因治療可修復(fù)錯(cuò)誤基因或干預(yù)異常表達(dá)的基因：=1\*GB3①基因治療方案：:將正?；?qū)牖颊咛囟ǖ陌屑?xì)胞中表達(dá)以填補(bǔ)基因缺失或突變導(dǎo)致的功能缺陷，或采用特定方式關(guān)閉、克制異常表達(dá)基因=2\*GB3②基本方式：基因置換（最抱負(fù)）（genereplacement）：a、定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。b、目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正c、對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變B、基因增補(bǔ)（最常用）（geneaugmentation）：定義：不刪除突變的致病基因，而在基因組的某一位點(diǎn)額外插入正常的基因，在體內(nèi)表達(dá)出功能正常的蛋白質(zhì)，達(dá)成治療疾病的目的，又稱基因添加。目前基因治療多采用此法類型：在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，補(bǔ)償缺陷基因的功能；在原有基因表達(dá)水平局限性以滿足機(jī)體需要的情況下，異位過表達(dá)來增強(qiáng)體內(nèi)某些功能。增強(qiáng)機(jī)體免疫力的基因治療C、基因干預(yù)（geneinterference）：定義：指采用特定的方式克制某個(gè)基因的表達(dá)方法：采用反義RNA、核酶、小干擾RNA、肽核酸等來克制或阻斷基因的表達(dá)靶基因往往是過度表達(dá)的癌基因或病毒基因基因治療的基本程序：=1\*GB3①治療性基因的選擇和獲?。篈、選擇：如對(duì)于血管栓塞性疾病