上海市臨檢中心 二代測(cè)序NGS 5-張翔-cfDNA樣本及文庫(kù)制備流程-V1.5-20180309

cfDNA樣本及文庫(kù)制備流程張翔20180318ClicktoeditMastertitlestyleClicktoeditMastersubtitlestyleClicktoeditMastertitlestyleClicktoeditMastersubtitlestyleCome

設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)原理Firefl

原理Firefly

-ConcatemersequencingforNGSerror

correctionCancer

mutations

createrepetitive

variants

intandem

sequencesRandom

errors

donotcreate

repetitive

variants

intandem

sequencescfDNADenaturationCircligationRolling

Circle

Amplification4Come

設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)原理基于Firefly原理設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的Comet具有更高的精準(zhǔn)度：CYP2C19

SNV

(nucleotide

681inexon5)10%1%0.1%0.02%0.01%Nucleotide

Position(bp)5Come

TATDNAExtraction&PrepDataanalysis&reportLibraryPrepSampleSeqDay1Day1-2Day2-4Day1Day5?

5day

TAT?

<2hr

hands-on

time6ClicktoeditMastertitlestyleClicktoeditMastersubtitlestylecfDN

制備流程

采血采血Streck

Tube常溫運(yùn)輸理論<7天，實(shí)際當(dāng)天處理4h內(nèi)處理采血管EDTA抗凝管4℃運(yùn)輸采血管

血漿分離分裝血漿-80℃保存或直接抽提低速離心上層為血漿轉(zhuǎn)移血漿低溫高速離心轉(zhuǎn)移血漿混勻注意事項(xiàng)：1.

不同采血管低速離心溫度不一樣；2.

兩個(gè)轉(zhuǎn)移血漿的步驟，注意不要吸到分界面以下成分或者沉淀；

抽提cfDNA（一類(lèi)備案試劑盒）QIAamp

CirculatingNucleic

Acid

Kit（Cat.55114）；MagicPure

TM

Cell-Free

DNA

Kit（EC201）；

產(chǎn)物cfDNA質(zhì)控1.

>10ng.2.片段分布質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。8文庫(kù)制備流程

cfDNA環(huán)化連接試劑1+2mix試劑3高溫處理30s恒溫孵育恒溫孵育冰浴1minSample（cfDNA

+試劑0）環(huán)化連接產(chǎn)物注意事項(xiàng)：1.操作過(guò)程保持在冰上；2.高溫處理過(guò)程，時(shí)間要把控準(zhǔn)確；處理結(jié)束后立即放入冰浴中；3.恒溫孵育采用PCR儀，控溫效果更好。10文庫(kù)制備流程

擴(kuò)增目的片段試劑4，5，8，引物試劑6PCR擴(kuò)增不同溫度孵育環(huán)化連接產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物注意事項(xiàng)：1.操作過(guò)程保持在冰上；2.不同溫度孵育處理結(jié)束后立即放入冰浴中；3.多個(gè)樣本操作時(shí)，試劑6建議提前分裝再用多道移液器加液。12文庫(kù)制備流程

純化目的片段，目的片段加barcode

擴(kuò)增試劑7，8，通用引物接頭磁珠APCR擴(kuò)增擴(kuò)增文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物混勻吸附乙醇清洗洗脫樣本

洗脫液室溫孵育注意事項(xiàng)：1.磁珠提前室溫平衡，純化過(guò)程保持室溫操作；2.棄上清，乙醇，轉(zhuǎn)移洗脫液過(guò)程中不要碰到磁珠；3.

乙醇第二次清洗后干燥時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫濕度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，避免過(guò)度干燥；15文庫(kù)制備流程

純化文庫(kù)磁珠B擴(kuò)增文庫(kù)室育吸附磁珠B室溫孵育洗脫吸附乙醇清洗轉(zhuǎn)移上清磁珠B室溫孵育吸附洗脫產(chǎn)物乙醇清洗洗脫純化文庫(kù)注意事項(xiàng)：1.磁珠提前室溫平衡，純化過(guò)程保持室溫操作；2.棄上清，乙醇，轉(zhuǎn)移洗脫液過(guò)程中不要碰到磁珠；3.

乙醇第二次清洗后干燥時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫濕度進(jìn)

行適當(dāng)調(diào)整，避免過(guò)度干燥；16文庫(kù)制備流程

混合文庫(kù)1.

單個(gè)文庫(kù)濃度>0.5ng/uL（Qubit

HS測(cè)量）;2.

文庫(kù)混合：等質(zhì)量混合。（2-20ng）3.

混合文庫(kù)數(shù)量≤24?！?1224混合產(chǎn)物1文庫(kù)制備流程

Agilent

210

定量文庫(kù)2100

注意事項(xiàng)