項(xiàng)目15-1 蛋黃中免疫球蛋白的提取

項(xiàng)目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

給雞注射液疫苗，能大大提高雞蛋中1g的活性，并有抑制4種腸道菌的作用。

雞的免疫：腸素Ecoli(ETEC)菌株H1047在37℃培養(yǎng)18h后，加入0.4%的甲醛溶液48h后滅活，離心，沉淀，用PBS洗滌，重復(fù)三四次后，把收集的菌體凍干并儲(chǔ)存于同樣的緩沖液中。上述的抗原懸浮液（2×109個(gè)菌體/mL）與等體積的不完全Freund’s試劑相混勻，即為注射試劑，用8只25周齡的蛋雞，在每只雞的翼處4個(gè)不同處注射。每隔2周注射1次，共3次，每日收集雞蛋備用。項(xiàng)目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

1．Ig分離

取1體積的蛋黃加4體積的蒸餾水混合均勻后于4℃靜止8h，然后在12000r/min下冷凍離心15min，取上清液，加入19%的Na2SO4，緩慢攪拌1h后，在同樣條件下離心、沉淀，用PBS懸浸（1mg/mL），在4℃下對(duì)PBS透析8h。然后上DEAE-纖維素柱，分離得到免疫球蛋白。項(xiàng)目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

2．活性檢測(cè)方法

用Ecoli細(xì)胞懸浮液（108個(gè)/mL）包被酶聯(lián)反應(yīng)板，4℃下吸附過夜。然后用0.1%的PBS-TN洗滌，加入稀釋好的IgG樣品。37℃下溫育3h，洗滌后每孔加入堿性磷酸脂酶（sigma）。37℃下溫育2h，再洗滌后每孔加入100μL底物，37℃下溫育0.5h。觀察顏色變化，加入2mol/L的NaOH終止反應(yīng)，在405nm下用酶聯(lián)閱讀儀進(jìn)行測(cè)試。IgG的活性越高，儀器上反應(yīng)出來的OD值相應(yīng)也越高。項(xiàng)目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

2．活性檢測(cè)方法

免疫球蛋白抑制試驗(yàn)是將免疫球蛋白PHS稀釋至2mg/mL，然后和細(xì)菌懸浮液（106個(gè)Ecoli/mL）混合。用未加Ig的菌液做空白對(duì)照。在37℃培養(yǎng)，分別在1h、3h、7h、12h取樣，平板計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，空白對(duì)照液在12h后，大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌4種菌液的生長濃度均達(dá)到109/mL，而加入Ig菌液12h后，四種菌液中添加免疫球蛋白對(duì)四種腸道致病菌的生長起到明顯的抑制作用。項(xiàng)目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

2．活性檢測(cè)方法

經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)免疫過與未免疫過的雞蛋中的Ig活力，結(jié)果前者的OD值明顯高于后者。免疫過的雞蛋中的Ig濃度稀釋16～32倍以后，OD值和未免疫過的雞蛋中的Ig相同?？梢姡瑥拿庖哌^的雞蛋中提取的Ig活性有很大的提高。體外模擬實(shí)驗(yàn)：在pH2.8，溫度3