廣西臨檢中心 微生物質量控制會議課件 臨床微生物實驗室質量控制胡繼紅南寧4.10

臨床微生物實驗室質量控制及質量保證衛(wèi)生部臨床檢驗中心胡繼紅2009.04.10

南寧臨床微生物實驗室作用需氧菌（兼性）

（苛養(yǎng)、TB、軍團）混合感染尋找、確認感染病原菌細菌

厭氧菌（內源性感染）微需氧菌（幽門螺桿菌、空腸彎曲菌）支原體真菌肺炎支原體、解脲尿原體念珠菌、隱球菌、霉菌感染控制/治療放線菌病毒（不能培養(yǎng)）指導治療耐藥監(jiān)測醫(yī)院內感染、社區(qū)感染藥敏試驗(細、真、結核、支)新藥驗證生物安全（消毒、滅菌、個人防護）臨床微生物學檢驗方法表型鑒定手工基礎性試驗商業(yè)化系統(tǒng)—自動、半自動、手工實驗室內手工鑒定體系鑒定基因鑒定（非常規(guī)方法）定性（S,I,R）：紙片擴散法手工定量（MIC）：微量肉湯法，E-test藥敏試驗儀器：稀釋法篩選方法（包括顯色培養(yǎng)篩選）確認方法：表型確認，基因型確認常見臨床感染部位病原菌檢出引起臨床常見感染的苛養(yǎng)菌分離培養(yǎng)條件質量控制（QC）概念的引入?

歷史上，現(xiàn)代風險管理的概念引入實驗室之后，就以質量控制的形式出現(xiàn)。?

狹義上指的是一項持續(xù)的、系統(tǒng)性的評估工作來確保終產品的一致性——根據(jù)可接受的程度：事先建立好的允許限度下的精確度和準確度。微生物學檢驗特點：定性試驗?

分離病原菌——生長、不生長?

鑒定中各種能源、物質的利用——陰性、陽性?

抗原抗體凝集反應——凝集(＋)/不凝集(－)?

藥敏結果——耐藥、敏感臨床微生物實驗室質量控制環(huán)節(jié)標本留取運送緊急報告分析后分析前標本合格判定培養(yǎng)基、試劑儀器設備《實驗室管理》基本要求分析中<<臨床實驗室管理辦法>>要求的室內質量控制內容一、培養(yǎng)基實驗室使用的所有培養(yǎng)基使用前應做無菌試驗，并按培養(yǎng)基的用途做生長試驗，或選擇性生長試驗，或耐藥篩選試驗等。無菌試驗：排除培養(yǎng)基生產、運輸和貯存過程的污染可能。生長試驗：檢驗培養(yǎng)基標本中可能存在的目標菌能否生長——分離培養(yǎng)的關鍵！解釋：培養(yǎng)基在使用前隨機挑選，培養(yǎng)1天，觀察是否污染。非選擇培養(yǎng)基（血平板、巧克力平板）選擇培養(yǎng)基（淋球菌培養(yǎng)基、麥康凱平板等）單管生化培養(yǎng)基、微量管生化培養(yǎng)基、苯唑西林耐藥篩選平板等無菌試驗：無菌生長為合格。培養(yǎng)基生長試驗自制培養(yǎng)基：每批做質控用菌株根據(jù)期望結果選擇確認要求生長特性（溶血、特征菌落等）選擇性（生長/不生長，淋球菌選擇培養(yǎng)基）加強營養(yǎng)（苛養(yǎng)菌、巧克力瓊脂）鑒定用生化反應（陰性、陽性，如：氧化/發(fā)酵，動力等）質控菌株的貯存日常用：

4-8℃,胰酶消化大豆肉湯（非苛養(yǎng)菌）；高營養(yǎng)巧克力瓊脂斜面（苛養(yǎng)菌），每周轉種。中期貯存：50％胎牛血清肉湯，脫纖維羊血或脫脂牛奶，10-15％甘油胰酶消化大豆肉湯，-20℃。長期貯存：凍干或液氮。成品商業(yè)培養(yǎng)基?

接收時記錄批號，接收日期；?

廠家提供質控文件，如實沿用氣體，培養(yǎng)時間長度，可接受的結果；?

使用的實驗室必須檢查外觀，破損、污染、溶血或凍壞情況；?

有效期內質量是否有變化必須做質控的商業(yè)培養(yǎng)基?

做藥敏試驗MH培養(yǎng)基巧克力瓊脂彎曲菌瓊脂淋球菌選擇培養(yǎng)基?

用于主要的微生物鑒定試劑盒中的培養(yǎng)基有兩種或更多的底物?

有相對高的失敗率?

廠家不做的羊血瓊脂CAMP?

細胞培養(yǎng)用二、主要試劑（至少）過氧化氫酶：

區(qū)別鏈球菌屬/葡萄球菌屬，少見G-菌、G+菌凝固酶:

區(qū)別金黃色葡萄球菌/凝固酶陰性葡萄球菌，藥敏標準致病性和用藥等都不同氧化酶：

G-菌區(qū)別，腸桿菌科/非發(fā)酵菌/弧菌科/少見G-菌等?β-內酰胺酶：預測流感嗜血桿菌、卡他布蘭漢菌和淋病奈瑟菌對青霉素類抗生素敏感性；葡萄球菌屬對青霉素敏感性。每個工作日或每次試驗應做質控（陽性對照及陰性對照）臨床意義過氧化氫酶，凝固酶，氧化酶是臨床常見菌鑒定非常重要的三個基本試驗，也是決定鑒定方向的重要指標;

β-內酰胺酶在判斷苛養(yǎng)菌流感嗜血桿菌、卡他布蘭漢菌和淋病奈瑟菌對青霉素、阿莫西林和氨芐西林的敏感性。具體要求應每個工作日做質控，或在檢測菌株時用相應的標準菌株作為陰性對照和陽性對照做質控。過氧化氫酶（H2O2）區(qū)別鏈球菌屬/葡萄球菌屬，少見G-菌、G+菌陽性對照：金黃色葡萄球菌ATCC25923陰性對照：糞腸球菌ATCC33186血漿凝固酶試驗玻片法：凝集因子

/試管法：凝固酶區(qū)別金黃色葡萄球菌/凝固酶陰性葡萄球菌藥敏標準致病性和用藥等都不同陽性對照：金黃色葡萄球菌ATCC25923陰性對照：表皮葡萄球菌ATCC12228氧化酶/β內酰胺酶β內酰胺酶試驗氧化酶試驗陽性對照：綠膿假單胞菌ATCC27853

陽性對照：金黃色葡萄球菌ATCC25923陰性對照：大腸桿菌ATCC25922

陰性對照：流感嗜血桿菌ATCC29247葡萄球菌對青霉素的敏感性(CLSI/NCCLS)?

當抑菌環(huán)直徑在折點邊緣，不易判斷用β-內酰胺酶檢測青霉素敏感性更可靠！其他常用基本試驗OP：

肺炎鏈球菌S/其他草綠色鏈球菌R桿菌肽：化膿鏈球菌S/其他β-溶血鏈球菌R流感嗜血桿菌：X、V分別都不生長，X+V因子：生長CAMP：無乳鏈球菌（+）其他β-溶血鏈球菌（-）其他嗜血桿菌屬：X生長或V生長三、自制生化鑒定試劑舉例：實驗室自制的常規(guī)生化鑒定大管或微量管培養(yǎng)基（鏈球菌、葡萄球菌、腸桿菌科和弧菌科/非發(fā)酵菌等）具體要求每批試劑使用前應使用相應陰性和陽性反應（標準）菌株做質控；合格后，注明批號，在一定時間內使用。尿素、氨基酸吲哚四、染色液革蘭染色：使用大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌標準菌株進行質控；抗酸染色：使用已知抗酸陽性菌株（或標本）進行質控；每批試劑至少1次最好定期做質控。當染色結果不確定時，可做質控作為對照。抗酸染色：革蘭染色：（推薦快生長分枝桿菌）陽性：Mube.trculosisATCC25177陰性：大腸埃希菌ATCC25922G+:

金黃色葡萄球菌ATCC25923G-:

大腸埃希菌ATCC25922G染色電

鏡肺炎鏈球菌G+G-大腸埃希菌抗酸染色陽性五、細菌、酵母菌鑒定系統(tǒng)使用廠家規(guī)定的標準菌株對相應試劑進行質控每批試劑至少1次手工、半自動系統(tǒng)、自動系統(tǒng)：使用廠家規(guī)定的標準菌株做質控，應符合預期結果；質控頻率：?每批試劑使用前需要先做質控可增加質控次數(shù)?當使用新系統(tǒng)或新的操作人員以考察技術人員操作是否滿足廠家操作說明書要求六、藥物敏感試驗（手工法）紙片擴散法：每周至少1次；更換藥物或培養(yǎng)基時要做質控。常見菌：大腸埃希菌ATCC25922,

金黃色葡萄球菌25923,綠膿假單胞菌

27853質控手工法（稀釋法）：每周至少1次，最好每次試驗做質控。手工法（稀釋法）：常規(guī)試驗通常使用微量肉湯稀釋法，標準做法是每批試驗標準菌株與臨床分離株同時做。金黃色葡萄球菌29213,大腸埃希菌ATCC25922綠膿假單胞菌27853質控藥物敏感試驗（儀器法）?使用廠家規(guī)定的標準菌株對相應試劑進行質控?每批試劑至少1次?當試驗結果異常、不穩(wěn)定，或缺少經驗的人員操作時，應增加質控的頻率?？股厮幬锩舾性囼灧椒?

平板擴散法（KB法）–

CLSI標準–

商業(yè)化的系統(tǒng)–

關鍵性的步驟：準確地測量抑菌環(huán)大小?

肉湯微稀釋法最小抑菌濃度–

CLSI標準–

商業(yè)化的系統(tǒng)–

關鍵性的步驟：為確保檢測不被“污染”，用“純度檢查平板”

接種微生物?

關鍵性的步驟（所有的方法）：正確地準備和標準化接種物對于藥敏試驗，為什么我們要用至少三個菌落來準備一個接種物呢？菌落可能丟失耐藥性質?！嘀鼐鋯蝹€菌落準備接種物混懸液選擇菌落充分地混合標準化接種物混懸液測量區(qū)域說明

(con’t)當用反射光時………?

忽略區(qū)域邊緣很小的菌落?

變形菌屬-忽略區(qū)域內的臨界菌群?

甲氧芐氨嘧啶，磺胺類藥物-忽略微小的生長物（20%或更少生長菌苔）平板擴散-測量區(qū)域(1)光用透射光：葡萄球菌屬利奈唑胺苯唑西林萬古霉素腸球菌屬萬古霉素不能忽略任何生長物

!平板擴散-測量區(qū)域(2)光用反射光：所有其它的藥物/生物組合平板擴散-測量區(qū)域(3)變形菌屬……忽略臨界菌群平板擴散-測量區(qū)域(4)測量完全抑制的區(qū)域銅綠假單胞菌耐藥亞群被腸球菌污染的大腸埃希桿菌區(qū)域內的菌落肉湯稀釋法最小抑菌濃度試驗-最小抑菌濃度試驗培養(yǎng)后接種“純度檢查平板”過夜培養(yǎng)當需要進行抗生素藥物敏感試驗時，臨床試驗標準協(xié)會推薦最小抑菌濃度方法為……?

草綠色鏈球菌-青霉素?

肺炎鏈球菌-青霉素，頭孢噻肟/頭孢曲松（無菌組織）?

腸球菌-萬古霉素“中介的”結果?

葡萄球菌-萬古霉素區(qū)域直徑≤14mm最小抑菌濃度結果（敏感，中介，耐藥）對與下列疾病相關的分離菌群是有用的?

心內膜炎?

腦膜炎?

敗血病?

骨髓炎?

免疫抑制?

假體裝置?

雖然“敏感”，但是對病人不起作用臨床微生物實驗室質量控制范疇標本分析前的質量控制：微生物學特殊性——得到正確分析結果的基礎分析中質量控制：?常規(guī)儀器和設備?成品商業(yè)培養(yǎng)基（診斷抗血清）分析后質量控制：1、臨床微生物學“緊急報告值”2、監(jiān)測報告結果是否正確、清楚、及時。質量保證持續(xù)監(jiān)測評價和持續(xù)改進檢測病人標本結果的可靠性和有效性QA監(jiān)測標本目標質量、數(shù)量、體積，可接受的合格標本檢測根據(jù)臨床指癥、診斷和其他臨床資料，采用適當檢測方法報告監(jiān)測報告的正確，清楚、及時服務對

積極詢問（臨床醫(yī)生）其需要，滿意度，象？理解對抱怨的處理情況大量的分析前因素影響微生物實驗的診斷價值對收集和運送標本的容器控制:?

無菌質量控制內容：1、合理的標本采集?

無防腐劑向臨床提供標本采?

足夠大集說明(sop)?

安全嚴密?

不易碎?

正確時間?

部位?

運送培養(yǎng)基?

加強無生長因子或保持特定菌的培養(yǎng)基?

方法等?

避免用木質的棉試子對細菌有毒害采集時間；標本來源2、正確的運送方式(sop)（運送工具和有效時間及儲存方法等）?

標本因冷藏及pH改變或在氧氣中暴露，可能減少很多種細菌的存活時間腦膜炎球菌，淋病奈瑟菌，流感嗜血桿菌，肺炎鏈球菌，沙門菌，志賀氏菌，霍亂弧菌，空腸彎曲菌及厭養(yǎng)菌?

定量評價細菌數(shù)量的培養(yǎng)（尿標本）（運送時間）對環(huán)境敏感菌株在運送中數(shù)量快速減少時，如果運送時間太長，其它菌則成倍增長，目標細菌可同其它菌一起過度生長。需進行細菌學檢測的所有標本，應在收集后2小時內送到實驗室細菌學試驗的各種標本的運送及貯存條件標本運送貯存溫度室溫或37℃室溫血血培養(yǎng)瓶膿

、腦脊液

、胸水、心包液

、短時間內運送:標本在帶帽的注射器內保證厭氧條件不用培養(yǎng)避免冷藏腹水、關節(jié)滑液

、鼻竇分泌物長時間運送：使用運送培基支氣管肺泡灌液、

立刻送檢痰，其它分泌物

、便冷藏（2-3小時）眼、耳、嘴、咽

、用運送培養(yǎng)基室溫鼻、尿道、生殖道

、直腸、傷口

試子(運送時間>4小時)不培養(yǎng)3、有可靠的標本質量評價方法(sop)痰標本質控評分系統(tǒng)AliceS.Weissfeld.Quality

Management.ClinicalandPathogenicmicrobiology.1994.4、拒收標本指標?

除非不能再采集的標本，否則不予檢測；如果培養(yǎng)或檢測，要對結果進行說明。?

書寫錯誤無菌無防腐劑足夠大安全嚴密不易碎運送培養(yǎng)基無生長因子或保持特定菌的培養(yǎng)基避免用木質的棉試子對細菌有毒害?

容器問題?

干燥試子?

厭養(yǎng)菌容器定期維護和校準、記錄?

pH計?

厭氧指示劑?

水浴葙?

天平?

加樣器年檢、驗證?

自動高壓滅菌器?

生物安全柜培養(yǎng)時間、溫度控制?

葡萄球菌藥敏試驗06年CLSI35±2℃，16-18h,苯唑西林，甲苯西林，奈夫西林和萬古霉素24h。35℃以上可能檢測不出MRS.?

淋球菌藥敏試驗36±1℃（不能