植物病原細(xì)菌研究方法

關(guān)于植物病原細(xì)菌研究方法第1頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容提綱：細(xì)菌的基本形態(tài)特征常規(guī)細(xì)菌生理生化檢測方法細(xì)菌種類鑒定方法植物病原細(xì)菌檢測和細(xì)菌病害診斷方法有益細(xì)菌的利用研究第2頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

細(xì)菌的基本形態(tài)特征

細(xì)菌（bacteria）是單細(xì)胞原核微生物，個體微小，形態(tài)簡單，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，細(xì)菌分布最廣、數(shù)量最多。第3頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌的形態(tài)和大小細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)菌的繁殖與群體形態(tài)第4頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）細(xì)菌的大小細(xì)菌大小的測定：(1)測量：

測微尺(2)長度單位：微米(μm)(3)表示：

球菌：直徑桿菌：

寬×長

螺菌：

寬、長、螺距第5頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

通常球菌直徑：0.2—

1.5

μm，

桿菌:長1—5μm,寬0.5—1μm。例如：大腸桿菌：平均長度：2μm；寬度0.5μm

1500個大腸桿菌頭尾相接等于3mm;109個大腸桿菌重1mg.

由于菌種不同，細(xì)菌的大小存在很大的差異；對于同一個菌種，細(xì)胞的大小也常隨著菌齡變化。另外，對于同一個菌種染色前后其細(xì)胞大小都有所不同。所以，有關(guān)細(xì)菌大小的記載，常是平均值或代表性數(shù)值。第7頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

菌名

直徑或?qū)挕灵L

（μm×μm）乳鏈球菌金黃色葡萄球菌大腸桿菌枯草芽孢桿菌霍亂弧菌

0.5~10.8~10.5×(1~3)(0.8~1.2)×(1.2~3)(0.2~0.6)×(1~3)

細(xì)菌細(xì)胞的大小第8頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）、細(xì)菌的形態(tài)

不同細(xì)菌的形態(tài)可以說是千差萬別，豐富多彩，但就單個有機(jī)體而言，其基本形態(tài)可分為球狀、桿狀與螺旋狀三種.

除了球菌、桿菌、蛆旋菌三種基本形態(tài)外，還有許多具其他形態(tài)的細(xì)菌。例如柄桿菌細(xì)胞上有柄、菌絲、附器等細(xì)胞質(zhì)伸出物，細(xì)胞呈桿狀或梭狀，并有特征性的細(xì)柄；球衣菌能形成衣峭，桿狀的細(xì)胞呈鏈狀排列在衣鞘內(nèi)而成為絲狀,而支原體由于只有細(xì)胞膜，沒有紉胞壁，故細(xì)胞柔軟，形態(tài)多變，具有高度多形性。另外，人們還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞呈星形和方形的細(xì)菌。第9頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

球狀、桿狀和螺旋狀細(xì)菌的三種基本形態(tài):

第10頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月1.球菌單球菌雙球菌鏈球菌四聯(lián)球菌八疊球菌

葡萄球菌第11頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月2.桿菌

桿菌是細(xì)菌中種類最多的類型,因菌種不同,菌體細(xì)胞的長短、粗細(xì)等都有所差異。

桿菌的形態(tài)：短桿狀、長桿狀、棒桿狀、梭狀、梭桿狀、月亮狀、分枝狀、竹節(jié)狀等；按桿菌細(xì)胞的排列方式則有鏈狀、柵狀、“八”字狀以及有鞘衣的絲狀等。第12頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月2.桿菌短桿菌長桿菌梭狀芽孢桿菌第13頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鏈狀桿菌單桿菌2.桿菌第14頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月桿菌細(xì)胞兩端的形態(tài)特征2.桿菌第15頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月3、螺旋菌

螺旋狀的細(xì)菌稱為螺旋菌。

根據(jù)其彎曲情況分為：

弧菌：螺旋不滿一圈，菌體呈弧形或逗號形

例：霍亂弧菌、逗號弧菌

螺旋菌：螺旋滿2—6環(huán)，螺旋狀

例：干酪螺菌

螺旋體：旋轉(zhuǎn)周數(shù)在6環(huán)以上，菌體柔軟。

例：梅毒密螺旋體第16頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月螺旋菌弧菌螺旋體3、螺旋菌第17頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

細(xì)菌的特殊形態(tài)：

柄細(xì)菌、腎形菌、臂微菌、網(wǎng)格硫細(xì)菌、貝日阿托氏菌(絲狀)、具有子實體的粘細(xì)菌、三角形、方形等特殊形態(tài)的細(xì)菌。第18頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

細(xì)菌的特殊形態(tài)第19頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月二、細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)包括：

細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核區(qū)、間體、核糖體、氣泡和儲藏物。

特殊結(jié)構(gòu)包括：莢膜、鞭毛、纖毛、芽孢。

第20頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)第21頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月1.固體斜面培養(yǎng)2.液體培養(yǎng)基

3.半固體培養(yǎng)第22頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病原細(xì)菌概述

絕大多數(shù)為好氣性細(xì)菌；生長溫度大多為25-28℃，少數(shù)可以20℃或在35℃中（如青枯菌）生長。植物病原細(xì)菌都不產(chǎn)生芽孢，因此對高溫比較敏感，一般在50℃左右的熱水中處理10分鐘即失活，適宜的pH為6-7。第23頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病原細(xì)菌的革蘭氏染色（細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類鑒定的一個重要特征）常規(guī)細(xì)菌生理生化檢測方法第24頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁：由肽聚糖和磷壁酸組成

磷壁酸：占40%。G+菌所特有,其主鏈由數(shù)十個磷酸甘油或磷酸核糖醇組成,有的還有由D—Ala和還原糖組成的側(cè)鏈。

肽聚糖:占30~70%,不同菌種中肽聚糖(肽鏈)組分不同。第25頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁：分內(nèi)壁層和外壁層。

內(nèi)壁層：緊貼胞膜,僅由1—2層肽聚糖分子構(gòu)成,占細(xì)胞壁干重5-10%,無磷壁酸。外壁層：位于肽聚糖層的外部。脂多糖;

脂蛋白、

包括:蛋白質(zhì)層:基質(zhì)蛋白、

外壁蛋白;

磷脂.第26頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色的原理第27頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色原理：第一步：結(jié)晶紫使菌體著上紫色；第二步：碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細(xì)胞壁阻留在細(xì)胞內(nèi)；第三步：酒精脫色，細(xì)胞壁成分和構(gòu)造不同，出現(xiàn)不同的反應(yīng)；G+菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當(dāng)乙醇脫色時，肽聚糖因脫水而孔徑縮小，故結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被阻留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞不能被酒精脫色，仍呈紫色；Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，因其含脂量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，酒精將細(xì)胞脫色，細(xì)胞無色，沙黃復(fù)染后呈紅色。第28頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

革蘭氏染色法是細(xì)菌細(xì)胞的復(fù)合染色法，由丹麥醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立?；静襟E：

涂片固定——

結(jié)晶紫初染1min——

碘液媒染1min——95%乙醇脫色0.5min——

番紅復(fù)染min

結(jié)果:

革蘭氏陽性菌——紫色；

革蘭氏陰性菌——紅色。①革蘭氏染色法：第29頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗材料待測細(xì)菌枯草芽孢桿菌（G+）甘藍(lán)黑腐病菌（G-）染液：結(jié)晶紫草酸銨染劑、魯戈爾碘液、復(fù)染劑（番紅O）用具：移植餌、清潔無脂載玻片第30頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月清潔無脂載玻片陽性對照菌（紫色或藍(lán)黑色）待測菌陰性對照菌（紅色）示范圖對照菌呈現(xiàn)正確顏色，實驗才為成功第31頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月涂片干燥固定染色1min水洗、吸干鏡檢簡單染色制備涂片標(biāo)本→染色第32頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月陽性菌陰性菌①革蘭氏染色法第33頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色陰性——大腸桿菌第34頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色陽性——枯草芽孢桿菌第35頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

注：

（1）、實驗細(xì)菌為活躍生長期的培養(yǎng)物；

（2）、菌液不能太濃，涂片不宜過厚，造成假陽性；

（3）、火焰固定涂片，以載玻片不燙手為宜；

（4）、脫色時間把握好，過長，假陰性；過短，假陽性。第36頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鞭毛：某些細(xì)菌表面由細(xì)胞內(nèi)生出的細(xì)長、波曲、毛發(fā)狀的結(jié)構(gòu)。鞭毛具有運(yùn)動功能，一般認(rèn)為鞭毛靠鞭毛絲旋轉(zhuǎn)而動，它們是細(xì)菌的“運(yùn)動器官”。鞭毛的長度：一般為15—20μm，最長可達(dá)70μm。鞭毛的直徑：為0.01—0.02μm.不同細(xì)菌的鞭毛數(shù)目和著生位置不同，鞭毛數(shù)目一般一至數(shù)十條。細(xì)菌鞭毛染色第37頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鞭毛的著生方式：周生第38頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鞭毛的化學(xué)組成：

主要由鞭毛蛋白構(gòu)成，還含有少量的多糖、脂類和核酸等。鞭毛起源于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的基粒。

細(xì)胞質(zhì)區(qū)內(nèi)有一個顆粒狀小體，此小體為基粒，鞭毛自基粒長出穿過細(xì)胞壁延伸到細(xì)胞外部。第39頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

鞭毛的結(jié)構(gòu)：

鞭毛絲鞭毛鞭毛鉤基體第40頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鞭毛的觀察：電鏡特殊鞭毛染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察半固體穿刺培養(yǎng)從固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)判斷一般情況下：菌落形狀大，薄且不規(guī)則，邊緣極不平整，可能有鞭毛。菌落十分圓滑，邊緣平整且相對較厚，可能沒有鞭毛。第41頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

實驗菌種及藥品

1．菌種：枯草芽孢桿菌

2．染液

染液A：

單寧酸5.0g

氯化鐵（Fecl36H2O）1.5g

福爾馬林（15％）2.0ml（15%福爾馬林：40%甲醛4ml+蒸餾水6ml）

NaOH(1%)1.0ml

蒸餾水100ml

染液B：

硝酸銀2g蒸餾水100ml第42頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月三、染色方法：銀鹽染色法

硝酸銀溶于蒸餾水中。取10ml作回滴用，向其余90ml硝酸銀溶液中逐滴加濃氫氧化銨，先形成很濃的沉淀，再繼續(xù)滴加濃氫氧化銨至沉淀消失為止。然后慢慢滴入備用的硝酸銀溶液則出現(xiàn)少量霧狀沉淀，但輕輕搖動后，沉淀又消失，再滴入硝酸銀溶液，直到搖動后霧狀沉淀不再消失為止。此液不耐保存，4小時內(nèi)染色效果最佳。第43頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月四、鞭毛染色步驟：

（1）將菌株在NA斜面上于30℃恒溫箱中培養(yǎng)17-20小時，取出，沿壁管輕輕加入3-5ml的滅菌水掩蓋斜面菌苔。斜放靜置10分鐘，使細(xì)菌自然游出，勿搖動，備用。

（2）用移植環(huán)取菌懸液于無劃痕的無脂玻片上，傾斜玻片，使之成帶狀，將玻片在空氣中自然風(fēng)干。

（3）滴加染液A于干燥的涂片上，覆蓋涂片，染色10-13分鐘，傾去染液，用蒸餾水充分洗去染液；風(fēng)干后，再滴加染液B覆蓋涂片染色30秒至1分鐘，立即用蒸餾水沖洗，放于空氣中干燥，在高倍鏡或油鏡下鏡檢。

（4）在金色背景下，細(xì)菌鞭毛深褐色到黑色，菌體淺褐色。

第44頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌體鞭毛第45頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌體鞭毛第46頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌體鞭毛第48頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢概念：某些菌生長到一定階段，細(xì)胞內(nèi)形成一個圓形、橢圓形或卵圓形的內(nèi)生孢子，是對不良環(huán)境有較強(qiáng)抵抗力的休眠體。

芽孢第49頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月能形成芽孢的細(xì)菌種類：

在桿菌中能形成芽孢的種類較多，在球菌和螺旋菌中只有少數(shù)菌種可形成芽孢。產(chǎn)生芽孢的幾個屬：芽孢桿菌屬梭狀芽孢桿菌屬芽孢乳桿菌屬生孢八疊球菌屬（其中的一個種）第50頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢的形態(tài)及其在細(xì)胞中的位置：

A近中央

B末端

C中央第51頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

細(xì)菌芽孢的各種類型第52頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢的組成和結(jié)構(gòu)

芽孢有多層結(jié)構(gòu)，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮層和核心.芽孢的結(jié)構(gòu)芽孢的外壁層厚而致密，主要成分為脂蛋白，通透性差,不易著色。核心含有大量的DNA、RNA、蛋白質(zhì)酶等物質(zhì)，還含有2,6—吡啶二羧酸（DPA）,DPA是芽孢特有的成分。一般以DPA—Ca的形式存在。皮層主要含芽孢肽聚糖、DPA—Ca，皮層體積大，比較致密。芽孢平均含水量低,約40%.第53頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢的特性:具有很強(qiáng)的抗熱、抗干燥、抗輻射、抗化學(xué)藥物能力。含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易著色。新陳代謝幾乎停止，處于休眠狀態(tài)。一個芽孢萌發(fā)產(chǎn)生一個個體。芽孢的抗熱機(jī)制：

目前尚不清楚，但可能與以下因素有關(guān)，如含水量低、壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比較耐熱。第54頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢染色（孔雀綠藏紅染色）

染劑Ⅰ孔雀綠水溶液5％染劑Ⅱ

藏紅水溶液0.5％或堿性品紅水溶液0.05％染色方法：

1、涂片固定；

2、加染劑Ⅰ在酒精燈火焰上加熱染色1min，勿使染液沸騰和干燥；

3、水洗；

4、染劑Ⅱ染色15s；

5、水洗，風(fēng)干后鏡檢。菌體染成紅色，芽孢染成綠色。第55頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢菌體第56頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月常規(guī)鑒定方法全自動微生物鑒定儀--Biolog

植物病原細(xì)菌的鑒定方法第57頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌落特征比較

常規(guī)細(xì)菌鑒定方法參考：東秀珠等，常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊，科學(xué)出版社，2001第58頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第59頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月全自動微生物鑒定儀--Biolog鑒定原理

Biolog公司獨(dú)創(chuàng)的碳源利用方法，利用微生物對不同碳源代謝率的差異，針對每一類微生物篩選95種不同碳源，配合四唑類顯色物質(zhì)（如TTC、TV），固定于96孔板上（A1孔為陰性對照），接種菌懸液后培養(yǎng)一定時間，通過檢測微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化（吸光度）以及由于微生物生長造成的濁度差異（濁度），與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，即可得出最終鑒定結(jié)果。

第60頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第61頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月主要特點(diǎn)

·快速讀取結(jié)果

鑒定板由讀數(shù)儀自動讀取吸光值，軟件將該吸光值與數(shù)據(jù)庫對比，就可在瞬時給出鑒定結(jié)果。試驗結(jié)果可由系統(tǒng)進(jìn)行自動分析、記錄和打印。

·強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫

Biolog微生物鑒定數(shù)據(jù)庫容量是目前世界上最大的，可鑒定包括細(xì)菌、酵母和絲狀真菌在內(nèi)總計1973種微生物，幾乎涵蓋了所有的人類、動物、植物病原菌以及食品和環(huán)境微生物。第62頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月BIOLOG在植物病原菌鑒定方面

可鑒定常見的假單胞菌(Pseudomonas,77種)、伯克霍爾德菌(Burkholderia)、黃單孢菌屬(Xanthomonas)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、食酸菌屬(Acidovorax)、根瘤菌屬(Rhizobium)等近200種植物致病菌，特別適合各農(nóng)業(yè)大學(xué)、研究所及相關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)行植物病理分析和研究用。

第63頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月BIOLOG在食品工業(yè)應(yīng)用及研究領(lǐng)域提供大量的數(shù)據(jù)庫，包括70多種乳酸菌、30多種雙歧桿菌及各類常見的食品必檢的致病菌數(shù)據(jù)庫，包括沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌(含阪崎腸桿菌)、葡萄球菌、彎曲菌、假單胞菌、弧菌、梭菌、志賀氏菌等，用于食品、藥品及化妝品行業(yè)用于致病微生物鑒定、工業(yè)應(yīng)用微生物研究、質(zhì)量控制及產(chǎn)品研發(fā)等。第64頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月BIOLOG專門分開提供一個DP(危險微生物)數(shù)據(jù)庫，包含鼠疫耶爾森氏菌、炭疽芽胞桿菌、馬爾他布魯氏菌、土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌(鼻疽假單孢菌)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、蘇云金芽孢桿菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、蠟樣芽胞桿菌等12種強(qiáng)致病微生物，適用于國家疾病控制中心、國家安全機(jī)構(gòu)及軍事機(jī)構(gòu)用于生物武器檢測及防治研究。目前廣泛用于美國軍方進(jìn)行生物恐怖檢測及預(yù)防研究。第65頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鑒定初始首先按常規(guī)微生物操作方法分離出純種。第66頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鑒定步驟如下：

第一步

用Biolog專用培養(yǎng)基將純種擴(kuò)大培養(yǎng)。

第二步

按要求配制一定濁度(細(xì)胞濃度)的菌懸液。

第三步

將菌懸液接種至微孔鑒定板(Microplate)，培養(yǎng)一定時間。

第四步

將培養(yǎng)后的鑒定板放入讀數(shù)儀中讀數(shù)，軟件自動給出鑒定結(jié)果。第67頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第68頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第69頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第70頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病原細(xì)菌檢測和細(xì)菌病害診斷方法第71頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月一、癥狀特征第72頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第73頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第74頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第75頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月十字花科軟腐病第76頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月瓜萎蔫病第77頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月腫瘤第78頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

由細(xì)菌侵染所致病害的病部，無論是維管束系統(tǒng)受害的，還是薄壁組織受害的，都可以在徒手切片中看到有大量細(xì)菌從病部噴出，這種現(xiàn)象稱為菌溢現(xiàn)象(bacteriaexudation，BE)。菌溢現(xiàn)象為細(xì)菌病害特有，是區(qū)分細(xì)菌病害或真菌、病毒病害的最簡便的手段之一。二、顯微鏡檢查（菌溢現(xiàn)象）第79頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌溢現(xiàn)象操作方法細(xì)菌病害的病組織，內(nèi)含有大量菌體，可通過菌溢現(xiàn)象或診斷，具體方法：①取病健組織交界部位一小塊，置于截玻片上。②加一滴無菌水后，加蓋玻片。③低倍鏡下，暗光，觀察。④可看到病斑切口處有大量細(xì)菌云霧狀涌出。第80頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌溢現(xiàn)象第81頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第82頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月1、凝集反應(yīng)

顆粒性抗原如細(xì)菌與其特異性抗體在電解質(zhì)影響下，很快結(jié)合成可見的凝集塊。

載玻片凝集反應(yīng)是最快速的測定方法：在清潔載玻片上加兩滴生理鹽水配的菌懸液，用移植環(huán)取少量抗血清與其中一滴菌懸液混合，另一滴不加血清作為對照。經(jīng)3~5分鐘，可以看到原來均勻懸浮的細(xì)菌凝集成團(tuán)，對照則不發(fā)生這種變化。另一種常用方法是試管凝集反應(yīng)，雖然沒有玻片凝集反應(yīng)快捷，但能測定血清效價和作定量研究。

分子生物學(xué)檢測技術(shù)第83頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月2、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzymelinkedimmunesorbentassay,ELISA）

該方法是將微量的酶與測定的抗原或抗體結(jié)合，大大的提高抗原和抗體反應(yīng)的靈敏度?？贵w夾心ELISA法通常比其他ELISA方法敏感2－5倍。先用抗體包被聚苯乙烯微量滴定板孔，然后加測定抗原樣本，抗原被抗體吸附，然后將酶聯(lián)抗體加在被吸附的抗原上。最后再加酶的底物，酶催化底物而顯色，用分光光度計檢測。

第84頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第85頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第86頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第87頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月4、核酸雜交及PCR診斷技術(shù)

第88頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

利用核酸鏈間堿基配對––––核酸雜交來識別特定核酸順序的方法。將一個預(yù)先分離純化或合成的已知核酸序列片段，加以標(biāo)記，就成為核酸探針(probe)。用核酸探針可以探測待查標(biāo)本核酸中與探針具有互補(bǔ)的堿基順序。如果兩者有互補(bǔ)順序則雜交成功,結(jié)果陽性;若待查標(biāo)本核酸與探針順序無關(guān)則雜交失敗,結(jié)果呈陰性。由于大多數(shù)植物病毒的核酸是RNA,其探針為互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDNA)，稱為cDNA探針。4.1核酸雜交第89頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸雜交第90頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月4.2PCR診斷技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction,PCR）是一種體外擴(kuò)增特異性DNA的技術(shù)，在短時間內(nèi)可以大量擴(kuò)增核酸。整個擴(kuò)增包括3個重復(fù)的步驟：（1）DNA熱變性，雙鏈變單鏈；（2）引物退火，當(dāng)溫度降低時，兩個引物分別結(jié)合到靶DNA的兩條鏈的3'末端，（3）引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物由5'3'擴(kuò)增延長。分別和相對的DNA鏈互補(bǔ)。第91頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第92頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第93頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月Real-timefluorescentPCRREP-PCRImmuno-PCRRAPD-PCRNested-PCR

在植物病原細(xì)菌檢測和鑒定中應(yīng)用的PCR技術(shù)第94頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、分離培養(yǎng)與致病性測定

培養(yǎng)基稀釋法或劃線法培養(yǎng)。觀察單個菌落特點(diǎn)。將分離的細(xì)菌接種于寄主植物或過敏性發(fā)應(yīng)植物，觀察所得癥狀，從而完成柯赫氏法則的診斷程序。第95頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月四、鏈霉素防治

植物病原細(xì)菌對鏈霉素敏感，可用于防治細(xì)菌病害。第96頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月三、植物病原細(xì)菌的主要類群及分類地位五界生物分類系統(tǒng)，細(xì)菌屬于原核生物界。參考：《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌手冊》第97頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第98頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月四、主要屬

長期以來，植物病原細(xì)菌僅限于5個屬：

土壤桿菌屬（Agrobacterium）歐氏桿菌屬（Erwinia）假單胞桿菌屬（Pseudomonas）

黃單胞桿菌屬（Xanthomonas）棒形桿菌屬（Clavibacter）第99頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月五屬細(xì)菌分類檢索表A.革蘭氏染色陽性，一般不能游動……棒形桿菌屬（Clavibacter）AA.革蘭氏染色陰性，能游動。

B.鞭毛極生

C.鞭毛一般多條，在培養(yǎng)基上產(chǎn)生水溶性黃綠色或藍(lán)綠色色素……假單胞桿菌屬（Pseudomonas）

CC.鞭毛一般單條，在培養(yǎng)基上產(chǎn)生非水溶性色素……黃假胞桿菌屬（Xanthomonas）

BB.鞭毛周生

C.鞭毛1–4條，引起腫瘤……土壤桿菌屬（Agrobacterium）

CC.鞭毛多條，引致腐爛或萎蔫………………歐氏桿菌屬（Erwinia）第100頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月供試菌株革蘭氏反應(yīng)陽性桿菌或球菌形成絲狀細(xì)胞Streptomyces（鏈霉菌屬）形成芽孢36℃生長，在7％NaCl中生長Curtobacterium短小桿菌屬尿酶Rhodococcus紅球菌屬Clavibacter棒形桿菌屬革蘭氏反應(yīng)陰性不形成芽孢Bacillus芽孢桿菌屬；Clostridium梭狀芽孢桿菌屬+-+-植物病原細(xì)菌主要屬簡要檢查方法第101頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月好氧性或不活潑性滑行運(yùn)動，在瓊脂平板上鋪開生長，短或長桿形彎曲、氧化酶陽性以鞭毛游動在King‘sB培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光色素發(fā)酵性Cytophaga噬胞菌屬；Flexibacter屈橈桿菌屬+-革蘭氏反應(yīng)陰性不運(yùn)動，菌落光滑短桿狀、氧化酶陰性Flavobacterium黃桿菌屬溶果膠活性+-Erwinia（軟腐組群）Erwinia（不溶果膠組群）Pseudomonas（無熒光組群）在1％葡萄糖營養(yǎng)瓊脂上為白色菌落，周鞭，致瘤Agrobacterium土壤桿菌屬Xanthomonas黃單胞菌屬在1％葡萄糖營養(yǎng)瓊脂上為黃色菌落，單極鞭Pseudomonas（熒光組群）第102頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月有益細(xì)菌的利用研究第103頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月生物防治

利用其他對植物無害的生物來影響或抑制病原物的生存和活動，從而降低病害的發(fā)生率或嚴(yán)重度。（1）抗菌作用(antibiosis)（2）溶菌作用(lysis)（3）競爭作用(com