DNA芯片技術(shù)的原理與應(yīng)用

DNA芯片技術(shù)的原理與應(yīng)用

目前一頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)

主要內(nèi)容

DNA芯片技術(shù)的概況DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用概況存在的一些問題及展望目前二頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)1DNA芯片技術(shù)的一些概況DNA芯片也稱DNA微陣列,是生物芯片的一種?；蛐酒碜畛跏怯珊怂岬姆肿与s交衍生而來的,即應(yīng)用已知序列的核酸探針對未知序列的核酸序列進(jìn)行雜交檢測1.1DNA芯片技術(shù)的概念和基本原理目前三頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)DNA芯片技術(shù)，實(shí)際上就是一種大規(guī)模集成的固相雜交，是指在固相支持物上原位合成(situsynthesis)寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交。通過計(jì)算機(jī)對雜交信號(hào)的檢測分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達(dá)的信息)。由于常計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。目前四頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)基因芯片制備及檢測流程是利用原位合成法或?qū)⒁押铣珊玫囊幌盗泄押塑账嵋灶A(yù)先設(shè)定的排列方式固定在固相支持介質(zhì)表面,形成高密度的寡核苷酸的陣列,樣品與探針雜交后,由特殊的裝置檢出信號(hào),并由計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析得到結(jié)果。目前五頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)原理如下圖：目前六頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)基因芯片電子芯片集成電子線路集成分子線路目前七頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray目前八頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)近7(2011.9前)年來公開發(fā)表的與基因芯片相關(guān)的學(xué)術(shù)論文目前九頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)1.2DNA芯片分類

據(jù)不同分類標(biāo)準(zhǔn),DNA芯片的分類如下:(1)根據(jù)固相支持物的不同,DNA芯片分為無機(jī)(玻璃、硅片、

陶瓷等)和有機(jī)(聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)芯片。(2)根據(jù)芯片上所用探針不同分為寡核苷酸芯片和cDNA芯片。(3)根據(jù)芯片點(diǎn)樣方式不同,可分為原位合成芯片、微矩陣芯片(分噴點(diǎn)和針點(diǎn))和電定位芯片3類。(4)根據(jù)用途的不同分類為基因表達(dá)芯片和基因測序芯片。目前十頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)1.3DNA芯片的優(yōu)點(diǎn)作為新一代基因診斷技術(shù)，DNA芯片的突出特點(diǎn)在于快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)，平行化、自動(dòng)化等，與傳統(tǒng)基因診斷技術(shù)相比，DNA芯片技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢：（1）快速準(zhǔn)確（2）檢測效率高（3）基因診斷的成本降低。（4）自動(dòng)化程度高（5）

避免了交叉感染（6）多功能（7）高度的平行性目前十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)DNA芯片技術(shù)的步驟DNA芯片的制備光蝕刻合成法電壓印刷法點(diǎn)樣法

樣品的制備

雜交

雜交圖譜的檢測和讀出為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，來自血液或組織中的DNA/mRNA樣本須先行擴(kuò)增，然后再被熒光素或同位素標(biāo)記成為探針。

雜交條件的選擇要根據(jù)芯片上核酸片段的長短及其本身的用途來定。

激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)CCD攝像原理檢測系統(tǒng)質(zhì)譜法1.4DNA芯片的制備過程目前十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)芯片的制備

原位合成法(insitusynthesis)借鑒半導(dǎo)體照相平版印刷技術(shù),在固相載體上原位合成寡核苷酸探針序列。主要有光蝕刻法及壓電印刷法。光蝕刻法基本過程為:光有選擇地照射到有光掩蔽劑保護(hù)的玻璃片上,以去掉玻璃片上的光敏集團(tuán),激活DNA合成過程,在去掉光敏集團(tuán)的特定部位偶聯(lián)一個(gè)光保護(hù)堿基,再將第二個(gè)光掩蔽劑置于這個(gè)受光保護(hù)的堿基上,如此不斷地去保護(hù)和偶聯(lián),就可以得到寡核苷酸片斷,許多這樣的不同序列的片段就構(gòu)成了DNA方陣。目前十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)

原位合成(InSituSynthesis)Lightdirectedoligonucleotidesynthesis.Asolidsupportisderivatizedwithacovalentlinkermoleculeterminatedwithaphotolabileprotectinggroup.Lightisdirectedthroughamasktodeprotectandactivateselectedsites,andprotectednucleotidescoupletotheactivatedsites.Theprocessisrepeated,activatingdifferentsetsofsitesandcouplingdifferentbasesallowingarbitraryDNAprobestobeconstructedateachsite.光定向合成寡核苷酸目前十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)

壓電印刷法的基本原理類似于目前采用的噴墨打印機(jī):打印頭在方陣上移動(dòng),在方陣每點(diǎn)上電流使噴頭放大,并將裝有機(jī)某種堿基的試劑滴在晶片表面,然后固定,在洗脫和去保護(hù)后另一輪寡核苷酸的延伸就可以繼續(xù)進(jìn)行。壓片印刷法由于不需要與載體表面直接接觸,故有很高的效率,但制造工藝還不太成熟。目前十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)噴墨打印技術(shù)目前十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)離片合成法(off-chipsynthesis)首先利用各種方法制備出寡核苷酸探針，再由具有多個(gè)微細(xì)加樣孔的陣列復(fù)制器(arrayingandreplicatingdevice,ARD)及由電腦控制的機(jī)器將探針按一定的順序固定在固相載體表面，再由紫外交線交聯(lián)固定后得到DNA方陣。該方法優(yōu)點(diǎn)是芯片制造速度快,成本低,而且芯片之間制造誤差小。其缺點(diǎn)是與原位合成法相比,構(gòu)成方陣的DNA片段需要先合成、純化，以及在制造DNA芯片前必須將如此大量具有微小差別的片段分別保存,并且需要特制的自動(dòng)點(diǎn)樣裝置。目前十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)

點(diǎn)樣法

即預(yù)先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分離得到cDNA，再通過點(diǎn)樣機(jī)直接將其點(diǎn)到芯片上。寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通過多孔玻璃合成法。肽核苷酸雖然在制備上比較復(fù)雜，但是它與DNA探針相比，由于PNA（肽核酸）與DNA結(jié)合的復(fù)合物更加穩(wěn)定和特異，因而更加有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測。來自某一細(xì)胞的cDNA必須進(jìn)行預(yù)處理，純化，擴(kuò)增以及分類，然后再利用機(jī)械手把它們準(zhǔn)確地固定在基板的相應(yīng)位置上，為了保證cDNA芯片檢測的準(zhǔn)確性，在制備cDNA芯片以前必須提高低表達(dá)基因cDNA的豐度，降低高表達(dá)基因cDNA的豐度。

目前十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)樣品的制備樣品的制備包括：樣品的分離純化，擴(kuò)增，標(biāo)記

分離純化：樣品來源于活的細(xì)胞，使用一定方法分離并純化DNA或RNA（特別是mRNA）。只有達(dá)到一定純度的樣品，才能保證后續(xù)操作的正確。

目前十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)樣品的擴(kuò)增：擴(kuò)增的目的在于獲得足夠的樣品量?，F(xiàn)已發(fā)展出固相PCR系統(tǒng)。樣品的標(biāo)記：主要采用熒光標(biāo)記法，也可用生物素，或放射性核標(biāo)記。標(biāo)記的方式采用PCR或RT-PCR。常用的熒光色素為Cy3、Cy5。用Cy3、Cy5標(biāo)記dNTP，經(jīng)PCR后，產(chǎn)物即可被標(biāo)記。待測樣品和對照可采用雙色熒光標(biāo)記。目前二十頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)分子雜交芯片的雜交：將已知序列的DNA探針顯微固化于支持物表面，將已標(biāo)記好的樣品與之進(jìn)行雜交，雜交過程一般在30分鐘完成。電子基因芯片：雜交速度更快。采用肽核酸（peptidenucleicacid，PNA）探針可消除DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。目前二十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)遺傳信息檢測原理：待測樣品與支持物上探針列陣雜交后，熒光標(biāo)記的樣品結(jié)合在芯片的特定位置，未結(jié)合的探針被除去；樣品與探針嚴(yán)格配對的雜交分子，熱力學(xué)穩(wěn)定性高，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)，不完全配對的，熒光信號(hào)弱；不能雜交不產(chǎn)生熒光信號(hào)。分析：采用激光掃描或激光共聚焦顯微鏡采集雜交信號(hào)（位置、強(qiáng)度、顏色），并與對照比較，經(jīng)相關(guān)軟件進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理。即可得也待測樣品的信息。經(jīng)以上獲得的數(shù)據(jù)十分龐大，還需進(jìn)行分析，比較，歸納，才能得出明晰的結(jié)論。目前二十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)

目前二十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)DNA芯片的應(yīng)用領(lǐng)域科學(xué)研究臨床疾病診斷環(huán)境檢測藥物研究開發(fā)法醫(yī)學(xué)鑒定動(dòng)植物檢疫食品檢測軍事應(yīng)用健康管理運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)目前二十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)DNA芯片的應(yīng)用概況2.1基因表達(dá)的分析與檢測將不同條件下某生物體中轉(zhuǎn)錄出的mRNA標(biāo)記后與代表它所有基因而制成的DNA芯片雜交,通過分析雜交位點(diǎn)及其信號(hào)強(qiáng)弱,就可得出不同條件下各基因的表達(dá)情況,還可鑒定出某些未知功能基因,發(fā)現(xiàn)新基因,這一應(yīng)用目前已成為DNA芯片研究中的一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

DNA芯片具有高度的敏感性和特異性，可自動(dòng)、快速地同時(shí)檢測成千上萬個(gè)基因的表達(dá)，基因表達(dá)的分析研究有利于揭示不同層次上多基因協(xié)同作用的生命過程。目前二十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用cDNA表達(dá)譜芯片對大鼠心臟生長發(fā)育及損傷過程中基因表達(dá)的改變進(jìn)行了研究。心臟從胚胎到成年的發(fā)育過程中基因表達(dá)發(fā)生了明顯的變化，在1075點(diǎn)芯片上，以成年心臟作為對照，胚胎期的差異表達(dá)基因多于初生期的差異表達(dá)基因，而在胚胎期中的第13天差異表達(dá)最明顯，然而當(dāng)出現(xiàn)心肌肥厚和心力衰竭時(shí)，有些在心臟發(fā)育期才表達(dá)的基因重新被表達(dá)，這說明壓力負(fù)荷誘發(fā)的基因表現(xiàn)型與心臟生長發(fā)育的基因表現(xiàn)型有某種關(guān)聯(lián)。目前二十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)2.2基因突變及多態(tài)性的檢測將DNA芯片技術(shù)用于檢測分子突變，能準(zhǔn)確地確定突變位點(diǎn)和突變類型，檢測多個(gè)基因乃至整個(gè)基因組的突變。Hacia等采用含有96000個(gè)寡核苷酸探針芯片研究遺傳性乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1外顯子11位點(diǎn)可能發(fā)生的突變，結(jié)果在15例患者樣品中檢測到14例患者存在不同的突變（包括點(diǎn)突變、插入、缺失等突變），而在20個(gè)對照樣品中均沒出現(xiàn)假陽性，同時(shí)還檢測出了8個(gè)單核苷酸多態(tài)（SNP）。在多態(tài)性研究方面，Kozal等應(yīng)用基因芯片研究未曾接觸蛋白質(zhì)酶抑制劑的HIV患者中HIV—lclade蛋白質(zhì)酶多態(tài)，總共分析了114例樣本，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)酶基因存在很大程度的多態(tài)性，所示結(jié)果與sanger法檢測結(jié)果一致性達(dá)98%。目前二十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)2.3測序通過與一組已知序列的寡核苷酸探針雜交，利用雜交譜來重建待測DNA序列，該技術(shù)為大規(guī)模測序提供了方便、快捷、準(zhǔn)確的手段，同時(shí)也有助于了解基因表達(dá)模式、基因突變和多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)新基因以及克隆特異性基因。利用固定的探針與生物樣品的靶序列進(jìn)行分子雜交,得到特定的雜交圖譜,進(jìn)而分析出待測樣品的序列,稱為雜交測序(Sequencingbyhybridization,SBH)。Chee等人用含135000個(gè)核苷酸探針（每個(gè)探針的長度為25個(gè)核苷）的陣列測定了全長為16.6kb的人線粒體基因序列，準(zhǔn)確率達(dá)99%。目前二十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)目前二十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)采取樣本核酸提取樣品標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增放大雜交反應(yīng)洗脫讀取信息，診斷結(jié)果目前三十頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)2.4在臨床上的應(yīng)用疾病診斷人類的疾病與遺傳基因密切相關(guān)，通過分析比較正常人和病人的基因表達(dá)圖譜的差異可以得出病變的基因信息，大規(guī)模篩查出由基因突變引起的疾病，目前DNA芯片已被廣泛應(yīng)用于癌癥相關(guān)基因突變的快速檢測。Moch等用532個(gè)腎癌組織標(biāo)本構(gòu)建了5184點(diǎn)cDNA表達(dá)譜芯片，通過與正常腎組織進(jìn)行比較，在癌細(xì)胞中篩選出89條基因差異表達(dá)，其中有一條編碼波形蛋白基因，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對這條波形蛋白基因表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它與患者的預(yù)后呈顯著的負(fù)相關(guān)，而與腫瘤的分級(jí)和分期無關(guān)。目前三十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)

基因芯片藥物篩選是指通過用藥前后表達(dá)譜的變化找出靶基因及受靶基因調(diào)控的基因是否恢復(fù)到正常狀態(tài),并且用基因芯片作大規(guī)模的藥物篩選研究可以省略大量的動(dòng)物試驗(yàn),縮短藥物篩選所用的時(shí)間。現(xiàn)代藥物篩選中,對藥物篩選影響更直接的是藥物作用新靶的發(fā)現(xiàn),而這些新靶一般是由新發(fā)現(xiàn)的基因編碼的,因而目前大部分研究人員以基因?yàn)榛A(chǔ)的藥物研究過程是:基因組-新靶點(diǎn)篩選。先導(dǎo)物-藥物,即基因-受體-藥物。藥物篩選目前三十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)

近年來,根據(jù)組合化學(xué)理論設(shè)計(jì)的各種化合物文庫開始用于藥物篩選,其中可放大的生物文庫的建立和應(yīng)用,以及高通量自動(dòng)化藥物篩選技術(shù)的出現(xiàn),意味著大批量的化合物可以在很短時(shí)間內(nèi)快速地進(jìn)行篩選。應(yīng)用芯片技術(shù)對生物文庫進(jìn)行藥物篩選,其基本原理是在芯片或合成珠等固相表面上進(jìn)行原位文庫合成和篩選。目前三十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)芯片在乙型肝炎病毒基因突變分析中的應(yīng)用乙型肝炎病毒(HBV)為一部分雙鏈DNA病毒，主要引起急、慢性肝炎,部分反復(fù)感染的患者可發(fā)展成肝炎、肝硬化或肝癌。HBV在復(fù)制過程中由于有逆轉(zhuǎn)錄過程的參與，因而較其他DNA病毒更容易發(fā)生突變，目前研究較多且臨床意義較為明確的突變是HBV前C區(qū)1896位、基本核心啟動(dòng)子(BCP)區(qū)1762、1764位以及聚合酶基因P區(qū)528位、552位突變。目前三十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)

王永忠等應(yīng)用膜顯色DNA芯片法同時(shí)檢測這些位點(diǎn)突變,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HBsAg+、HBeAg+、HBeAb-的患者病毒沒有變異；HBsAg+、HBeAg-、HBeAb+的患者HBV前C區(qū)1896位、BCP區(qū)1762、1764位變異較多；HBsAg+、HBeAg+、HBeAb+的患者HBV前C區(qū)1896位變異低于“小三陽”患者，而BCP區(qū)1762、1764全部發(fā)生了變異。接受拉米夫定治療48周后HBVDNA陽性患者中，HBVP區(qū)基因變異較多,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,膜顯色DNA芯片法用于乙型肝炎病毒基因突變分析，簡便、快速、特異性好。目前三十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)芯片用于腫瘤基因表達(dá)的研究

DNA芯片為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展中的基因開關(guān)及表達(dá)程度提供了強(qiáng)有力的工具，利用它可隨時(shí)獲取腫瘤細(xì)胞生長各期與腫瘤生長相關(guān)基因的表達(dá)模式,因此基因芯片技術(shù)被大量用于腫瘤基因表達(dá)的研究。Derisi等應(yīng)用DNA芯片技術(shù)檢測了腫瘤抑制相關(guān)基因的表達(dá),把人6號(hào)染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)入人黑色素瘤細(xì)胞株,該瘤的致病性被抑制。目前三十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)芯片在人白細(xì)胞抗原A19組基因快速分型中的應(yīng)用研究血清學(xué)分型是人白細(xì)胞抗原A位點(diǎn)(HLA-A)的經(jīng)典分型方法，而此方法的交叉反應(yīng)，尤其是HLA-A19分裂子之間較強(qiáng)的交叉反應(yīng),及淋巴細(xì)胞膜抗原的弱表達(dá)，常常產(chǎn)生分型技術(shù)難點(diǎn)和判斷誤差，并直接影響器官移植效果。李成濤等利用DNA芯片技術(shù),根據(jù)HLA-A位點(diǎn)不同基因亞型的獨(dú)特序列設(shè)計(jì)探針,制成分型芯片；待檢測樣品經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)標(biāo)記上熒光之后,與芯片進(jìn)行雜交,根據(jù)雜交產(chǎn)生的熒光信號(hào)值，分析確定樣品A位點(diǎn)的基因亞型。目前三十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)芯片用于細(xì)菌分型利用基因芯片技術(shù)對致病菌基因組DNA、rRNA進(jìn)行遺傳分析,從而能夠計(jì)算出細(xì)菌種屬間的遺傳距離或者分析和判斷菌體的毒性等。有研究者建立了一張空腸彎曲菌基因組芯片,與不同的致病菌基因組DNA雜交,結(jié)果顯示被檢測的11種致病菌基因組DNA中21%基因沒有雜交信號(hào),說明這些基因在被檢細(xì)菌基因組中存在高度的差異性。目前三十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)芯片在男科學(xué)研究中的應(yīng)用睪丸是合成雄激素和產(chǎn)生精子的主要器官,但是睪丸組織的不同發(fā)育階段及其內(nèi)在的生精過程所表達(dá)基因的研究目前還知之甚少。Sha等利用人睪丸cDNA文庫構(gòu)建了含有9216個(gè)克隆的人睪丸cDNA芯片,用于鑒別人胚胎睪丸和成人睪丸組織差異表達(dá)的基因譜,得到731個(gè)在人胚胎睪丸和成人睪丸中差異表達(dá)的基因,其中已知的基因是54個(gè),在這54個(gè)基因中18.52%已被以前的研究證實(shí)為精子發(fā)生所特有。這個(gè)結(jié)果也證實(shí)了用睪丸芯片鑒別睪丸功能相關(guān)基因的可行性。目前三十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)芯片在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用

法醫(yī)檢驗(yàn)中可以用DNA芯片分析SNPs位點(diǎn),從而鑒定親子關(guān)系和個(gè)人識(shí)別。美國Nanogen公司研制出SNPs分析的主動(dòng)式電磁DNA芯片,可以在幾分鐘內(nèi)完成檢測,能適應(yīng)法醫(yī)檢驗(yàn)的要求。Gabriel等用27條探針的DNA芯片,對105個(gè)樣本的線粒體HVⅠ/HVⅡ區(qū)域的SNPs進(jìn)行了分析,并且用它分析了實(shí)際案例中毛發(fā)和骨骼等檢材,證明該方法用于法醫(yī)檢案是可行的。目前四十頁\總數(shù)四十六頁\編于十二點(diǎn)2.5新藥研究與開發(fā)傳統(tǒng)的新藥研究是以體外培養(yǎng)的人體細(xì)胞及動(dòng)物模型為對象，但兩者均不同于正常人體體內(nèi)條件，利用DNA芯片技術(shù)可以了解組織細(xì)胞在正常狀態(tài)與病理情況下基因表達(dá)的變化。DNA芯片對藥物的篩選即是通過用藥前后組織細(xì)胞基因表達(dá)的變化，找出靶基因及受靶基因調(diào)控的基因是否恢復(fù)