RT-PCR相關知識及操作的總結(jié)

RT-PCR相關知識及操作的總結(jié)RT-PCR(RealtimePolymeraseChainReaction)即實時定量PCR。實時監(jiān)測，由于PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，所以稱為定量的依據(jù)。與常規(guī)PCR相比，RT-PCR的優(yōu)點：實時監(jiān)測（在對數(shù)擴增時期）而不是終點檢測；敏感度高；需要樣品少；特異性高；精確定量。一、RT-PCR的反應條件1.反應液（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。DNA模板一般100ng/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。（2）引物濃度0.1-0.5mol/L。濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。（引物設計：a序列應位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列；b引物長度以15-40bp為宜；c堿基盡可能隨機分布,G+C占40-60%；d引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)；e兩引物間避免有互補序列；f引物3’端為關鍵堿基；5’端無嚴格限制。）（3）TaqDNA聚合酶0.5-2.5U/50l。酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產(chǎn)量。（4）dNTP（10mMor2.5mM）含四種核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP；dNTP濃度取決于擴增片段的長度；濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應產(chǎn)量；dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。濃度為0.5-2.5mmol/L。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結(jié)合,所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。目前，市場上有各種試劑盒，可按其protocol進行添加。2.循環(huán)參數(shù)（1）變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈；94℃，30-60秒(2)退火溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應的靈敏性。（3）延伸70-75℃,一般為72℃。延伸時間由擴增片段長度決定。PCR2.Taqman探針法3.分子信標4.各種方法的應用比較三、熒光RT-PCR技術的應用絕對定量2.相對定量四、RT-PCR反應性的確認五、Ct值引物二聚體1.引物二聚體的產(chǎn)生原因比較多，其中很重要的一個就是引物自身的原因，也就是設計的引物特異性不好，不能有效的和模板進行結(jié)合，而出現(xiàn)引物自身配對結(jié)合的情況導致二聚提的出現(xiàn)；其次還可能是PCR體系及反應條件的問題，如果PCR體系中引物、鎂離子以及酶濃度過高等，都容易產(chǎn)生二聚體，這時要適當降低濃度，比如20uLPCR體系中，一般10pmol/ul的引物，加0.2ul就可以了；還有可能是退火溫度的問題，可以做個梯度PCR或降落PCR，來摸索一個合適的退火溫度，也可有效地減少二聚提的出現(xiàn)。

2、雜帶的出現(xiàn)在很大程度上來源于兩個方面：一是引物的特異性問題，包括引物的長度和與模板的匹配度等。二就是退火溫度的問題，一般適當提高退火溫度可有效地減少非特異性擴增，從而減少雜帶的出現(xiàn)。

3.一般來說減少雜帶的方法有：熱啟動PCR(加熱啟動酶或先把PCR儀預熱）、提高退火溫度、做降落PCR(每個循環(huán)降低0.5度）、降低底物濃度、降低鎂離子濃度、減少循環(huán)次數(shù)等；其次，有些共溶劑（甲酰胺，DMSO）和添加劑（氯化四甲銨，谷氨酸鉀，硫酸銨）能夠降低高水平的錯誤引導與提高富含G+C模板的擴增效率。另外還需要注意一些細節(jié)問題，如PCR反應體系的最好在冰上配制，Taq酶最后加，PCR結(jié)束后產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時間等。4.RT中非特異性條帶的產(chǎn)生和解決：a.從引物自身著手，重新設計引物，這是最根本解決這一問題的辦法；b.可能模板有問題（可能cDNA有降解，這里我考慮你用的2步法）；c.模板濃度過小，適當加大模板量；d.降低退火溫度后有條帶，則應逐漸提高溫度，若提高溫度的同時產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴增片斷長度而定，片段長則相應鎂離子濃度應該高一些）；e.若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mmol/l沒有區(qū)別，則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導致吸取的