FDA藥物相互作用研究指南

介紹內(nèi)容簡介藥物相互作用研究的背景知識(shí)藥物相互作用研究的一般策略體內(nèi)藥物相互作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)藥物代謝酶的確認(rèn)CYP酶抑制/誘導(dǎo)作用的體外評(píng)價(jià)P-gp底物和抑制劑的體外實(shí)驗(yàn)研究目前一頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)簡介美國FDA藥物評(píng)價(jià)和研究中心(CDER)生物制品評(píng)價(jià)和研究中心(CBER)2006年9月共同發(fā)布藥物相互作用研究-實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及其在劑量調(diào)整和處方標(biāo)簽中的應(yīng)用的指南目前二頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)簡介指南為新藥和新生物制品的研發(fā)者提供了：藥物代謝藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)體外相互作用研究規(guī)范目前三頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)簡介內(nèi)容涉及藥物相互作用研究的全過程包括：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究人群或體外研究用細(xì)胞、微粒體探針底物、抑制劑、誘導(dǎo)劑的選擇觀察指標(biāo)、樣本量和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，等除了代謝性藥物相互作用以外，還對P糖蛋白介導(dǎo)的藥物相互作用的研究方法給予了詳細(xì)的指導(dǎo)（與1999年版本相比的增加內(nèi)容）目前四頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)1.藥物相互作用研究的背景知識(shí)包括細(xì)胞色素P450(CYP)酶在內(nèi)的多個(gè)藥物代謝酶都能被聯(lián)用的藥物所抑制/誘導(dǎo)藥物濃度發(fā)生巨大改變影響藥物安全性和有效性目前五頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)同時(shí),藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的藥物相互作用受到越來越多的關(guān)注如:P-gp、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OAT），等。表一：人類主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和已知的底物、抑制劑、誘導(dǎo)劑目前六頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)目前七頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)2.藥物相互研究的一般策略根據(jù)體外代謝、已知和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定體內(nèi)相互作用研究必要性。流程圖目前八頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)目前九頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)目前尚未發(fā)現(xiàn)CYP2D6酶被誘導(dǎo)的情況，而CYP2C,CYP2B和P-gp是可以和CYP3A一起被誘導(dǎo)的。CYP3A對所有已知的誘導(dǎo)劑都很敏感。因此，考察受試藥物能否能夠誘導(dǎo)CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19和CYP3A時(shí)，只需要體外考察對CYP1A2和CYP3A酶的誘導(dǎo)情況即可。若體外實(shí)驗(yàn)顯示受試藥物對CYP3A無誘導(dǎo)作用，那么就可以免做對CYP2C和CYP2B的誘導(dǎo)研究。目前十頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)3.體內(nèi)藥物相互作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究群體底物和作用藥物的選擇給藥途徑給藥劑量目前十一頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路：比較底物（S）濃度在有和沒有作用藥物（I）時(shí)的變化情況。隨機(jī)交叉法（先服用S后服用S+I組、先服用S+I組后服用S組）單次序交叉法（總是先服用S后服用S+I組、或相反）平行設(shè)計(jì)（一組服用S,一組服用S+I）目前十二頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)設(shè)計(jì)方案時(shí)應(yīng)該注意：(1)如果實(shí)驗(yàn)需要達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度而底物或作用藥物和(或)其代謝物的半衰期較長,此時(shí)不能采用額外給予一個(gè)負(fù)荷劑量的方法加快達(dá)到穩(wěn)態(tài)。(2)如果作用藥物是一個(gè)快速可逆的抑制劑,其服用時(shí)間應(yīng)該在測定當(dāng)天服用底物前或同時(shí)服用,這樣才能增加其敏感性。對于基于作用機(jī)制的抑制劑(如紅霉素),在服用底物藥物前服用作用藥物可以放大相互作用強(qiáng)度。如果作用藥物(抑制劑或誘導(dǎo)劑)的吸收受多種因素的影響(如胃pH值),則需要采取適當(dāng)?shù)姆椒刂莆辗矫娴淖兓?3)為了排除由于食物、飲料、果汁等影響代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而引起誤差,指南建議實(shí)驗(yàn)過程中要嚴(yán)格控制飲食。目前十三頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)3.2研究群體一般是健康受試者。在特定環(huán)境下，受試藥物表現(xiàn)的治療效果或者藥效學(xué)效果不在健康者身上出現(xiàn)，此時(shí)要從患者群體中招募受試者。藥物相互作用的程度可能因受試者某個(gè)具體CYP酶的基因型不同而有所差異。目前十四頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)3.3底物和作用藥物的選擇表二：指南推薦的CYP酶底物。目前十五頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)目前十六頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)“雞尾酒”模式釋義：在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中受試者同時(shí)服用多種CYP酶底物。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需考慮下列因素：(1)一種特定酶的底物對該酶具有較高的選擇性;(2)底物之間沒有相互作用發(fā)生;(3)受試者的數(shù)量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。(4)藥物濃度變化在安全范圍內(nèi);(5)入選的CYP酶都參與藥物代謝消除;(6)藥物其他代謝途徑或者不被抑制的途徑的藥物清除率低。目前十七頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)評(píng)價(jià)：這種雞尾酒實(shí)驗(yàn)的陰性結(jié)果可以免除對其中某個(gè)具體酶的進(jìn)一步評(píng)價(jià),然而陽性結(jié)果則需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究。雞尾酒實(shí)驗(yàn)可比單個(gè)相互作用研究提供更多的信息,而結(jié)論的確定程度取決于藥物其他不被抑制的代謝途徑的清除率分?jǐn)?shù)(清除率分?jǐn)?shù)越小,確定程度越高)。如果單一的相互作用實(shí)驗(yàn)顯示抑制效應(yīng)可以導(dǎo)致嚴(yán)重的安全隱患,則不能進(jìn)行雞尾酒設(shè)計(jì)法。目前十八頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)3.4給藥途徑受試藥物的給藥途徑應(yīng)與將來臨床應(yīng)用的方式一致。體內(nèi)相互作用研究采取的給藥方式取決于未來上市劑型。目前十九頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)3.5給藥劑量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)盡可能將底物和作用藥物相互作用的結(jié)果最大化，因此指南推薦作用藥物（抑制劑/誘導(dǎo)劑）使用最大安全劑量和最短給藥間隔。當(dāng)使用低于臨床常用劑量的給藥方案時(shí)，體內(nèi)藥物相互作用研究方案應(yīng)在結(jié)果報(bào)告中進(jìn)行討論。目前二十頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)4.藥物代謝酶的確認(rèn)如果某個(gè)酶對藥物的代謝量占整個(gè)藥物消除量>25%,則可以確認(rèn)此酶是藥物的主要代謝酶。將藥物和肝細(xì)胞或肝切片一起孵育,然后通過色譜方法分析孵育介質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,這種方法可以直接獲得氧化、水解或基團(tuán)轉(zhuǎn)移形成的代謝物,提供平行代謝還是先后代謝的信息。另一種方法是用HPLC來分析孵育介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)還需要優(yōu)化介質(zhì)中受試藥物濃度和孵育時(shí)間。臨床預(yù)期的穩(wěn)態(tài)血藥濃度可以用來指導(dǎo)體外實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中藥物濃度的選擇。目前二十一頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)有三種方法可以很好地確認(rèn)不同的CYP酶對藥物代謝的貢獻(xiàn):(1)特定的化學(xué)物質(zhì)或抗體作為特定酶的抑制劑

表5：列出了常用的特異性化學(xué)抑制劑。在確定代謝酶種類及其在藥物代謝中的相對貢獻(xiàn)時(shí),藥物的濃度要≤Km值,而抑制劑的濃度既要保證其選擇性又要保證足夠的量,所以可以采用一系列的抑制劑濃度。當(dāng)使用基于作用機(jī)制的抑制劑時(shí),最好將抑制劑與酶預(yù)先孵育15～30min。目前二十二頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)目前二十三頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)(2)應(yīng)用不同的人重組CYP酶,這種技術(shù)對研究單個(gè)CYP酶在整個(gè)藥物代謝中的相對貢獻(xiàn)的大小具有很高的價(jià)值,但不能代表人肝微粒體酶中的絕對的代謝比率。(3)根據(jù)不同供體來源的CYP酶不同活性建立人肝微粒體庫。指南建議至少采用上述兩種方法來確認(rèn)藥物代謝酶目前二十四頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)5.CYP酶抑制作用的體外評(píng)價(jià)Review:Ki：抑制率常數(shù)，抑制作用越強(qiáng)，此值越小IC50

：反應(yīng)被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度，越低表明抑制劑的抑制能力越強(qiáng)。目前二十五頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)5.CYP酶抑制作用的體外評(píng)價(jià)CYP酶抑制劑體外實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng):(1)IC50測定時(shí),在底物代謝率允許的情況下,盡量使底物的濃度低于其Km值,使IC50與其Ki值更具相關(guān)性;(2)肝微粒體蛋白濃度通常<1g·L-1;(3)緩沖液的性質(zhì)、pH對Vmax和Km的影響顯著,盡可能采用標(biāo)準(zhǔn)化的分析條件;(4)反應(yīng)系統(tǒng)中最好控制底物或抑制劑的消耗不超過10%～30%,但是對于Km值很低的藥物來說,控制反應(yīng)體系底物消耗<10%很困難;目前二十六頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)(5)建議建立時(shí)間-產(chǎn)物形成量的線性關(guān)系;(6)建議建立酶量-產(chǎn)物形成量的線性關(guān)系;(7)因?yàn)槟承┯袡C(jī)溶劑具有酶誘導(dǎo)或抑制作用,溶劑的濃度都要<1%(v/v),最好<0.1%,實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括無溶劑對照和溶劑對照;(8)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有一個(gè)已知抑制劑的陽性對照。目前二十七頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)相互作用程度的模擬：R=1+[I]/Ki（[I]代表作用部位抑制劑的濃度,Ki是抑制常數(shù)）指南推薦體內(nèi)相互作用的可能性通過[I]/Ki來推斷,[I]代表服用臨床最大用藥量后平均穩(wěn)態(tài)的藥物濃度(游離或結(jié)合的全部藥物),比值升高,產(chǎn)生相互作用的可能性增大。目前二十八頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)盡管通過體外數(shù)據(jù)定量預(yù)測體內(nèi)相互作用發(fā)生的可能性存在困難,但可以通過同一個(gè)藥物對不同CYP酶(CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19、CYP2D6和CYP3A)的Ki值進(jìn)行篩選排序,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)從[I]/Ki

最大者(或者Ki最小者)的CYP酶開始,如果實(shí)驗(yàn)顯示體內(nèi)不存在藥物相互作用,其他的[I]/Ki相對較小的CYP酶的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)就可以不做。目前二十九頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)6.CYP酶誘導(dǎo)作用的體外評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)包括一個(gè)公認(rèn)的酶誘導(dǎo)劑作為陽性對照,來減小不同供體酶催化活性差異引起的誤差。表7:誘導(dǎo)劑選擇列表目前三十頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)目前三十一頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：(1)受試藥物的濃度應(yīng)該參考臨床治療劑量的血藥濃度,至少包括3個(gè)涵蓋治療窗的篩選濃度,其中至少1個(gè)濃度要超過平均預(yù)期治療濃度1個(gè)數(shù)量級(jí);(2)與肝細(xì)胞共孵育2～3d后,通過CYP特異的探針?biāo)幬?參考指南推薦)測定酶活性;(3)使用新鮮分離的或者凍存的肝細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)該至少選擇3份不同的供體以減少誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中存在的個(gè)體差異。目前三十二頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)評(píng)價(jià)藥物酶誘導(dǎo)作用時(shí),指南建議:(1)藥物體外實(shí)驗(yàn)引起的酶活性的改變≥40%陽性對照結(jié)果時(shí),可以認(rèn)為藥物具有酶誘導(dǎo)作用,需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究;(2)EC50可以用來比較不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)能力的強(qiáng)弱;(3)指南認(rèn)為,根據(jù)目前了解的CYP酶誘導(dǎo)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制,如果一個(gè)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示對CYP3A4酶沒有誘導(dǎo)作用,可以推斷此藥物對CYP2C8,CYP2C9和CYP2C19也沒有誘導(dǎo)作用。目前三十三頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)7.P-gp底物和抑制劑的體外實(shí)驗(yàn)研究考察藥物是否是P-gp的底物或抑制劑,最常見的方法有哪些？目前三十四頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)雙向轉(zhuǎn)運(yùn)測定法由于更直接,因此被作為標(biāo)準(zhǔn)的方法。ATP酶活性測定法和攝取/外排法可以用于快速篩選,但是不能區(qū)分是底物還是抑制劑。如果藥物透過性(膜擴(kuò)散能力)低,ATP酶法和熒光定量法常常無法識(shí)別是否是P-gp的底物。對高通透性化合物,雙向轉(zhuǎn)運(yùn)測定法也不適用。目前三十五頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)這些底物作為陽性對照，保證實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞能夠表達(dá)功能性的P-gp.目前三十六頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)7.1雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)確定藥物是否是P-gp的底物選擇好細(xì)胞系和P-gp底物陽性對照后,遵循下列步驟完成實(shí)驗(yàn):(1)設(shè)計(jì)幾個(gè)不同的藥物濃度(如1,10,100μmol·L-1)考察P-gp對藥物的外排作用;(2)實(shí)驗(yàn)開始前,將極性細(xì)胞組成的膜兩側(cè)的介質(zhì)去掉,加入新的介質(zhì)并孵育30min;(3)進(jìn)行雙向膜轉(zhuǎn)運(yùn)通透性研究:在極性膜的A側(cè)(apical側(cè),腔側(cè),頂區(qū)側(cè),轉(zhuǎn)運(yùn)方向是A→B)或B側(cè)(basolateral側(cè),基底側(cè),轉(zhuǎn)運(yùn)方向是B→A)加入適量體積的含有已知P-gp底物或受試藥物的緩沖液;(4)在37°C孵育,在預(yù)定的時(shí)間(通常是1,2,3,4h)收集受側(cè)的介質(zhì)測定藥物濃度,同時(shí)迅速補(bǔ)充緩沖液;目前三十七頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)(5)已知P-gp底物作為陽性對照進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn);(6)當(dāng)采用LLC2PK1-MDR1MDCK-MDR1作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系時(shí),相應(yīng)的野生型細(xì)胞系LLC-PK1和MDCK作為陰性對照;(7)每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少在不同日期重復(fù)3次,考察日間和日內(nèi)變異情況;(8)理想的實(shí)驗(yàn)還應(yīng)該測定底物的回收率,來消藥物代謝和非特異性結(jié)合帶來的誤差目前三十八頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)由于Caco-2、野生型的LLC-PK1和MDCK也能表達(dá)其他外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,因此在評(píng)價(jià)藥物是否是P-gp底物時(shí)要謹(jǐn)慎,為增加實(shí)驗(yàn)的可信性,建議增加P-gp抑制劑(表10)存在下的底物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),如果藥物的外排可被P-gp抑制劑明顯抑制,則說明藥物的外排與P-gp有關(guān)。指南還建議,可以通過實(shí)驗(yàn)對比MDR1過度表達(dá)細(xì)胞(轉(zhuǎn)染型細(xì)胞)和它們的野生型細(xì)胞對藥物外排活性的差異,確定P-gp在藥物外排中的貢獻(xiàn)大小。目前三十九頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)利用下列公式描述藥物跨膜表觀通透性:Papp=(Vr/c0)(1/S)(dc/dt)其中,Vr是極性膜受側(cè)介質(zhì)體積,c0是指膜供側(cè)實(shí)驗(yàn)藥物的濃度,S是指極性細(xì)胞形成的膜的面積,dc/dt是受側(cè)介質(zhì)藥物濃度與時(shí)間曲線的斜率。準(zhǔn)確計(jì)算Papp必須要求受側(cè)藥物濃度與時(shí)間是直線關(guān)系。藥物經(jīng)P-gp外排速率RE可以通過下列公式計(jì)算:RE=PB/A/PA/BPB/A和PA/B分別代表受試藥物B→A和A→B的跨膜表觀通透性。目前四十頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)7.2雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)確定藥物是否是P-gp抑制劑(1)使用Caco-2細(xì)胞系時(shí),要使用無藥介質(zhì)作為空白對照,測試藥物的濃度要適宜;(2)當(dāng)采用LLC-PK1-MDR1和MDCK-MDR1作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系時(shí),相應(yīng)的野生型細(xì)胞系LLC-PK1和MDCK作為陰性對照;(3)37℃孵育細(xì)胞系0.5～1h后,去除孵育介質(zhì),換成濃度合適的P-gp探針底物(表9);(4)孵育細(xì)胞系1～3h后,測定受側(cè)介質(zhì)中P-gp探針底物的濃度;(5)每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少在不同日期重復(fù)3次,每個(gè)實(shí)驗(yàn)也要用至少3個(gè)極性細(xì)胞膜進(jìn)行測定。目前四十一頁\總數(shù)四十五頁\編于十三點(diǎn)7.3