真菌毒素的檢驗

真菌毒素的檢驗第一頁，共32頁。1.概述真菌毒素--由真菌生產(chǎn)的有毒代謝產(chǎn)物。具有毒性、致癌性、致突變型和致畸性等?！岸灸⒐健⒚陨覃?、醉谷病”真菌毒素的危害：（1）引起糧食作物的病害和產(chǎn)品腐敗變質(zhì)；（2）對人類和動物健康產(chǎn)生威脅。第二頁，共32頁。2.真菌毒素分類按產(chǎn)生菌可分為：曲霉毒素類、青霉毒素類、鐮刀菌毒素類等。水活度（Aw對真菌生長和產(chǎn)毒影響較大。真菌毒素毒性：（1）致DNA損傷，有的致癌；（2）細胞毒性，有的破壞質(zhì)膜和細胞酶的作用常見的真菌性食物中毒：黃曲霉毒素中毒、黃變米或灰變米中毒，赤霉沼渣粉中毒等。第三頁，共32頁。3.真菌毒素檢測基本步驟1.采樣和樣品的準(zhǔn)備（1）采樣的地點根據(jù)分析目的的不同確定采樣地點，如：農(nóng)田、倉庫、加工廠、運輸工具、零售商和醫(yī)院等。（2）采樣方法1）靜態(tài)樣品的采集靜態(tài)樣品：麻袋、箱柜和車廂等容器存放分樣品均屬靜態(tài)樣品。采樣工具：頂端尖銳的長柄采樣釬子。采樣數(shù)量：小批量時采1/4；大批量時為整批麻袋數(shù)第四頁，共32頁。2）動態(tài)樣品的采集用商品化的十字交叉切分自動采樣器（3）采樣量采大樣，按四分法對角連續(xù)多次分樣縮減至1－2kg，最后取代表樣全部粉碎。美國農(nóng)業(yè)部USDA的方法：成批樣每批取3份大樣，每份22kg。實驗室分析用的樣品為1－5kg。第五頁，共32頁。2.提取1.提取溶劑溶劑的選擇取決于待測毒素的種類、毒素性質(zhì)、毒素在提取溶劑中的溶解度、提取溶劑的毒性價格、非測定成分在提取溶劑中的分配系數(shù)等。選用：毒性小、極性大、價格低廉的溶劑系統(tǒng)常用溶劑：甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一種或多種不同配比的混合物。2.提取溫度溫度影響毒素的回收率，適當(dāng)升高溫度可以增加毒素的回收率。3.食品基質(zhì)固體食品：選用浸劑、洗脫、索氏回流等方法。液體食品：液－液分配方法。提取酸性真菌毒素時，通常需提高提取溶劑系統(tǒng)中水相的pH值，使其有效地將被提取物堿化或形成水溶性堿混合物后，再進行提取。第六頁，共32頁。3.純化純化：在確保不損失待測毒素的前提下除去干擾雜質(zhì)的過程稱為純化。常用凈化方法：液－固萃取、液－液分配、化學(xué)吸附、色譜法、透析法以及SFE法等。使用最廣泛的是色譜法。色譜法：薄層色譜法（柱色譜法最常用）吸附色譜柱常用的吸附劑：硅膠、礬土、氧化鋁、活性炭、弗羅里硅土分配色譜柱常用的填充劑：硅藻土、纖維素。固相提?。◤V泛采用）免疫親和柱IAC（應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的新技術(shù)）第七頁，共32頁。4.檢測（1）薄層色譜法（2）高效液相色譜法（3）氣相色譜法（4）酶聯(lián)免疫吸附試驗第八頁，共32頁。第二節(jié)主要真菌毒素及其檢驗1.黃曲霉毒素（1）特性（2）食品中來源（3）毒性與危害（4）檢測方法第九頁，共32頁。霉菌霉菌均由分枝或不分枝的菌絲構(gòu)成，許多菌絲交織在一起形成菌絲體，菌絲在光學(xué)顯微鏡下呈管狀，2～10um比一般細菌放線菌細胞大幾倍至幾十倍，與酵母菌相似，而其菌絲又分為有隔菌絲和無隔菌絲，再就是根據(jù)其功能不同又分為營養(yǎng)菌絲，氣生菌絲。無隔菌絲：菌絲為長管狀，單細胞，細胞質(zhì)內(nèi)含多個核，其生長過程只表現(xiàn)為菌絲的延長和細胞核的裂殖增多，以及細胞質(zhì)的增加，如毛霉，根霉，犁頭霉。有隔菌絲：為大多數(shù)的。菌絲由橫隔膜分隔成成串的多細胞，每個細胞內(nèi)含有一個或多個細胞核，有些菌絲外觀看起來像多細胞，但橫隔膜上有小孔，使細胞質(zhì)或細胞核，可自由流通，每個細胞功能也相同，如青、曲、白地霉。第十頁，共32頁。營養(yǎng)菌絲（基質(zhì)菌絲）就是在生長過程中，伸入到培養(yǎng)的基質(zhì)中，為真菌提供營養(yǎng)的菌絲。氣生菌絲圖（繁殖菌絲）它主要是伸入到菌周的空氣環(huán)境中，它主要作用是產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生孢子時的氣生菌絲稱繁殖菌絲。霉菌的繁殖主要是由繁殖器官產(chǎn)生孢子，繁殖器管是由繁殖菌絲產(chǎn)生的可以是單細胞，也可是多細胞，有時產(chǎn)生無性孢子，有時產(chǎn)生有性孢子，如青霉，曲霉，在生長過程中，由于生長條件的改變，有時產(chǎn)生有性孢子，有時產(chǎn)生無性孢子，但主要還是以無性孢子為主。有性孢子：子囊孢子，結(jié)合孢子，卵孢子，擔(dān)孢子。無性孢子：分生孢子，關(guān)節(jié)孢子，芽生孢子，孢子襄孢子，厚膜孢子。第十一頁，共32頁。霉菌培養(yǎng)特性的鑒定青、曲--察氏培養(yǎng)基，鐮刀菌、芽枝霉--馬鈴薯葡萄糖瓊脂進行劃線或點種于瓊脂上，25～28℃，定期觀察。①生長速度：培養(yǎng)一定天數(shù)（5、10、15天）測大小，描述常以極慢、慢、中等、快、說明。②菌的顏色：包括子實體，氣生菌絲、菌核，埋伏菌絲及其顏色。③菌落表面構(gòu)造：蔬松，緊密、扁平、隆起，凹陷，或皺褶，有無同心環(huán)，放射溝，并觀察菌全部，中心部，中間部分及邊緣部分。④菌落質(zhì)地：外觀似氈狀、絨毛狀、棉絮狀、羊毛狀、襄狀、粉粒狀、明膠狀或皮革狀。第十二頁，共32頁。1.黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT)的特性AFT目前已分離鑒定出20余種異構(gòu)體，其中最常見的包括B1、B2、G1、G2、M1、M2。特性：⑴紫外線下發(fā)不同顏色的熒光，藍色熒光（Bluefluorescence）為B族，黃綠色熒光（yellow-Greenfluorescence）為G族；M1和M2為B1、B2的羥化衍生物，主要存在于奶（milk）及奶制品、肉類（meat）中，故名M族。⑵呋喃環(huán)有雙鍵者毒性強，具有致癌性；⑶溶于油、氯仿、甲醇等有機溶劑，不溶于水、乙醚、石油醚；⑷耐熱，加熱到280℃才裂解破壞；⑸在中性和酸性溶液中穩(wěn)定，在pH值9-10的強堿性溶液中迅速分解。第十三頁，共32頁。2.黃曲霉毒素的毒性

急性毒性：劇毒物，毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。慢性毒性：動物生長遲緩，肝臟出現(xiàn)亞急性或慢性損傷。三致作用：致癌、致畸、致突變。3.黃曲霉毒素產(chǎn)生的影響因素

培養(yǎng)基：花生、玉米等是黃曲霉的天然培養(yǎng)基。溫度和濕度：最適生長溫度在37℃左右，產(chǎn)毒溫度略低于最適生長溫度，黃曲霉毒素產(chǎn)毒溫度28-32℃，相對濕度85％以上。水分：產(chǎn)毒的適宜水分活度為。pH值：最適pH值為3。第十四頁，共32頁。4.衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)1995年，世界衛(wèi)生組織制定的食品黃曲霉毒素最高允許濃度為15μg/kg。美國規(guī)定人類消費食品和奶牛飼料中的黃曲霉毒含量(指B1+B2+G1+G2的總量)不能超過15μg/kg

。我國的標(biāo)準(zhǔn)玉米、花生、花生油、堅果和干果(核桃、杏仁)≤20μg/kg。大米、其他食用油(香油、菜籽油、大豆油、葵花油、胡麻油、茶油、麻油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油)≤10μg/kg。其他糧食(麥類、面粉、薯干)、發(fā)酵食品(醬油、食用醋、豆豉、腐乳制品)、淀粉類制品(糕點、餅干、面包、裱花蛋糕)≤5μg/kg。牛乳及其制品(消毒牛奶、新鮮生牛乳、全脂牛奶粉、淡煉乳、甜煉乳、奶油)、黃油、新鮮豬組織(肝、腎、血、瘦肉)≤0.5μg/kg。第十五頁，共32頁。5.黃曲霉毒素的檢測方法-①薄層層析法原理：將樣品經(jīng)過提取、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍紫色（B1/B2）或黃綠色熒光（G1/G2)提取檢測薄層板的制備點樣展開與觀察定量試驗②高效液相色譜法提取—凈化—衍生—測定③酶聯(lián)免疫吸附法—競爭抑制法見教材P179第十六頁，共32頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）

是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行。常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP)

堿性磷酸酶（AP）。第十七頁，共32頁。ELISA方法的基本原理（1）使抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，并保持其免疫活性。（2）使抗原或抗體與酶結(jié)合成酶標(biāo)抗原或抗體，并保持抗原或抗體的免疫活性和酶的活性。（3）酶標(biāo)的抗原或抗體與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶催化底物形成水解、氧化或還原反應(yīng)，形成有色物質(zhì)，其顏色的深淺與標(biāo)本中的抗原或抗體的量直接相關(guān)。第十八頁，共32頁。ELISA方法的基本類型

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法第十九頁，共32頁。（一）雙抗體夾心法

洗滌洗滌洗滌待測抗原特異性抗體吸附于固相載體酶標(biāo)抗體和底物第二十頁，共32頁。（二）間接法洗滌洗滌洗滌待測抗體酶標(biāo)抗抗體第二十一頁，共32頁。（三）競爭法洗滌洗滌待測抗原酶標(biāo)抗原第二十二頁，共32頁。酶聯(lián)免疫競爭法工作原理第二十三頁，共32頁。（1）酶聯(lián)免疫吸附法-競爭抑制法測AFB1試劑：TMB，30%H2O2，牛血清白蛋白，吐溫-20抗體：抗AFB1的特異性單克隆抗體包被抗原：AFB1與載體蛋白的結(jié)合物酶標(biāo)二抗：緩沖液：磷酸鹽緩沖液、終止液1mol/L的硫酸AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液：第二十四頁，共32頁。步驟：1.提取：10g樣品+50ml乙腈-水濾紙過濾BSA洗液稀釋2.測定：包被抗原包被酶標(biāo)微孔板洗液洗去多余抗原加AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液加稀釋抗體（37度1.5h)洗液洗3次后，加酶標(biāo)二抗（37度培養(yǎng)2h）反復(fù)洗后加底物溶液加終止液（包被—加樣---加酶標(biāo)抗原和待測抗原---加底物顯色—終止反應(yīng)（顯色原理對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。第二十五頁，共32頁。固定OD值第二十六頁，共32頁。微孔板第二十七頁，共32頁。微孔表面情況AFB1包被抗體第二十八頁，共32頁。.（2）赭曲霉毒素毒性：主要對腎產(chǎn)生危害，造成腎腫大，當(dāng)濃度超過5mg/kg時，對肝臟組織和腸道產(chǎn)生破壞，引起腸炎等。特性：無色結(jié)晶化合物，易溶于極性溶劑和稀的碳酸氫鈉水溶液腫，微溶于水，在紫外光照射下，呈綠色熒光，該化合物穩(wěn)定，在乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不破壞，但在谷物中隨時間延長而降解。存在于：糧谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克力、中草藥、調(diào)味料、啤酒等。檢測方法：液相色譜法、薄層層析法第二十九