HIV實驗室質(zhì)量管理

艾滋病實驗室質(zhì)量管理目前一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點實驗室質(zhì)量管理行政支持

行政部門和領(lǐng)導(dǎo)HIV實驗室建設(shè)和發(fā)展資金人員監(jiān)督支持人員培訓(xùn)

每年市疾控中心組織上崗證環(huán)境條件：實驗室的設(shè)置及其建筑、設(shè)施、設(shè)備必須符合《全國艾滋病檢測工作管理辦法》的要求。HCV，HBV及梅毒等血清學(xué)檢測在滿足實驗室管理要求和保證生物安全的條件下，可以與HIV檢測共享空間和設(shè)備，應(yīng)避免交叉污染。目前二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點實驗室質(zhì)量管理樣品采集、運送和處理送檢單收樣登記表HIV抗體復(fù)檢檢測單檢測方法和試劑的選擇試劑的出入庫及使用記錄供應(yīng)品、耗材（試劑）質(zhì)量驗收記錄表目前三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點實驗室質(zhì)量管理設(shè)備維護與校準儀器設(shè)備溫度記錄表儀器設(shè)備使用、檢定、維修、維護記錄本強檢計量器具周期檢定（自校）計劃表文件和文件管理實驗原始記錄表結(jié)果報告樣品登記和保存（唯一編碼）目前四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點實驗室質(zhì)量管理文件和文件管理標(biāo)準操作程序（SOP）（1）樣品的接收、登記、處理、保存和運輸；（2）檢測方法和步驟；（3）試劑使用和保存；（4）儀器的使用維護和校準；（5）質(zhì)量控制要求及程序；（6）結(jié)果解釋與報告；（7）保密程序；（8）實驗室數(shù)據(jù)、相關(guān)文件記錄與保存；（9）不確定樣品追蹤和處理；（10）實驗室安全防護及實驗室的清理和消毒。文件存檔（保存10年以上）目前五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點ELISA實驗影響因素目前六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素樣品溶血標(biāo)本及混有紅細胞的血清采用ELISA法檢測易產(chǎn)生假陽性

可能是溶血血清中含有過氧化酶物質(zhì)（紅細胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，它可使過氧化氫釋放出原生態(tài)氧，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì)，即顯藍色，產(chǎn)生假陽性。輕微溶血沒事，嚴重溶血的標(biāo)本易產(chǎn)生假陽性。受細菌污染的標(biāo)本因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。目前七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素樣品塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性

，最好使用真空采血管或抗凝管。（抗凝劑會略有影響，但影響不大）標(biāo)本凝固不全在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。目前八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素按說明書要求，實驗前應(yīng)取出試劑穩(wěn)定加樣加樣的量要準確移液器要經(jīng)常清洗定期校準加樣位置孔壁1/3以下不可濺出不可產(chǎn)生氣泡必須使用一次性TIP頭，嚴格控制，防止交叉污染先加稀釋液的，加樣時可用移液器孔內(nèi)吹打混勻移液器的校準可以送檢，可以自校，自校要有SOP有記錄目前九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素孵育時間嚴格按照試劑盒說明書操作容易控制溫度嚴格按照試劑盒說明書操作用校準的溫度計監(jiān)測溫度，特別是冬天，避免因溫度過低導(dǎo)致假陰性。封板孵育時不貼封片或加蓋，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁,難以清洗徹底。恒溫孵育設(shè)備的使用與維護校準的溫度計監(jiān)測ELISA反應(yīng)溫度水浴的尤其要注意水位目前十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素洗板洗液的量試劑不同，板孔的大小差異會導(dǎo)致洗液的量的不同，為保證洗的徹底，原則是量足夠多且不會逸出。浸泡時間嚴格按照試劑盒說明書操作，一般30-60秒，不設(shè)置浸泡時間或時間太短，洗脫不徹底的話會產(chǎn)生“花板”。保持針孔通暢不阻塞血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機的針孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”。應(yīng)做好洗板機的維護工作。拍板目前十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素洗板機的檢定、使用及維護檢定：注液量和殘留量（每孔＜5微升）使用：設(shè)置程序（注液量、洗板次數(shù)、浸泡時間、洗板位置）維護：消毒液沖洗，蒸餾水沖洗目前十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素顯色加底物時，應(yīng)懸空加液，避免觸及板孔內(nèi)壁造成交叉污染。應(yīng)先加底物緩沖液A再加TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物B，加入順序不能顛倒。已顯淺藍色的TMB底物堅決不能用。個別試劑要求A、B液先混合后再加。溫度與時間的控制。目前十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素終止及讀板讀板前應(yīng)保證板孔底部干凈，無異物，無水氣，無氣泡，特別是在冬天。酶標(biāo)儀不應(yīng)放置在陽光或強光照射下,操作時室溫宜在15-30℃,使用前先預(yù)熱15-30min,測讀板結(jié)果會更穩(wěn)定。酶標(biāo)儀必須檢定標(biāo)準板廠家目前十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素Cutoff值計算及結(jié)果判定注意事項嚴格按照試劑說明書要求的數(shù)量做陰、陽性對照根據(jù)陰、陽性對照的值判定實驗是否成立嚴格按照試劑說明書要求計算Cutoff值注意空白目前十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點原始記錄標(biāo)明空白對照、陽性對照、陰性對照、外部對照以及待檢樣品的位置試劑盒廠家、測定方法、批號、效期操作人員和復(fù)核人員姓名（簽名）檢測日期其他（環(huán)境、設(shè)備、實驗依據(jù)等）注意樣本的溯源性目前十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點廢棄物處理消毒液（含氯消毒劑、75%乙醇、2%戊二醛）干烤消毒（140℃2-3h）高壓蒸汽消毒（121℃15-20min）高壓滅菌器檢定：溫度和壓力高壓滅菌器使用效果監(jiān)測：化學(xué)指示卡，生物監(jiān)測（嗜熱脂肪桿菌芽孢）目前十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點ELISA實驗質(zhì)量控制目前十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點ELISA的質(zhì)量控制試劑盒內(nèi)部對照：試劑盒內(nèi)部對照質(zhì)控品即為試劑盒內(nèi)提供的陽性和陰性對照血清。試劑盒內(nèi)部對照用于判斷每次實驗的有效性，但不能作為室內(nèi)質(zhì)控品使用。每一次檢測臨床樣品時，必須有試劑盒內(nèi)部對照，而且只能在同批號的試劑盒中使用。內(nèi)部對照結(jié)果無效，必須重新試驗。室內(nèi)質(zhì)控品：為非試劑盒組份的外部質(zhì)控品，是為了監(jiān)控檢測的重復(fù)性而設(shè)置的，包括強陽性、弱陽性和陰性質(zhì)控血清。也可以只設(shè)置一個弱陽性質(zhì)控，以該試劑盒臨界值（Cut-off）的2～3倍為宜。外部質(zhì)控品的作用是，判斷該批臨床樣品檢測的有效性，因此，每次實驗必須包含室內(nèi)質(zhì)控品，其結(jié)果無效，必須重新試驗。目前十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點室內(nèi)質(zhì)控品的來源商品化的室內(nèi)質(zhì)控品實驗室自己制備（比較經(jīng)濟）混合試劑盒內(nèi)部對照血清，通過做實驗確定陰陽性對照的混合比例，混合，分裝保存?；旌螲IV抗體陽性人血清、HIV抗體陰性人血清，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，0.2μm生物濾膜過濾除菌，56℃30分鐘加熱滅活處理。通過做實驗確定陰陽性血清的混合比例，混合，分裝保存。高濃度商品化室內(nèi)質(zhì)控品再稀釋目前二十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點室內(nèi)質(zhì)控品的保存一次購買或制備量應(yīng)該足夠本實驗室至少一年使用等量分裝，可以按單次使用、單日使用、最長一周使用的量確定每個分裝的量不同室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)做好標(biāo)記，最好使用不同顏色的標(biāo)簽，以防止混用應(yīng)存放于-70℃以下，如無條件則存放于非自動除霜的-20℃冰箱一旦融解后應(yīng)存放于2-8℃，一周后必須棄去，不能重新凍存使用目前二十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點樣品的采集、處理、保存、運送及接收目前二十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點樣品的采集和處理建議用K2EDTAK3EDTA枸櫞酸鈉的抗凝管采血,不用肝素抗凝管采血血漿1500-3000r/min離心15min，吸上層血漿血清室溫自然放置1-2h，待血液凝固、血塊收縮后1500-3000r/min離心15min，吸上層血清目前二十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點樣品的保存建議用1.5ml-2.0ml的螺口凍存管或離心管保存.抗體及抗原檢測的血清或血漿樣品應(yīng)存放于-20℃以下,一周內(nèi)檢測的樣品2-8℃目前二十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點樣品的保存盡量多分裝保存目前二十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點樣品的運送要求樣本量>1ml樣本的質(zhì)量無嚴重溶血，無微生物污染，無血脂過多，無嚴重黃疸等管子的質(zhì)量防漏三層包裝單管包裝重新采樣目前二十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點樣品的運送要求樣品和送檢單分開專人送樣專門運送箱（實驗室人員號碼和聯(lián)系方式）市疾控確證實驗室血清or血漿2-8度運送或者凍存狀態(tài)下直接運送目前二十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點送樣單要求送樣單打印檢測者/審核者手簽，單位或?qū)嶒炇疑w章信息完整(真實姓名、送檢人群、身份證號碼、聯(lián)系電話、現(xiàn)地址及戶籍地址等)詳細的樣本來源(監(jiān)管場所的具體到哪個監(jiān)管場所)充分利用備注欄規(guī)范性(試劑、cutoff值等)目前二十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點樣品的接收打開包裝，注意生物安全，個人防護核對樣品與送檢單，檢查樣品管有無破損和溢漏記錄一般記錄，另外記錄有無嚴重溶血，微生物污染、血脂過多及黃疸等情況開蓋生物安全柜中，個人防護目前二十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體檢測目前三十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體檢測的目的HIV抗體檢測可用于診斷、血液篩查、監(jiān)測等。以診斷為目的的檢測是為了確定個體HIV感染狀況，包括臨床檢測、自愿咨詢檢測、根據(jù)特殊需要進行的體檢等。以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播HIV，包括獻血員篩查和原料血漿篩查。以監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群HIV感染率及變化趨勢，包括各類高危人群、重點人群和一般人群。目前三十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體檢測的要點根據(jù)目的選擇檢測方法及檢測策略。嚴格遵守實驗室標(biāo)準操作程序（SOP）。篩查試驗陽性，須做確證試驗。篩查試驗陰性，不應(yīng)做確證試驗。目前三十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體篩查試驗流程樣品初篩試驗篩查試劑陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)復(fù)檢試驗原有試劑+另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑一陰一陽均陰性反應(yīng)均陽性反應(yīng)確證試驗報告陰性目前三十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點篩查試劑國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準ELISA試劑批批檢合格，在有效期內(nèi)推薦使用經(jīng)臨床質(zhì)量評估敏感性和特異性高的試劑初篩試劑高敏感性復(fù)檢試劑高特異性目前三十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點目前三十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點目前三十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點目前三十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點篩查樣品血清血漿全血DBS/DPS唾液尿液目前三十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點篩查方法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）第三代試劑雙抗原夾心法單純檢測HIV抗體第四代試劑抗原抗體聯(lián)合診斷試劑同時檢測P24抗原和抗HIV-1/2抗體縮短窗口期注意復(fù)檢試劑的選擇化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗快速檢測（RT）目前三十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點篩查試驗的結(jié)果報告HIV抗體篩查試驗陰性反應(yīng)報告為“HIV抗體陰性”HIV抗體篩查試驗陽性反應(yīng)報告為“HIV抗體待復(fù)檢”HIV抗體復(fù)檢試驗兩次檢測均陰性報告為“HIV抗體陰性”HIV抗體復(fù)檢試驗兩次檢測均陽性或一陰一陽報告為“HIV抗體待確證”目前四十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒嬰兒會由于被動攜帶母親的抗體而連續(xù)幾個月至十幾個月出現(xiàn)抗體陽性。嬰兒滿12個月進行第一次HIV抗體檢測。使用兩種不同原理或不同廠家篩查試劑進行抗體檢測，兩種篩查試劑檢測結(jié)果均為陰性反應(yīng)，報告HIV抗體陰性，可排除感染。檢測結(jié)果出現(xiàn)陽性反應(yīng)（一種為陰性反應(yīng)一種為陽性反應(yīng)或兩種均陽性反應(yīng)），不能排除感染，應(yīng)繼續(xù)追蹤隨訪，至兒童滿18個月時再次進行HIV抗體檢測。目前四十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒嬰兒滿18個月時應(yīng)再次進行HIV抗體檢測。使用兩種不同原理或不同廠家篩查試劑進行抗體檢測。兩種篩查試劑的檢測結(jié)果均為陰性反應(yīng)，報告HIV抗體陰性，可排除感染。檢測出現(xiàn)陽性反應(yīng)（一種為陰性反應(yīng)一種為陽性反應(yīng)或兩種均呈陽性反應(yīng)），進一步進行確證試驗，根據(jù)確證試驗的結(jié)果判斷是否感染HIV。做好檢測后咨詢。目前四十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體檢測結(jié)果解釋HIV抗體陰性—未發(fā)生感染（排除“窗口期”）HIV抗體不確定非特異性的反應(yīng)感染早期感染晚期HIV抗體陽性—發(fā)生感染（排除疫苗使用）目前四十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體快速檢測目前四十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體快速檢測快速檢測，是艾滋病實驗室多了一種檢測方法快速檢測，是為了更多更快的發(fā)現(xiàn)感染者快速檢測，不是為了取代實驗室，但不能因為有了實驗室而放棄使用快速檢測快速檢測手段能否成為新型檢測-咨詢模式，或基于醫(yī)療機構(gòu)的有效的檢測方法----取決于檢測的質(zhì)量目前四十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體快速檢測方法—PA明膠顆粒凝集試驗（PA）：將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用。當(dāng)待檢樣品含有HIV抗體時，明膠顆粒與抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，根據(jù)凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種:同時檢測HIV-1和HIV-2抗體以及分別檢測HIV-1和HIV-2抗體。有效試驗必須有陰性和陽性質(zhì)控。目前四十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體快速檢測方法—免疫滲濾試驗免疫滲濾試驗：斑點ELISA和斑點免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗。以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原點狀固定在膜上，加待檢樣品。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應(yīng)時間在10分鐘以內(nèi)。有效試驗的質(zhì)控點必須顯色。目前四十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體快速檢測方法—免疫層析試驗免疫層析試驗：以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品（血液或唾液）沿著固相載體遷移，陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗的質(zhì)控帶必須顯色。目前四十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點結(jié)果判讀—嚴格參照試劑說明書反應(yīng)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶為陽性。質(zhì)控區(qū)有條帶，反應(yīng)區(qū)無條帶為陰性。質(zhì)控區(qū)無條帶則實驗無效。目前四十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點HIV抗體快速檢測的外部質(zhì)控外部對照質(zhì)控品，可采用商用質(zhì)控品或自制質(zhì)控品。質(zhì)控品應(yīng)包含抗體陽性樣品和陰性樣品。自制質(zhì)控品可使用本室保留的陽性樣品。不能使用酶聯(lián)試驗的外部質(zhì)控品。下列情況需做質(zhì)量控制：更換試劑批號；更換檢測人員；更換包裝；每個檢測日；更換試劑廠家。建議：每個檢測日檢測一次陽性和陰性質(zhì)控品；如果日檢測量大于50份樣品，至少應(yīng)作2次質(zhì)控。目前五十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點快速檢測的注意事項不提倡個人在家中檢測。應(yīng)由經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員操作，注意生物安全操作，避免職業(yè)暴露發(fā)生。在質(zhì)控窗口內(nèi)應(yīng)出現(xiàn)質(zhì)控帶，如實驗完成后未呈現(xiàn)質(zhì)控帶，說明試劑盒內(nèi)質(zhì)控?zé)o效，該試驗結(jié)果無效，樣品須重檢。出現(xiàn)以下問題，提示存在質(zhì)量隱患，應(yīng)引起重視：運輸包裝、內(nèi)盒或試劑盒的物理損傷；在單包裝內(nèi)存在混雜物質(zhì)；標(biāo)簽出現(xiàn)錯誤、缺失或字跡模糊（特別是產(chǎn)品名稱或出產(chǎn)廠家名稱，批號和貨號，失效期或/和生產(chǎn)日期）；缺失目錄；泄漏或污染；不適宜的存放條件；保護包裝紙破損或污染。目前五十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點快速檢測的注意事項環(huán)境溫度,尤其是在冬天血清/血漿全血稀釋緩沖液樣本的量反應(yīng)的時間生物安全廢棄物處理做好實驗的原始記錄目前五十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點不同廠家的快檢試劑操作要求廠家樣品要求血量(ul)樣品稀釋是否加緩沖液最小反應(yīng)時間(分鐘)最大反應(yīng)時間(分鐘)試劑儲存要求明膠顆粒法(PA)血清/血漿251:32N120/2-10℃DETERMINE血清/血漿/全血50N用全血時加1滴15602-30℃SD血清10NN5