FISH法檢測石蠟miRNA總結(jié)

熒光原位雜交技術(shù)（fluorescenceinsituHybridization,FISH）目前一頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)定義：熒光原位雜交技術(shù)（fluorescenceinsituHybridization,FISH）是一種非放射性原位雜交方法，用特殊的熒光素標(biāo)記DNA探針，在染色體、細(xì)胞或組織切片標(biāo)本上進(jìn)行DNA雜交，以檢測細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA特定序列存在與否。目前二頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)FISH的基本原理用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而探針可以直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。目前三頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)雜交所用的探針大致可以分類三類：1）染色體特異重復(fù)序列探針，例如α衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號(hào)強(qiáng)，易于檢測；2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。目前四頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)探針的熒光素標(biāo)記方法：間接標(biāo)記法：是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測，同時(shí)還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測500bp的片段。直接標(biāo)記法：是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測時(shí)步驟簡單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。目前五頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)目前六頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)應(yīng)用范圍：FISH檢測對(duì)被測樣本沒有特殊的要求。骨髓的細(xì)胞羊水的細(xì)胞冰凍切片的樣本，石蠟包埋的樣本尿液樣本（獲取的樣本細(xì)胞也無需經(jīng)過培養(yǎng)擴(kuò)增，F(xiàn)ISH檢測可以顯示單個(gè)細(xì)胞核內(nèi)）目前七頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟試劑準(zhǔn)備脫蠟蛋白酶處理變性雜交細(xì)胞核染色目前八頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)試劑準(zhǔn)備：（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀釋而成，儲(chǔ)存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）：175.3g

NaCl，88.2g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L

NaOH調(diào)pH

至7.0）（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀釋而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。（5）變性液(70％甲酰胺2×SSC，pH7.0)：4ml20×SSC；8ml蒸餾水；28ml甲酰胺。每次新鮮配制。（6）雜交后洗滌液：20×SSC4ml；蒸餾水16ml；甲酰胺20ml。每次新鮮配制。調(diào)節(jié)pH前升至室溫。目前九頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)脫蠟（1）二甲苯脫蠟3次，每次5min；（2）100％酒精兩次，每次2min；（3）移出酒精，斜置切片，標(biāo)記末段向下，空氣干燥。目前十頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)蛋白酶處理（1）每個(gè)染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC40ml倒入Facal管，在水浴槽中預(yù)熱。將消化酶液加入管內(nèi)，搖動(dòng)直到酶溶解。（2）37℃水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。（3）2×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。（4）梯度(70%、90%、100%)酒精脫水（-20℃預(yù)冷），空氣中干燥。目前十一頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)變性（1）每一個(gè)立式染色缸配制40ml變性溶液；（2）78℃水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸；（3）78℃孵育8min；（4）即移入-20℃預(yù)冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃預(yù)冷酒精內(nèi)，每缸2min；（5）空氣干燥。目前十二頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)雜交（1）準(zhǔn)備探針；（2）取一個(gè)較大的濕盒，交叉放置切片；（3）滴10μl探針在切片的組織上，加蓋玻片；（4）蓋上濕盒蓋，37℃孵育12~16h。目前十三頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)雜交雜交后水洗：（5）鑷子小心去除蓋玻片；（6）43℃預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min；（7）2×SSC（37℃）洗兩次，每次10min；（8）切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測，勿使切片干燥。目前十四頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)雜交（9）從1×PBS中取出切片，除去過多的水分，避免標(biāo)本干燥。把切片放入濕盒內(nèi)，同時(shí)處理4張切片。（10）每張切片使用30~60μl羅丹明抗-地高辛抗體（抗地高辛單克隆抗體）或FITC卵白素，室溫下孵育20min；（11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。目前十五頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)雜交（12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；（13）每張切片滴30~60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；（14）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min；（15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；（16）每張切片滴30~60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；（17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。目前十六頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞核染色（1）每張切片加10~20μlDAPI，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2~5min；（2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察。目前十七頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。目前十八頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)檢驗(yàn)儀器1、流式細(xì)胞儀2、熒光顯微鏡3、共聚焦目前十九頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)單一染色目前二十頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)多重染色目前二十一頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)光色波長λ（nm）代表波長：紅（Red）630~780、700橙（Orange）600~630、620黃（Yellow）570~600、580綠（Green）500~570、550青（Cyan）470~500、500藍(lán)（Blue）420~470、470紫（Violet）380~420、420=目前二十二頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，一步式反應(yīng)，能迅速得到結(jié)果，一次標(biāo)記后可使用二年。方法敏感，敏感程度等同甚至超過放射性同位素原位雜交。在同一標(biāo)本上，可同時(shí)應(yīng)用幾種不同探針，標(biāo)記不同的顏色?？捎糜诜至鸭?xì)胞和靜止期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究。目前二十三頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)技術(shù)延伸：熒光原位雜交技術(shù)可以傳統(tǒng)技術(shù)完美結(jié)合：1、FISH和細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合，可以同時(shí)用多種不同顏色標(biāo)記不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)，這樣可以在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)找到基因的位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄和翻譯的產(chǎn)物，有助了解核苷酸結(jié)構(gòu)功能以及與蛋白質(zhì)表達(dá)之間的關(guān)系。2、FISH技術(shù)和RFLE（RESTRICTFRAGMENTLENTHPOLYMORPHSIM）結(jié)合，可以精確地描述染色體長，短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體核型或復(fù)雜片段的性質(zhì)。在基因圖譜繪制中，F(xiàn)ISH和Linkagemapping結(jié)合起來即使對(duì)具有高度多形態(tài)的基因位點(diǎn)也能較精確地確定下來。目前二十四頁\總數(shù)二十五頁\編于十三點(diǎn)引用文獻(xiàn)[1]YanYang,DavidS,Geldmacher,etal.DNAReplicationPrecedesNeuronalCellDeathinAlzheimer’sDisease[J].TheJournalofNeuroscience,2001,21(8):2661–2668[2]BirgitMosch,