轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理及應(yīng)用

RNA測(cè)序技術(shù)原理及應(yīng)用2021/5/91遺傳的中心法則基因組—轉(zhuǎn)錄組—表觀遺傳組—蛋白組層次2021/5/92什么是轉(zhuǎn)錄組？All

transcripts

All

mRNAs2021/5/93RNA是解讀基因組的關(guān)鍵RNAProteinPhenotypeGenotype

DNA2021/5/94測(cè)序技術(shù)RNA-SeqSmallRNA測(cè)序降解組測(cè)序Non-codingRNA測(cè)序研究對(duì)象mRNASmallRNAmRNANon-codingRNA鑒定新分子OOOO表達(dá)譜研究OOOO基因結(jié)構(gòu)分析O/XXXOEST測(cè)序O/XXXX

篩選分子標(biāo)記

OOOX轉(zhuǎn)錄融合基因表達(dá)O/XXXXRNA測(cè)序技術(shù)2021/5/95WorkflowofRNA-Seq樣品檢測(cè)文庫(kù)制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析2021/5/96TotalRNA樣品檢測(cè)

Agilent2200檢測(cè)OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

新型安捷倫2200TapeStation

系統(tǒng)是新一代測(cè)序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質(zhì)純化和抗體生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)生物樣品進(jìn)行質(zhì)量控制（QC）的理想解決方案?！?/p>

可擴(kuò)展的通量—16聯(lián)或96孔微量滴定板●

快速得到結(jié)果—平均每個(gè)樣品只需一分鐘便可獲得結(jié)果●

使用簡(jiǎn)單—可直接使用的ScreenTape預(yù)制膠條簡(jiǎn)化了工作流程●

樣品用量少—每次運(yùn)行僅需要不到2ul樣品2021/5/97檢測(cè)報(bào)告-合格樣品棉鈴蟲(chóng)/果蠅2021/5/98檢測(cè)報(bào)告-不合格樣品2021/5/99WorkflowofRNA-Seq樣品檢測(cè)文庫(kù)制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析2021/5/910真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過(guò)的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過(guò)MPC（磁分離器）從溶液中分離出來(lái)。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠+生物素標(biāo)記Oligo（dT）25+poly（A）2021/5/911原核mRNA的純化AmbionMICROExpressKitLNA扣鎖型探針2021/5/912mRNA反轉(zhuǎn)錄---fragment+RT純化過(guò)的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應(yīng)。加入沉淀劑（NaAc糖原無(wú)水乙醇）沉淀產(chǎn)物。RTdscDNA2021/5/913末端修復(fù)(防止自連）cDNA3′末端加AAdapter連接2021/5/914第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復(fù)↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓文庫(kù)制備↓↓文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)：Aligent2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測(cè)：跑膠驗(yàn)證。2021/5/915WorkflowofRNA-Seq樣品檢測(cè)文庫(kù)制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析2021/5/916ApplicationRNA-Seq(單端測(cè)序---Quantification)RNA-Seq

(雙端測(cè)序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofRNA-Seq172021/5/917RNA-Seq(Transcriptome)2021/5/918WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome)生物信息學(xué)分析2021/5/919RNA-Seq(Transcriptome)CharacterizethetranscriptomeinunparalleleddetailTechnique220RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)2021/5/920RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)文庫(kù)構(gòu)建測(cè)序組裝2021/5/921Denovoassembleatranscriptome組裝流程2021/5/922數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測(cè)序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評(píng)估組裝結(jié)果分析（Contig長(zhǎng)度分布、Scaffold長(zhǎng)度分布、Unigene長(zhǎng)度分布）Unigene（transcript）功能注釋Unigene的GO分類(lèi)Unigene代謝通路分析預(yù)測(cè)編碼蛋白框（CDS）Unigene表達(dá)差異分析（兩個(gè)或兩個(gè)以上樣品）Unigene在樣品間的差異GO分類(lèi)（需兩個(gè)或兩個(gè)以上樣品）和Pathway富集性分析Denovoassemblytranscriptome信息分析主要內(nèi)容：2021/5/923Denovoassemblytranscriptome信息分析流程2021/5/924Unigenes的GO注釋2021/5/925Pathway分析2021/5/926RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)cDNA文庫(kù)構(gòu)建測(cè)序比對(duì)到參考序列2021/5/927Transcriptomeresequencing比對(duì)流程2021/5/928比對(duì)統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)注釋基因差異表達(dá)分析基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接分析預(yù)測(cè)新轉(zhuǎn)錄本cSNP分析Transcriptomeresequencing信息分析主要內(nèi)容2021/5/929Transcriptomeresequencing信息分析流程2021/5/930應(yīng)用---優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組注釋信息基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接鑒定基因融合鑒定RNA水平SNP分析2021/5/931GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistribution優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)

鑒定新的轉(zhuǎn)錄本Paired-End(PE)ReadsReads比對(duì)到參考序列基因間區(qū)域2021/5/932鑒定可變剪接（AlternativeSplicing）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA2021/5/933鑒定基因融合PairedReadsSingleReadsGeneAGeneB2021/5/934分析RNA水平SNP轉(zhuǎn)錄組重測(cè)序比對(duì)軟件：SOAPDenovo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序:組裝軟件：SoapDenovo比對(duì)軟件：SoapSNP2021/5/93536轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)橫向比較TechnologyTilingArraycDNAorESTsequesingTranscriptomeSequencingPrincipleHybridizationSangersequencingNext-GensequencingResolutionFromseveralto100SinglebaseSinglebaseThroughputHighLowHighRelianceongenomicsequenceYesNoInsomecasesBackgroundnoiseHighLowLowApplicationSimutaneouslymaptranscribedregionsandgeneexpressionYesLimitedforexpressionYesDynamicrangetoquantifygeneexpressionlevelUptoafew-hundredfoldNotpractical>8,000-foldAbilitytodistinguishdifferentisoformsandallelicexpressionLimitedYesYes2021/5/936轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的優(yōu)勢(shì)RNA測(cè)序與芯片檢測(cè)基因數(shù)比較RNA測(cè)序與芯片檢測(cè)基因的表達(dá)量分布Technique12021/5/937GenomeRes2010Case

實(shí)驗(yàn)材料收集：

葉片，花序,果實(shí),根時(shí)間點(diǎn)：0,4,8,12,16,20和24h將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的樣品均勻混合測(cè)序策略：

Illumina測(cè)序，1Gdata2021/5/9381.Highlight2.Heat3.Cold4.Salt5.Drought抗逆相關(guān)可變剪接2021/5/939外包膜蛋白16(AT2G28900)Intron-retentionControlLowTemperatureResistance低溫脅迫相關(guān)的AS低溫脅迫下這個(gè)內(nèi)含子和對(duì)照相比被保留了下來(lái)，揭示了可變剪接有重要功能。2021/5/940AS調(diào)節(jié)機(jī)制CCA1生物鐘相關(guān)基因，例如調(diào)節(jié)氣孔的開(kāi)關(guān)等2021/5/941RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）等同于數(shù)字表達(dá)譜(DGE)2021/5/942WorkflowofRNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）生物信息學(xué)分析2021/5/943RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）生物信息分析內(nèi)容測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估篩選差異表達(dá)基因表達(dá)模式聚類(lèi)分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析2021/5/944RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）信息分析流程2021/5/945RNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點(diǎn)比較技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)RNA-seq1）檢測(cè)基因數(shù)比基因芯片多25%2）定量準(zhǔn)，可重復(fù)性高（重復(fù)相關(guān)系數(shù)≥0.99）3）數(shù)字化信號(hào)，無(wú)背景噪音，無(wú)交叉雜交4）高、低豐度基因均可檢測(cè)5）不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測(cè)6）數(shù)據(jù)可與時(shí)俱進(jìn)，即隨數(shù)據(jù)庫(kù)更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容1）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎(chǔ)，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊(yùn)含的豐富信息基因芯片1）平臺(tái)應(yīng)用較早2）信息分析軟件較多3）有些平臺(tái)要求樣品量少1）檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差、檢測(cè)閾值較狹窄2）有背景噪音，假陽(yáng)性率＞1%3）受物種限制，只能檢測(cè)部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無(wú)法檢測(cè)出低豐度基因5）只能檢測(cè)已知轉(zhuǎn)錄本，無(wú)法檢測(cè)出新轉(zhuǎn)錄本6）受數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)設(shè)計(jì)的，可能出現(xiàn)注釋不準(zhǔn)確的情況2021/5/946casePlantPhysiology2010取樣：

選取在成熟季節(jié)開(kāi)花后

5,10,和15個(gè)星期葡萄分別代表葡萄果實(shí)成熟中的三個(gè)時(shí)期（postsetting,ve′raison和ripening）數(shù)據(jù)量：超過(guò)59Mreads數(shù)據(jù)，長(zhǎng)度在36-44bp之間運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)對(duì)葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中復(fù)雜轉(zhuǎn)錄特征的研究。2021/5/947表二reads在基因組上的分布情況表一

測(cè)序數(shù)據(jù)葡萄RNA-Seq單端測(cè)序2021/5/948漿果發(fā)育三個(gè)階段共有、特有基因表達(dá)分布圖基因表達(dá)量分布2021/5/949表達(dá)簇的分類(lèi)分布情況差異表