流式細(xì)胞儀檢測凋亡和細(xì)胞周期

關(guān)于流式細(xì)胞儀檢測凋亡和細(xì)胞周期第1頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是流式細(xì)胞儀●流式細(xì)胞儀實(shí)物BDFACSVantageBD-Calibur第2頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月1.發(fā)展歷史1934Moldavan1973Steinkamp一、

概述第3頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月2.定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標(biāo)記的細(xì)胞、粒子進(jìn)行分析和分選的技術(shù).3.特點(diǎn)測量速度快，每秒鐘能測數(shù)千個乃至上萬個細(xì)胞可進(jìn)行多參數(shù)測量在分析的同時可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來，即分選技術(shù)。第4頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月凡是能被熒光素標(biāo)記的細(xì)胞或顆粒都可用流式細(xì)胞儀檢測。前提這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源激發(fā)在生物檢測技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)多用的儀器。4.應(yīng)用范圍第5頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月二、流式細(xì)胞儀的工作原理和基本結(jié)構(gòu)待測細(xì)胞以單個細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動室。流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細(xì)胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機(jī)，軟件分析。第6頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月基本結(jié)構(gòu)流動室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機(jī)和分析系統(tǒng)。

第8頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月三、

流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細(xì)胞大小前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性第9頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月血液涂片第10頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖第11頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光信號熒光強(qiáng)度（FL）：細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱）一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。第12頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光信號與細(xì)胞特性

熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。

定量染色熒光信號大小被標(biāo)記組分含量的定量多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量第13頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月二色鏡

123帶通濾波片光電倍增管激光束細(xì)胞收集透鏡前向散射光側(cè)向散射光，熒光光信號分離，導(dǎo)向各探測通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。光信號收集第14頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月三數(shù)據(jù)處理及流式報告FSCSSCFL1FL2FL3對數(shù)

線性線性

線性

對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果（面積，峰高，寬度）第15頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月流式報告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn)圖和直方圖。幾個概念：%Gated：陽性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽性細(xì)胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強(qiáng)度，與被檢測物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)，在正態(tài)分布時一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽性細(xì)胞為偏態(tài)分布時一般用該值。第16頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月散點(diǎn)圖

密度圖二維等高圖直方圖圖報告中常見的幾種流式細(xì)胞圖第17頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月圖AnnexinV/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死第18頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析點(diǎn)圖分析第19頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析第20頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月圖中100～101（M1）為陰性細(xì)胞，101以上的（M2）為陽性細(xì)胞第21頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月

五、

流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……

細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位

……第22頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月一）細(xì)胞DNA含量檢測細(xì)胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個原理，可測出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測。

第23頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞，4N代表G2/M期細(xì)胞，兩者中間代表S期細(xì)胞。這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖第25頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細(xì)胞數(shù)量2N4N

第26頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體第28頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月含量與凋亡關(guān)系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處理時，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。第29頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月第31頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究

第32頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月1.腫瘤診斷DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標(biāo)志細(xì)胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特征利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷。第33頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體第34頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月2.凋亡研究在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。檢測調(diào)亡，可進(jìn)行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細(xì)胞的損傷機(jī)理的研究。第36頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月AnnexinVAssay

第38頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月圖AnnexinV/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死第39頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48

圖FCM測試細(xì)胞周期分布和凋亡第40頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)來檢測在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高、細(xì)胞體積變小；細(xì)胞膜皺折卷曲，但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞凋亡細(xì)胞的FSC？SSC？細(xì)胞壞死時，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？第41頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月CD3(T細(xì)胞，CD4、CD8))、CD19（B細(xì)胞）、CD16、CD56（NK細(xì)胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細(xì)胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測等。

三）淋巴細(xì)胞分類第42頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型

第45頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月

流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的免疫表型，了解被測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理研究等有重要價值。

四）白血病的免疫分型

第46頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月

五）細(xì)胞內(nèi)蛋白的分析：

細(xì)胞破膜后將細(xì)胞內(nèi)某一蛋白成分進(jìn)行熒光標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽性細(xì)胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。熒光探針多為FITC。第47頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光信號使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量第48頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光樣本制備雙色直接染色第49頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月

端粒（熒光蛋白）第50頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月

六）細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定1×106/ml的細(xì)胞懸液，加入終濃度為1-5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細(xì)胞儀檢測。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強(qiáng)度計算細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。第51頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、膜電位和線粒體功能第52頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎(chǔ)表達(dá)量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎(chǔ)水平、未受刺激時等。藍(lán)色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。第53頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月

六.分選：用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機(jī)一般分選速度為每秒鐘300個細(xì)胞，大型機(jī)分選速度可達(dá)到每秒上萬個細(xì)胞第54頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubes