第六章克隆基因的表達2

一、真核細胞基因克隆載體1．在酵母細胞中克隆基因常用的載體酵母是研究真核生物DNA的復制、重組、基因表達以及調(diào)控過程等的理想材料，為此，也構建了許多人工質粒載體。根據(jù)這些質粒和復制方式不同，把它們分為整合型(YIp)、復制型(YRp)、附加體型(YEp)等。目前一頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點以上3種類型載體的共同特點是：①能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)。這樣可使外源基因轉化到酵母細胞之前先在大腸桿菌中擴增；②含有在酵母細胞中便于選擇的遺傳標記。這些標記一般能和大腸桿菌相應的突變體互補。有些還攜帶有用于大腸桿菌的抗生素抗性標記；③含有合適的限制酶切割位點，以便外源基因的插入。目前二頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(1)整合型載體(YIp)

YIp型載體是由大腸桿菌質粒和酵母的DNA片段構成的，如PYeleul0是由Co1E1質粒和酵母DNA提供的亮氨酸(Leu2+)片段構成。由于leu2+基因片段不含自主復制起始區(qū)，只作為選擇標記，所以YIp型載體在酵母細胞中不能自主復制。YIp型載體可經(jīng)轉化作用導入受體細胞，進入細胞后的YIp質粒DNA通過與受體染色體DNA的同源重組，被整合到染色體上，并隨染色體一起復制。這樣質粒DNA以單拷貝基因形式穩(wěn)定地遺傳。目前三頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(2)復制型載體(YRp)

YRp型載體是酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質粒中構成的。其中酵母DNA片段不但提供了選擇標記，還攜帶來自酵母染色體DNA的自主復制順序(ARS)。因為它同時含有大腸桿菌和酵母的自主復制基因，所以能在兩種細胞中存在和復制?？梢栽趦煞N截然不同的生物細胞中復制的載體稱為穿梭載體(shuttlevector)。穿梭載體在基因工程中廣泛使用。目前四頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(3)附加體型載體(YEp)

YEp型載體一般由大腸桿菌質粒、2um質粒以及酵母染色體的選擇標記構成。2um質粒是釀酒酵母含有一個長度為2um的內(nèi)源質粒，它的DNA分子通常與蛋白質結合構成復合物，存在于核區(qū)。2um質粒含有自主復制起始區(qū)(ori)和STB區(qū)，STB序列能夠使質粒在供體細胞中維持穩(wěn)定。利用2um質粒，人們已經(jīng)構建出許多YEp型載體。

目前五頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點2．植物基因克隆的載體——Ti質粒Ti質粒存在于能夠引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)癌桿菌中。這種腫瘤的形成是由Ti質粒決定的，故稱為誘導腫瘤的質粒(tumorinducingplasmid)，簡稱Ti質粒。目前六頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(1)冠癭瘤在Ti質粒誘導的腫瘤細胞中，具有大量的不正常的氨基酸類物質——冠癭堿(opine)，這是一類相對分子質量較小的堿性氨基酸衍生物，由Ti質粒DNA編碼。正常植物細胞不能合成和利用冠癭堿，而土壤農(nóng)癌桿菌能夠選擇性地利用這類化合物作為自己唯一的能源、碳源和氮源。最常見的冠癭堿有章魚堿(octopine)、胭脂堿(nopaline)和農(nóng)桿堿(agropine)。根據(jù)所產(chǎn)生的冠癭堿的類型和差別，可將冠癭瘤細胞分為章魚堿型、胭脂堿型和農(nóng)桿堿型腫瘤細胞。目前七頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(2)Ti質粒的結構和特性每種土壤農(nóng)癌桿菌只含有一種Ti質粒，Ti質粒是環(huán)狀dsDNA，大約185kb，如圖。土壤農(nóng)癌桿菌中的T-DNA為轉移DNA，是Ti質粒最重要的組成部分。在土壤農(nóng)癌桿菌感染植物細胞后，Ti質粒中的T-DNA區(qū)能夠隨機地共價整合到植物染色體DNA中。它所攜帶的基因主要有兩個功能，一是決定腫瘤的形成和形態(tài)，二是控制冠癭堿的合成。這也是Ti質粒的主要功能，說明T-DNA是Ti質粒的核心區(qū)段。目前八頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點目前九頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(3)Ti質粒的作用和改造Ti質粒的T-DNA能夠自發(fā)地整合到植物染色體DNA上，誘導植物形成腫瘤，是一種理想的天然植物基因工程載體。T-DNA上的opine合成酶基因具有一個強啟動子，能啟動外源基因在植物細胞中高效表達，這都是Ti質粒作為載體的優(yōu)點。目前十頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點對Ti質粒進行了以下改造，使之符合載體的要求：①保留T-DNA的轉移功能；②取消T-DNA的致瘤性，使之進入植物細胞后不至于干擾細胞的正常生長和分化，轉化體可再生植株；③通過簡便的手段可使外源DNA插人T-DNA之中，并隨著T-DNA整合到植物染色體上。目前十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點3．動物細胞基因克隆的載體哺乳動物細胞若不借助一些特殊的手段，很難捕獲和表達外源的DNA?，F(xiàn)已有多種技術來改變這種狀況，如磷酸鈣等的轉染技術、電穿孔技術、顯微注射技術、原生質體融合技術等。其中借助病毒載體將外源DNA導人動物細胞，也是極為重要的一方面。在眾多的病毒載體中，猿猴空泡病毒40（SV40)載體是研究得最為詳細、發(fā)展最快的一種。下面對SV40載體作簡要介紹。

目前十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(1)SV40病毒

SV40病毒是一種小型二十面體的蛋白質顆粒，由VPl，VP2和VP3三種病毒外殼蛋白構成，中間包裝著一條環(huán)狀的病毒基因組DNA。SV40DNA大小為5.2kb，很適于基因操作。對其DNA順序也進行了全序列分析。目前所使用的SV40載體都是經(jīng)過改造的，通常只保留SV40的復制起始區(qū)和早期區(qū)域啟動子以及多聚腺苷酸化位置和小t抗原的內(nèi)含子。

目前十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點一個典型而又通用的哺乳動物基因載體pSV2：

目前十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點目前十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點第三節(jié)

外源基因導入真核細胞的方法目前十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點1．酵母的轉化一般有以下兩種方法：(1)利用酵母的原生質球進行轉化

首先，酶解酵母細胞壁，產(chǎn)生原生質球，再將原生質球置于DNA、CaCl2和多聚醇(如聚乙二醇)中，多聚醇可使細胞壁具有穿透性，并允許DNA進入。然后使原生質球懸浮于瓊脂中，并使其再生新的細胞壁。目前十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(2)利用Li+鹽進行轉化

這種方法不需要消化酵母的細胞壁，產(chǎn)生原生質球，而是將整個細胞暴露在Li+鹽(如0.1mol/LLiCl)中一段時間，再與DNA混合，經(jīng)過一定處理后，加40％PEG4000，然后經(jīng)熱應激等步驟，即可獲得轉化體。這種方法的主要缺點是，如果用自主復制的質粒進行轉化，轉化體的數(shù)目比用原生質球低10～100倍。目前十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點2．植物細胞的轉化及其他基因轉移方法(1)葉盤法

植物細胞轉化常用的方法。先將實驗材料(如煙草)的葉子表面進行消毒，再用消毒過的不銹鋼打孔器從葉子上取下圓形小片，即葉盤。為了對葉盤進行接種處理，需將它放在土壤農(nóng)癌桿菌培養(yǎng)液中浸泡4～5min，然后用濾紙吸干，放在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，需將葉子背面接觸培養(yǎng)基。經(jīng)過數(shù)周后，葉盤周圍會長出愈傷組織并分化出幼苗。

目前十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點葉盤法的優(yōu)點是操作簡便、適用性廣，對于那些能被土壤農(nóng)癌桿菌感染并能從離體葉盤形成的愈傷再生成株的各種植物都適用。這種方法具有很高的重復性，便于大量常規(guī)地培養(yǎng)轉化的植株。目前，這種方法已成為雙子葉植物基因導人的主要手段。用這種主法所得到的轉化體，其外源基因能穩(wěn)定地遺傳和表達，并按孟德爾方式分離。

目前二十頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(2)電擊法

原理是，在很強的電壓下，細胞膜會出現(xiàn)電穿孔現(xiàn)象。經(jīng)過一段時間后，細胞膜上的小孔會封閉，恢復細胞膜原有特性。據(jù)此原理設計的電擊法可用于基因轉移。電擊法具有簡便、快速、效率高等優(yōu)點，但在植物中，由于細胞壁對外源基因的攝取有不利影響，所以一般以原生質粒為受體細胞。目前，該法用于煙草、玉米、水稻、小麥、高梁和大豆等植物，已得到了穩(wěn)定的外源基因表達。

目前二十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(3)基因槍法又稱高速微型子彈射擊法，它是將DNA吸附在由鎢制作的微型子彈(直徑約為1.2um)表面，通過特制的手槍，將子彈高速射人完整的細胞和組織內(nèi)。用這種方法，已將DNA先后送人酵母的線粒體和核、衣藻的葉綠體和核、洋蔥的表皮細胞以及玉米懸浮細胞中?；驑尫ū荛_原生質體再生植株的難關，因此成為單子葉植物基因轉移的有效途徑。目前二十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點3．哺乳動物細胞基因導入法（1）磷酸鈣沉淀法

具體做法大致是：先將需要被導入的DNA溶解在鈣鹽溶液中，然后在不停地攪拌下逐滴加到磷酸鹽溶液中，形成磷酸鈣微結晶與DNA的共沉淀物。再將這種共沉淀物與受體細胞混合、保溫，DNA可以進入細胞核內(nèi)，并整合到寄主染色體上。這種方法多數(shù)用于單層培養(yǎng)的細胞，也可用于懸浮培養(yǎng)的細胞。目前二十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(2)脂質體載體法

這種方法即用脂質體包埋核酸分子，然后將其導入細胞。脂質體是一種人工膜，制備方法很多，用于轉移DNA的較理想的膜成分是帶負電荷的磷脂酰絲氨酸。做法大致是：將磷脂和DNA溶液溶解于大量的有機溶劑(如醚)中，再經(jīng)過超聲波處理，使其形成乳劑，然后蒸發(fā)掉有機溶劑，最終形成0.4um的脂質體。進一步可通過聚乙二醇(PEG)的作用，使細胞吸收脂質體。目前二十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(3)顯微注射法又簡稱為微注射法，它是創(chuàng)造轉基因動物的有效途徑。其技術關鍵如下：①理想外源基因的制備。這種基因可處于質粒上，但注射前質粒已經(jīng)酶切而線性化。有的載體DNA會干擾外源基因的表達，因此注射前，需要先從載體上將它們切下。②收集受精卵。在受孕后的幾小時內(nèi)，父母雙方的遺傳物質還未結合前，從供體動物中取出單細胞的受精卵。③顯微注射。利用極細的毛細玻璃管(外徑為0.5—1um)，將理想的遺傳物質注入受精卵的雄原核。這必須在父母雙方遺傳物質融合前的4h間歇期內(nèi)完成。當雙親染色體相遇后，注入的理想基因有可能整合到染色體上。④在幾次細胞分裂后，將帶有理想基因的受精卵移入母體，使受精卵孕育。

目前二十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(4)DEAE葡聚糖轉染技術二乙胺乙基葡聚糖（DEAE-dextran）是一種相對分子質量較大的多聚陰離子試劑，能促進哺乳動物細胞捕獲外源DNA，因此被用于基因轉染技術。其促進細胞捕獲DNA的機理還不清楚，可能是因為葡聚糖與DNA形成復合物而抑制了核酸酶對DNA的作用，也可能是葡聚糖與細胞結合而引發(fā)了細胞的內(nèi)吞作用。目前二十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點DEAE-dextran轉染主要有兩種不同的方法。一種是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA/DEAE-dextran復合物后，再用來處理細胞；另一種是受體細胞先用DEAE-dextran溶液預處理，然后再用來與轉染的DNA接觸。目前二十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點第七章重組體的篩選與鑒定目前二十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點由體外重組產(chǎn)生的DNA分子，通過轉化、轉染、轉導等適當途徑引入宿主會得到大量的重組體細胞或噬菌體。面對這些大量的克隆群體，需要采用特殊的方法才能篩選出可能含有目的基因的重組體克隆。同時也需要用某種方法檢測從這些克隆中提取的質?；蚴删wDNA，看其是否確實具有一個插人的外源DNA片段。

目前已經(jīng)發(fā)展和應用了一系列構思巧妙、可靠性較高的重組體克隆檢測法，包括使用特異性探針的核酸雜交法、免疫化學法、遺傳檢測法和物理檢測法等。目前二十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點一、遺傳檢測法

遺傳檢測法可分為根據(jù)載體表型特征和根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組子兩種方法。1．根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法在基因工程中使用的所有的載體分子，都帶有一個可選擇的遺傳標記或表型特征。質粒以及柯斯載體具有抗藥性標記或營養(yǎng)標記，而對于噬菌體來說，噬菌斑的形成則是它們的自我選擇特征。目前三十頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(1)抗藥性標記插入失活選擇法pBR322質粒是DNA分子克隆中最常用的一種載體分子。編碼有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。只要將轉化的細胞培養(yǎng)在含有四環(huán)素或氨芐青霉素的生長培養(yǎng)基中，便可以容易地檢測出獲得了此種質粒的轉化子細胞。目前三十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點重組菌非重組菌非重組菌不含有抗菌素的培養(yǎng)基含有抗菌素的培養(yǎng)基含有抗菌素的培養(yǎng)基目前三十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點(2)β—半乳糖苷酶顯色反應選擇法外源DNA插入到它的lacZ基因上所造成的β-半乳糖苷酶失活效應，可以通過大腸桿菌轉化子菌落在X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化直接觀察出來。在pUC質粒載體lacZ序列中，含有一系列不同限制酶的單一識別位點，其中任何一個位點插入了外源克隆DNA片段，都會阻斷讀碼結構，使其編碼的肽失去活性，結果產(chǎn)生出白色的菌落。目前三十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點2．根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法這種選擇法依據(jù)的基本原理是，轉化進來的外源DNA編碼的基因，能夠對大腸桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補效應，從而使被轉化的寄主細胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。例如，編碼大腸桿菌生物合成基因的克隆所具有的外源DNA片段，對于大腸桿菌寄主菌株的不可逆的營養(yǎng)缺陷突變具有互補的功能。根據(jù)這種特性，便可以分離到獲得了這種基因的重組體克隆。

目前三十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點二、物理檢測法這類重組體質粒，只要根據(jù)其相對分子質量比野生型大這一特點，就可以檢測出來。常用的重組體分子的物理檢測法有凝膠電泳檢測法和R—環(huán)檢測法兩種。目前三十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點1．凝膠電泳檢測法帶有插入片段的重組體在相對分子質量上會有所增加。分離質粒DNA并測定其分子長度是一種直截了當?shù)姆椒?。通常用比較簡單的凝膠電泳進行檢測。

目前三十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點2.小規(guī)模制備質粒DNA進行限制酶切分析目前三十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點3．R-環(huán)檢測法

是指在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度(70％)的甲酰胺溶液中，雙鏈的DNA-RNA分子要比雙鏈的DNA-DNA分子更為穩(wěn)定。因此，將RNA及DNA的混合物置于這種退火條件下，RNA便會同它的雙鏈DNA分子中的互補序列退火形成穩(wěn)定的DNA-RNA雜交分子，而被取代的另一條鏈處于單鏈狀態(tài)。這種由單鏈DNA分支和雙鏈DNA-RNA分支形成的“泡狀”體，即所謂的R-環(huán)結構。

目前三十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點所以，應用R-環(huán)檢測法可以鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域。根據(jù)這樣的原理，在有利于R-環(huán)形成的條件下，使得檢測的純化的質粒DNA，在含有mRNA分子的緩沖液中局部地變性。如果質粒DNA分子上存在著與mRNA探針互補的序列，那么這種mRNA就將取代DNA分子中的相應的互補鏈，形成R—環(huán)結構。然后放置在電子顯微鏡下觀察，這樣便可以檢測出重組體質粒的DNA分子。

目前三十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點三、核酸雜交篩選法從基因文庫中篩選帶有目的基因插入序列的克隆，最廣泛使用的一種方法是核酸分子雜交技術。它所依據(jù)的原理是利用放射性同位素(32P或1251)標記的DNA或RNA探針進行DNA-DNA或RNA-DNA雜交，即利用同源DNA堿基配對的原理檢測特定的重組克隆。前面我們講過southern印跡雜交，northern雜交等，現(xiàn)在我們談一下另一種雜交方式—原位雜交。目前四十頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點1．原位雜交

原位雜交(insituhybridization)亦稱菌落雜交或噬菌體雜交。這種方法的基本程序是，將大腸桿菌菌落，從瓊脂平板中轉移到硝酸纖維素濾膜上，而后進行適當?shù)臏赜〕鲆呀?jīng)長有菌落的硝酸纖維素濾膜，使用堿處理，細菌菌落被溶解，它們的DNA也就隨之變性。用放射性同位素標記的RNA或DNA作為探針雜交，放射自顯影技術檢測。凡是含有與探針互補序列的菌落DNA，就會在X光膠片上出現(xiàn)曝光點。根據(jù)曝光點的位置，便可以從保留的母板上相應位置挑出所需要的陽性菌落。目前四十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點2.Southern印跡雜交3.Northern雜交目前四十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十八點四、免疫化學檢測法