DNA重組及重組DNA技術(shù)

DNA重組和重組DNA技術(shù)DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章177目前一頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點DNA重組（DNArecombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過程。重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）是指在體外將兩個或兩個以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新DNA分子的過程。廣義上，任何造成基因型變化的基因交流過程

277目前二頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點DNA重組的意義發(fā)生在生物體內(nèi)基因的交換或重新組合是生物遺傳變異的一種機(jī)制。在進(jìn)化、繁殖、病毒感染、基因表達(dá)以及致癌基因激活等過程中，基因重組都起重要作用?；蛑亟M也歸類為自然突變現(xiàn)象。377目前三頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNature477目前四頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)轉(zhuǎn)座

(transposition)同源重組

(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)異常重組577目前五頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組是最基本的DNA重組方式677目前六頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點Holliday模型的4個關(guān)鍵步驟：兩個同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：777目前七頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點片段重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

877目前八頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′977目前九頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體1077目前十頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)轉(zhuǎn)座

(transposition)同源重組

(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)1177目前十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆

DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone1277目前十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子。1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉。1377目前十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點1477目前十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點相關(guān)概念

DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系本節(jié)主要內(nèi)容：1577目前十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆1677目前十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克?。?/p>

細(xì)胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮?/p>

1777目前十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆1877目前十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。1977目前十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶2077目前二十頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基2177目前二十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：2277目前二十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：酶的組成、所需因子及裂解DNA的方式作用：2377目前二十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶2477目前二十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG2577目前二十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口2677目前二十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點（三）目的基因(targetgene)

cDNA(complementaryDNA)

指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。

基因組DNA(genomicDNA)

指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。

2777目前二十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點（四）基因載體

定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA2877目前二十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。2977目前二十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點質(zhì)粒

(plasmid)特點:能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。3077目前三十頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點3177目前三十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）

EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列3277目前三十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，桿狀病毒）其他3377目前三十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

3477目前三十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體

3577目前三十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列?；蚪MDNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)(見第22章)3677目前三十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。3777目前三十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因3877目前三十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫3977目前三十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制

從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT4077目前四十頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。4177目前四十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點（三）外源基因與載體的連接粘性末端連接4277目前四十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接4377目前四十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。4477目前四十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點平端連接

4577目前四十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連4677目前四十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點同聚物加尾連接4777目前四十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′4877目前四十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點人工接頭(linker)連接4977目前四十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ5077目前五十頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌5177目前五十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點（五）重組體的篩選5277目前五十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點(插入失活法)

抗藥性標(biāo)記選擇5377目前五十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點α互補利用α互補原理篩選重組體pUC185477目前五十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交5577目前五十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點（六）克隆基因的表達(dá)5677目前五十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點

標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點

E.coli表達(dá)體系的不足：不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

；很難表達(dá)大量可溶性蛋白。1.原核表達(dá)體系(E.coli表達(dá)體系最為常用)5777目前五十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點

優(yōu)點：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA

可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：操作技術(shù)難、費時、不經(jīng)濟(jì)

轉(zhuǎn)染

——將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染

DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射2.真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞）5877目前五十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十二點第三節(jié)

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大DNARecombinationTechni