毛細(xì)管電泳原理

毛細(xì)管電泳原理作者：admin發(fā)表時(shí)間：2008-8-2814:55:41閱讀：次毛細(xì)管電泳原理毛細(xì)管電泳基本原理分離的原因：電泳遷移，電滲遷移電泳遷移：在高壓電場(chǎng)下，帶電離子向相反的方向移動(dòng)。電滲遷移：當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)充滿緩沖溶液時(shí)，毛細(xì)管壁上的硅羥基發(fā)生解離，生成氫離子溶解在溶液中，這樣就使毛細(xì)管壁帶上負(fù)電荷與溶液形成雙電層，在毛細(xì)管的兩端加上直流電場(chǎng)后，帶正電的溶液就會(huì)整體的向負(fù)極端移動(dòng)，這就形成了電滲流。cE在操作緩沖溶液中，帶電粒子的運(yùn)動(dòng)速度等于電泳速度和電滲速度的矢量和，電滲速度一般大于電泳速度，因此即使是陰離子也會(huì)從陽(yáng)極端流向陰極端。加大緩沖溶液的酸度、在緩沖溶液中加入有機(jī)試劑都會(huì)減少硅羥基的解離，減小電滲流分離模式毛細(xì)管電泳的分離模式有以下幾種。（1） 毛細(xì)管區(qū)帶電泳將待分析溶液引入毛細(xì)管進(jìn)樣一端，施加直流電壓后，各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細(xì)管出口端，按陽(yáng)離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小的順序通過(guò)檢測(cè)器。中性組分彼此不能分離。出峰時(shí)間稱為遷移時(shí)間，相當(dāng)于高效液相色譜和氣相色譜中的保留時(shí)間。（2） 毛細(xì)管凝膠電泳在毛細(xì)管中裝入單體和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)生成凝膠，這種方法主要用于分析蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子。另外還可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的篩分作用進(jìn)行分析，稱為毛細(xì)管無(wú)膠篩分。有時(shí)將它們統(tǒng)稱為毛細(xì)管篩分電泳，下分為凝膠電泳和無(wú)膠篩分兩類。（3） 毛細(xì)管等速電泳采用前導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，在毛細(xì)管中充入前導(dǎo)電解質(zhì)后，進(jìn)樣，電極槽中換用尾隨電解質(zhì)進(jìn)行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個(gè)狹窄的區(qū)帶，然后依次通過(guò)檢測(cè)器。（4） 毛細(xì)管等電聚焦電泳將毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆聚合物減小電滲流，再將樣品和兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣，兩個(gè)電極槽中分別加入酸液和堿液，施加電壓后毛細(xì)管中的操作電解質(zhì)溶液逐漸形成pH梯度，各溶質(zhì)在毛細(xì)管中遷移至各自等電點(diǎn)時(shí)變?yōu)橹行孕纬删劢沟膮^(qū)帶，而后用壓力或改變檢測(cè)器末端電極槽儲(chǔ)液的pH值的辦法使溶質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器。（5） 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜當(dāng)操作緩沖液中加入大于其臨界膠束濃度的離子型表面活性劑時(shí)表面活性劑就聚集形成膠束，其親水端朝外憎水非極性核朝內(nèi)，溶質(zhì)則在水和膠束兩相間分配，各溶質(zhì)因分配系數(shù)存在差別而被分離。對(duì)于常用的陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉，進(jìn)樣后極強(qiáng)親水性組分不能進(jìn)入膠束，隨操作緩沖液流過(guò)檢測(cè)器（容量因子k'=0）；極強(qiáng)憎水性組分則進(jìn)入膠束的核中不再回到水相，最后到達(dá)檢測(cè)器（k'=8）。其他常用的膠束試劑還有陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基三甲基漠化銨，膽酸等。（6） 毛細(xì)管電色譜將細(xì)粒徑固定相填充到毛細(xì)管中或在毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆固定相以電滲流驅(qū)動(dòng)操作緩沖液（有時(shí)再加輔助壓力）進(jìn)行分離。以上分離模式（1）和（5）使用較多。（5）和（6）兩種模式的分離機(jī)理以色譜為主，但對(duì)荷電溶質(zhì)則兼有電泳作用。操作緩沖液中加入各種添加劑可獲得多種分離效果。如加入環(huán)糊精、衍生化環(huán)糊精、冠醚、血清蛋白、多糖、膽酸鹽或某些抗生素等，可拆分手性化合物；加入有機(jī)溶劑可改善某些組分的分離效果，以至可在非水溶液中進(jìn)行分析。毛細(xì)管電泳原理及在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用中國(guó)色譜網(wǎng)（2007-12-2114:16:29）文章作者：未知高效毛細(xì)管電泳（HPLC）亦即毛細(xì)管電泳（CE），是一種發(fā)展迅猛的新型的分離分析技術(shù)，與常用的高效液相色譜法（HPLC）相比，具有分析時(shí)間短，分離效率高，適應(yīng)性廣，檢測(cè)限低，進(jìn)樣量小，溶劑消耗少，自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，近十多年來(lái)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、氨基酸、無(wú)機(jī)離子、有機(jī)化合物、藥物的分離分析，在生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域倍受青睞。本文簡(jiǎn)要介紹HPLC的基本原理、特點(diǎn)及在化學(xué)藥品分析、中藥分析、生物制品分析研究方面的應(yīng)用，并展望其在藥學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景。1、HPCE的基本原理高效毛細(xì)管電泳（highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種分離、分析技術(shù)，它是凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展，是高效液相色譜分析的補(bǔ)充。該技術(shù)可分析的成分小至有機(jī)離子、大至生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等?？捎糜诜治龆喾N體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，HPLC分析高效、快速、微量［1］。1-1電泳遷移不同分子所帶電荷性質(zhì)、多少不同，形狀、大小各異。一定電解質(zhì)及PH的緩沖液或其它溶液內(nèi)，受電場(chǎng)作用，樣本中各組分按一定速度遷移，從而形成電泳。電泳遷移速度（v）可用下式表示：v=uE其中E為電場(chǎng)強(qiáng)度（E=V/L，V為電壓，L為毛細(xì)管總長(zhǎng)度）。u為電泳淌度。1-2電滲遷移電滲遷移指在電場(chǎng)作用下溶液相對(duì)于帶電管壁移動(dòng)的現(xiàn)象。特殊結(jié)構(gòu)的熔合硅毛細(xì)管管壁通常在水溶液中帶負(fù)電荷，在電壓作用下溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，形成電滲流。帶電微粒在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)際移動(dòng)的速度為電泳流和電滲流的矢量和。1-3分離分析類型根據(jù)其分離樣本的原理設(shè)計(jì)不同主要分為以下幾種類型:①毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis，CZE）；②毛細(xì)管等速電泳（capillarychromatography，CITP）；③毛細(xì)管膠速電動(dòng)色譜（micellerelectrokineticcapillarychromatographyMECC）；④毛細(xì)管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）；⑤毛細(xì)管等電聚焦（capillaryisoelectricfocusing，CIEF）。毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）為HPCE的基本操作模式，一般采用磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液，實(shí)驗(yàn)條件包括緩沖液濃度、PH值、電壓、溫度、改性劑（乙腈、甲醇等），用于對(duì)帶電物質(zhì)（藥物、蛋白質(zhì)、肽類等）分離分析，對(duì)于中性物質(zhì)無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離。毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC）為一種基于膠束增溶和電動(dòng)遷移的新型液體色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑作為膠束劑，利用溶質(zhì)分子在水相和膠束相分配的差異進(jìn)行分離，拓寬了CZE的應(yīng)用范圍，適合于中性物質(zhì)的分離，亦可區(qū)別手性化合物，可用于氨基酸、肽類、小分子物質(zhì)、手性物質(zhì)、藥物樣品及體液樣品的分析。毛細(xì)管等速電泳（CITP）采用先導(dǎo)電解質(zhì)和后繼電解質(zhì)，構(gòu)成不連續(xù)緩沖體系，基于溶質(zhì)的電泳淌度差異進(jìn)行分離，常用于離子型物質(zhì)（如有機(jī)酸），并因適用較大內(nèi)徑的毛細(xì)管而可用于微制備，但本法空間分辨率較差。毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF）用于具兼性離子的樣品（蛋白質(zhì)、肽類），等電點(diǎn)僅差0.001可分離的物質(zhì)。毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）依據(jù)大分子物質(zhì)的分子量大小進(jìn)行分離，主要用于蛋白質(zhì)、核苷酸片段的分離。此外，還有毛細(xì)管電色譜CEC）及非水毛細(xì)管電泳（CNACE），用于水溶性差的物質(zhì)和水中難進(jìn)行反應(yīng)的分析研究。目前CZE和MECC用得較多，本文以這兩種方法為例來(lái)說(shuō)明HPLC的原理。1-3-1CZE的基本原理HPLC選用的毛細(xì)管一般內(nèi)徑約為50|jm（20?200|jm），外徑為375|jm，有效長(zhǎng)度為50cm（7?100cm）。毛細(xì)管兩端分別浸入兩分開(kāi)的緩沖液中，同時(shí)兩緩沖液中分別插入連有高壓電源的電極，該電壓使得分析樣品沿毛細(xì)管遷移，當(dāng)分離樣品通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行分析處理。HPLC進(jìn)樣一般采用電動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣（低電壓）或流體力學(xué)進(jìn)樣（壓力或抽吸）兩種方式。在毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中，帶電溶質(zhì)在電場(chǎng)作用下發(fā)生定向遷移，其表觀遷移速度是溶質(zhì)遷移速度與溶液電滲流速度的矢量和。所謂電滲是指在高電壓作用下，雙電層中的水合陰離子引起流體整體地朝負(fù)極方向移動(dòng)的現(xiàn)象；電泳是指在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象。溶質(zhì)的遷移速度由其所帶電荷數(shù)和分子量大小決定，另外還受緩沖液的組成、性質(zhì)、PH值等多種因素影響。帶正電荷的組份沿毛細(xì)管壁形成有機(jī)雙層向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的組分被分配至毛細(xì)管近中區(qū)域，在電場(chǎng)作用下向正極移動(dòng)。與此同時(shí)，緩沖液的電滲流向負(fù)極移動(dòng)，其作用超過(guò)電泳，最終導(dǎo)致帶正電荷、中性電荷、負(fù)電荷的組份依次通過(guò)檢測(cè)器。3-2MECC的基本原理MECC是在CZE基礎(chǔ)上使用表面活性劑來(lái)充當(dāng)膠束相，以膠束增溶作為分配原理，溶質(zhì)在水相、膠束相中的分配系數(shù)不同，在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管中溶液的電滲流和膠束的電泳，使膠束和水相有不同的遷移速度，同時(shí)待分離物質(zhì)在水相和膠束相中被多次分配，在電滲流和這種分配過(guò)程的雙重作用下得以分離。MECC是電泳技術(shù)與色譜法的結(jié)合，適合同時(shí)分離分析中性和帶電的樣品分子】2］。2、HPLC在各類藥物中的應(yīng)用藥品是與人們生命息息相關(guān)的特殊商品，檢驗(yàn)其真?zhèn)位蛸|(zhì)量的優(yōu)劣，需要先進(jìn)、快速、準(zhǔn)確的定性和定量手段。因此，HPCE分析技術(shù)很快即被藥物分析工作者在藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域迅速推廣應(yīng)用［3、4］。國(guó)內(nèi)自1989年起曾有學(xué)者報(bào)道，但研究和應(yīng)用實(shí)例不多。近1?2年發(fā)展迅速，并取得了顯著成績(jī)。1化學(xué)藥品分析化學(xué)藥品結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、清楚，常規(guī)分析方法能基本解決定性、定量和純度控制等問(wèn)題。但有些結(jié)構(gòu)特異（如手性對(duì)映體結(jié)構(gòu)）或性質(zhì)特殊的品種，現(xiàn)代分析手段從靈敏度、分辨率和分析速度等方面，仍有一些難點(diǎn)°HPCE技術(shù)的特點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)，恰恰彌補(bǔ)和解決了某些分析手段的不足。應(yīng)用實(shí)例有單體，也有復(fù)方制劑：＜BR＞牛長(zhǎng)群等】5］用HPCE法，50mmol.l-1緩沖液（ph8.3），分離測(cè)定了氨芐青霉素的聚合物。大部分樣品以開(kāi)環(huán)和閉環(huán)的二聚物為主要聚合體，可對(duì)多個(gè)組分進(jìn)行定量，以控制此類致敏成分對(duì)氨芐青霉素的質(zhì)量影響。李關(guān)賓等［6］用自制的CE-電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)VC、VB1和VB6的CZE和MECC的分離與檢測(cè)表明，在0.01mol.l-1NH3-NH4CL介質(zhì)中，檢測(cè)電勢(shì)510?540mV，3種維生素均得到較好的分離和CZE圖譜。李小戈等采用MECC，Na2B4O2-SD緩沖體系，4min內(nèi)對(duì)5種水溶性維生素VC、VB1、VB2、VB6和VB12進(jìn)行了有效分離，分辨率高，重現(xiàn)性好，令人滿意。廉經(jīng)武等［7］以B環(huán)糊精的兩種衍生物作CE的手性分離添加劑，對(duì)鹽酸美西律的對(duì)映體進(jìn)行分析。其中，2,6-0—二甲基B—環(huán)糊精可將對(duì)映體部分拆分，而用三甲基環(huán)糊精作手拆添加劑時(shí)，則可使對(duì)映體定量達(dá)到基線分離。俞琦等［8］用HPLC和二極管陣列檢測(cè)器，環(huán)糊精為拆分劑，含DM—p-CD40mmol-L—1.KH2P0470mmol-L—1（pH2.5）的緩沖劑，對(duì)氧氟沙星對(duì)映體進(jìn)行了優(yōu)化分離。張文江等［9］采用HPLC模式，選用4X10%—2mmol?L—1Tris—H2P04（pH3.6）—6.5x10—2mol-L—1g—環(huán)糊精，分離了海南新堿衍生物HH07A異構(gòu)體，并應(yīng)用于肝微粒體中代謝的查體選擇性研究。孫發(fā)山等［10］用HCZE模式，50mmol?L—1磷酸鹽緩沖液（pH9°67），取血漿直接進(jìn)樣測(cè)定復(fù)方頭孢氨芐膠囊中頭孢氨芐的含量，只需樣品5Ml，10min內(nèi)一次完成，方法非常適合血藥濃度檢測(cè)。劉新宇等［11］以茶堿為內(nèi)標(biāo)，用KH2P04—硼酸緩沖系統(tǒng)（PH8.5），建立了泰諾復(fù)方感冒片中撲熱息痛、鹽酸偽麻黃堿、氫漠酸美沙芬、馬來(lái)酸撲熱息痛和苯甲酸鈉5種成分的含量測(cè)定方法，10min完成定量。2-2中藥分析中藥品種繁多、藥材產(chǎn)地各異、成分復(fù)雜，無(wú)論是藥材還是成藥的分析，都是一項(xiàng)非常艱難的任務(wù)。中藥分析工作用現(xiàn)代化儀器設(shè)備和科技手段（如薄層色譜、HPLC等）雖取得巨大進(jìn)展和成就，但往往只是對(duì)藥材和成藥成百上千個(gè)成分中的一個(gè)或幾個(gè)成分的分析，實(shí)際只是一種象征性的代表式分析，與之起化學(xué)和藥理效應(yīng)的實(shí)際組合成分（起碼是有效成分）相比，仍有相當(dāng)大的距離。隨著CE技術(shù)對(duì)中藥材及其有效成分的鑒別與分析的快速發(fā)展，建立在此基礎(chǔ)上的中成藥成分的定性、定量分析已有進(jìn)展，且有希望解決長(zhǎng)期困擾中藥質(zhì)量控制中的重大難題。近年，報(bào)道HPCE分析中藥材已有18種、成藥70種和有效成分120個(gè)以上。LiuYM等采用CEC模式，85%0.1mol?L—1的乙酸鈉緩沖液加15%甲醇作流動(dòng)相，13min內(nèi)分離黃連中的小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、非洲防己胺、藥根堿、加倫巴胺、木蘭花堿、黃連次堿。用50%0.2mol?L—1乙酸鈉加50%乙腈作流動(dòng)相，8min可內(nèi)分離黃連中的黃連次堿、小檗堿和巴馬亭。張國(guó)華等［12］則用65%NaH2PO4緩沖液加35%甲醇作流動(dòng)相，分離了黃連中小檗堿、巴馬汀和藥根堿等7種生物堿°LiuYM等還用磷酸緩沖液5mmol、Ba（OH）2和20mmol異亮胺酸作緩沖液，pH10條件下10min分離了麻黃中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、去甲基麻黃堿和去甲偽麻黃堿。改用10mmol?L—1頡胺酸作緩沖液時(shí)，僅用3min即分離了麻黃堿和偽麻黃堿°LiKL和ShenSJ以膽酸鈉作膠束，用MECC模式成功地分離測(cè)定了黃苓和黃連混合物中的黃連次堿、小壁堿、表小壁堿和巴馬亭4種生物堿及黃苓素等6種黃酮。又在20mmol?L—1SDS10mmol?L—1NaH2PO4系統(tǒng)中，加入12.5mmol?L—1硼砂，25min內(nèi)分離了黃苓中漢黃苓素、漢黃苓素一7一。一葡萄糖甙、貝加因、貝加靈、木蝴蝶素A和木蝴蝶素A7—O—葡萄糖甙酸。宋玉英等［13］在25mmol?L—1SDS中，加入25mmol?L—13—環(huán)己氨基一1一丙基磺酸—乙月青作改性劑，分離測(cè)定了大黃、蘆薈中的大黃素、大黃酸等。國(guó)外有人用等束單電泳分離了大黃和番茄葉中的蒽醍類番茄甙A和B的含量°Chen等［14］用MECC模式，50%20mmol?L—1磷酸二氫鈉加20%乙月青，pH7.5,10min分離了甘草中甘草酸和甘草次酸。Iwagami則在0.lmol?L—l—SDS硼砂、磷酸緩沖系統(tǒng)中加入膽酸鈉，25min