染色體工程操作

關于染色體工程操作第1頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第2頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體變異染色體結構變異染色體易位：一個染色體上某一區(qū)段與另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換。染色體缺失：染色體的某一區(qū)段及其帶有的基因一起丟失染色體倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉。染色體重復：一個染色體上增加了相同的某個區(qū)段。第3頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體變異染色體數(shù)變異一是體細胞內以染色體組為基數(shù)進行的整倍性變化，以整倍體染色體數(shù)目變化產生的變異會產生多倍體和單倍體；另一種是染色體組內的個別染色體數(shù)目有所增減，使細胞內的染色體數(shù)目不是基數(shù)的的完整倍數(shù)，因此被稱為非整倍體。第4頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是染色體工程？染色體工程（chromosomeengineering）是人們按照一定的設計，有計劃地消減、添加或代換同種或異種染色體，從而達到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術。第5頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月人工誘導多倍體雌、雄核發(fā)育染色體顯微操作技術染色體介導的基因轉移技術人工染色體第6頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)人工誘導多倍體多倍體（polyploid）這個名詞是由Winkler（1916年）首先使用的，它是指每個體細胞中含有三個或更多染色體組的個體而言。染色體組成多倍性現(xiàn)象在高等植物中相當多，但動物界的多倍體現(xiàn)象卻少得多。自從60年代發(fā)現(xiàn)一種美洲角蛙是一個確定的四倍體動物以來，學者們陸續(xù)在低等脊椎動物中發(fā)現(xiàn)許多多倍體動物，包括魚類、兩棲類和爬行類。第7頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月由于多倍體動物具有生長速度快，成活率高及抗病能力強等特點，所以人工誘導多倍體、改善動物經濟性狀倍受重視。第8頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、人工誘導多倍體的方法生物學方法Rasch等（1965）年首次證明了三倍體脊椎動物可以通過雜交產生，他們將雌核發(fā)育的二倍體帆鱂（Poeciliaformosa）與P.Vittate雜交，得到三倍體后裔。雌性草魚（2n=48）與雄性三角魴（2n=48）雜交獲得子一代染色體數(shù)目為72的草魴雜種三倍體，其中草魚提供了二倍數(shù)目的染色體（48），三角魴提供了單倍數(shù)目的染色體（24）。第9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月異育銀鯽與興國紅鯉雜交獲得的復合四倍體，通過細胞方法證明其產生的原因是受精卵發(fā)生了兩性融合。為什么種間雜交會導致第二極體不排出，從而導致多倍體產生？第10頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月人工誘導多倍體的方法物理學方法溫度休克法：包括冷休克法和熱休克法兩種，即用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來誘導三倍體或四倍體的方法。此法廉價、易操作，是誘導動物細胞多倍體化的常用手段，也有利于養(yǎng)殖場大規(guī)模生產使用。第11頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月水靜壓法：就是采用較高的水靜壓（65kg/cm2）來抑制第二極體的放出或第一次卵裂產生多倍體。此種方法誘導率高（90%~100%）、處理時間短（3~5min），對受精卵損傷小、成活率高。但該法需要專門的設備——水壓機，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產。第12頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月人工誘導多倍體的方法化學方法細胞松馳素B：能抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而抑制細胞質分裂。秋水仙堿：可以抑制細胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。其它藥物：N2O和聚乙二醇等。第13頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、多倍體倍性鑒定的方法核體積測量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。蛋白質電泳：生化分析：如在關東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍體。染色體計數(shù)：是鑒定多倍性的一個準確的直接方法。DNA含量測定：流式細胞儀。第14頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體直接計數(shù)法準確、直接，但費時；紅細胞體積測量法省時、簡單，在生產現(xiàn)場就能進行而廣為人們采用，但缺乏準確性，亦測不出嵌合體，往往需要校正；DNA含量測定法是較為先進常用的方法，其測定快速準確，并能測出嵌合體，但需要特殊的儀器設備。第15頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、多倍體動物的應用及發(fā)展趨勢多倍體動物的生活力及生長能力。許多誘導的多倍體動物如兩棲類、魚類、貝類等都具有良好的生存力和生長率。誘導三倍體可以增加種間雜種的成活率，三倍體種間雜種可以比二倍體雜種成活得更好一些。第16頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月多倍體動物的性腺發(fā)育及其應用三倍體預期是不育的，許多實驗也都證明了這一點。生產上可以利用這個不育特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動物生長上，避免因繁殖季節(jié)及肉質下降而延誤上市時間或影響商品價值，也避免了生長停滯和死亡率的增高，縮短了養(yǎng)殖周期、減少了養(yǎng)殖成本，可養(yǎng)成大型個體。與三倍體不同，四倍體是可育的。目前如何大量誘導四倍體并培育至性成熟，爾后與正常二倍體雜交獲得不育的三倍體，進行三倍體育種是許多學者正在致力研究的課題。第17頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月多倍體動物的其它經濟性狀三倍體虹鱒的魚肉質量確實優(yōu)于二倍體，其抗傳染性造血器官壞死病毒能力較強；三倍體大西洋鮭耐低氧，故可適用于低氧環(huán)境養(yǎng)殖；三倍體香魚對聲音和光線的感受能力比二倍體香魚略顯遲鈍，適于在噪音較大的環(huán)境中放養(yǎng)。第18頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月四、多倍育種中存在的問題準確的處理時間；誘導率、成活率及孵化率的提高；準確可靠的倍性鑒定方法的確定。第19頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)雌、雄核發(fā)育雌核發(fā)育（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細胞核發(fā)育成個體的生殖行為。同種或異種精子進入卵內只起刺激卵子發(fā)育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質，其子代的遺傳物質完全來自雌核，只具有母本的性狀。雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經過紫外線、X射線或γ射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當時間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進入卵子內的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。第20頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月首先將兩個不同品系的近交系進行雜交。交配后，在精核與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內沖取受精卵，并用極細的吸管將精核去掉。在細胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細胞。二倍體細胞在體外培養(yǎng)到囊胚期后，移植到養(yǎng)母的子宮內，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。第21頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、人工誘導雌核發(fā)育的方法精子遺傳物質的失活：物理方法：采用物理輻射如γ射線、X射線和紫外線等處理精子使精子的遺傳物質失活?；瘜W方法：采用化學物質如甲苯胺藍、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色體遺傳活性的方法。顯微手術法：采用顯微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。第22頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月人工誘導雌核發(fā)育的方法雌核染色體的二倍化溫度休克法流體靜水壓法化學試劑處理如細胞松馳素B第23頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、雌核發(fā)育的鑒別形態(tài)生化細胞學第24頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、雌核發(fā)育的意義雌核發(fā)育具有產生單性種群的能力。雌核發(fā)育能迅速地產生同源型二倍體克隆。廣泛地用于進行基因——著絲點的定位研究。第25頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)染色體顯微操作技術染色體的分離染色體的微切割第26頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體分離的基本原理由于熒光染料Hoechst只對A-T特異性染色，而染料Chromomycin只對G-C特異性染色。染色體上DNA的堿基序列是不同的，因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結合的量和比例是不同的。結合這些染后，再經激光照射，染色體就會呈現(xiàn)不同的熒光帶。將特定染色體發(fā)出的熒光波長輸入計算機，通過計算機控制就可將發(fā)出同一波長的染色體收集在一起，從而實現(xiàn)染色體的分離。第27頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞分裂同步處理染色體的熒光色素染色染色體的分離第28頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體微切割最常用的方法有兩種微細玻璃針切割法：采用特細的玻璃針（尖端直徑約為0.17μm）在倒置顯微鏡下對目的基因所在染色體區(qū)段進行切割與分離。顯微激光切割法：將染色體標本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)皿上制作，利用激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)，依靠高能量激光照射非選擇細胞或染色體，使其受熱蒸發(fā)，最后只留下目的染色體。第30頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)染色體介導的基因轉移技術將同特定基因表達有關的染色體或染色體片段轉入受體細胞，使該基因得以表達，并能在細胞分裂中一代又一代地轉遞下去。該技術稱為染色體介導的基因轉移技術，又稱為染色體轉導。微細胞介導的基因轉移法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色體介導的基因轉移法（Chromosomemediatedgenetransfer，CMGT）第31頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月微細胞介導的基因轉移法微細胞是指含有一條或幾條染色體，外有一薄層細胞質和一個完整質膜的核質體。第32頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月微細胞制備微細胞融合第33頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月微細胞的制備第34頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月微細胞的融合第35頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體介導轉移法染色體介導轉移法是指分離得到相應的染色體后轉入受體細胞的一種技術。染色體介導技術一般包括首先誘發(fā)細胞同步分裂，繼而用秋水仙胺阻斷細胞分裂于中期，再破碎細胞，通過離心收集大量的中期染色體，然后通過適當?shù)姆植炕蜻M一步的分類，即可轉移到受體細胞中去。第36頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月分離染色體染色體的轉移受體細胞的分離與鑒定第39頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、細胞同步化與染色體的分離第40頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、中期染色體的轉移第41頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、導入基因的受體細胞的分離與鑒定分離：利用選擇性培養(yǎng)基進行篩選。鑒定：第42頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體轉移技術的應用前景第43頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體轉移技術的應用前景第44頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)人工染色體染色體要確保在細胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復制和向子細胞中平均分配。它需要3個關鍵序列，包括自主復制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）、著絲粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN)和端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）。第45頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

將3個關鍵序列用分子生物學方法拼接起來就得到人造微小染色體（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結構與功能關系等研究中得到了廣泛的應用，具有極為重要的價值。目前，正在研究或應用的有：酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳動物人工染色體(mammalianartificialchromosome)。第46頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

基于ARS、CEN、T