《生物實驗技術(shù)》第三章 染色、染料與染色劑

第三章染色、染料與染色劑染色染色（dying,staining)：將染料配成溶液，將組織浸入其中，使組織或細(xì)胞的某一部分染上與其它部分不同的顏色或不同深度的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，使組織或細(xì)胞內(nèi)各部分的構(gòu)造顯示得更清楚，便于光鏡觀察。

第三章染色、染料與染色劑第一節(jié)染料的一般性質(zhì)

一、染料的結(jié)構(gòu)和定義1.結(jié)構(gòu)有機(jī)化合物有色物質(zhì)染料有顏色

與被染組織間有親和力發(fā)色團(tuán)：助色團(tuán)：分子結(jié)構(gòu)顯色團(tuán)或色原，使化合物產(chǎn)生顏色的含有不飽和鍵的基團(tuán)。使染料變成電解質(zhì)，成為帶正負(fù)電荷的離子，從而與組織產(chǎn)生親和力。常見發(fā)色團(tuán)：常見助色團(tuán)：第一節(jié)染料的一般性質(zhì)

第三章Backto2常見的助色團(tuán)：羥基-

OH，羧基-COOH，氨基-NH2，磺酸基-SO3H，甲胺基-NH·CH3，二甲胺基-N（CH3）2

，鹵素Cl-、Br-、I-等常見的發(fā)色團(tuán)有：硝基－NO2，亞硝基－NO，偶氮基（－Ｎ＝Ｎ－），印胺基（－Ｎ＝），對醌基（==），乙烯基（C=C）等口第一節(jié)染料的一般性質(zhì)

第三章舉例:苯無色液體-3NO2NO2NO2NO2三硝基苯黃色固體-OHOHNO2NO2NO2三硝基苯酚有色物質(zhì)黃色固體染料第一節(jié)染料的一般性質(zhì)

第三章2.染料的定義染料是一種有機(jī)化合物，在它的結(jié)構(gòu)式苯環(huán)上有兩種基團(tuán)，一種為發(fā)色團(tuán)，顏色由它產(chǎn)生；另一種為助色團(tuán)，可促使化合物電離，使染料成為鹽類，從而產(chǎn)生染色性。

第一節(jié)染料的一般性質(zhì)

第三章二、染料的分類（1）據(jù)來源分類（2）按染料的性質(zhì)分類（3）據(jù)染色對象（應(yīng)用）分類天然染料合成染料(煤焦油染料，苯胺染料或亞尼林染料)P24酸性染料：主要有色部分為陰離子

堿性染料：主要有色部分為陽離子

中性染料：有色部分陽離子和陰離子都有組織染色染料：如結(jié)締組織等細(xì)胞染料：細(xì)胞核染料、細(xì)胞質(zhì)染料細(xì)胞化學(xué)成分染料：如脂肪染料等GotoNo9第一節(jié)染料的一般性質(zhì)

第三章嗜堿性：細(xì)胞和組織的酸性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)（嗜堿性物質(zhì)）與堿性染料(如蘇木精）親合力強(qiáng)，稱嗜堿性。嗜酸性：堿性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)（嗜酸性物質(zhì)）與酸性染料（如曙紅）親合力強(qiáng)，稱嗜酸性。中性：與兩種染料的親合力均不強(qiáng)的。酸性染料與堿性染料，不是指染料本身的酸堿性(pH)

如：曙紅為酸性染料，其溶液呈堿性反應(yīng)；結(jié)晶紫是堿性染料，其溶液呈酸性反應(yīng)

區(qū)分概念：組織第一節(jié)染料的一般性質(zhì)

第三章蘇木精堿性染料曙紅酸性染料嗜中性嗜酸性嗜堿性第二節(jié)染色理論

第三章染料被染組織溶劑媒染劑染色理論化學(xué)學(xué)說物理學(xué)說綜合作用染色染色機(jī)制不很清楚第二節(jié)染色理論

第三章一、物理學(xué)說（1）毛細(xì)現(xiàn)象（毛細(xì)管作用）

（2）吸收作用（absorption）（溶液學(xué)說）

（3）吸附作用（adsorption）

（4）沉淀作用

組織有許多微孔，可借助毛細(xì)管作用與染料接觸。組織吸收染料作牢固的結(jié)合，染料均勻地分布于組織中，叫吸收。組織的著色與溶液的顏色相同。如：品紅吸附作用是固體物質(zhì)的特性，它能從周圍溶液中吸住一些細(xì)小的物質(zhì)微粒，吸附作用只發(fā)生在兩相界面上?？山忉岃b別染色借擴(kuò)散與吸收作用進(jìn)入組織的染料，一部分被組織內(nèi)的酸堿所沉淀，不能用單純的溶劑將其分離。第二節(jié)染色理論

第三章二、化學(xué)學(xué)說染料細(xì)胞成分（陰）酸性染料（陽）堿性染料（陰、陽）中性染料酸性物質(zhì)（如核酸）堿性物質(zhì)（如細(xì)胞質(zhì)）兩性基團(tuán)（如蛋白質(zhì)）血紅細(xì)胞染上酸性染料還是堿性染料與染液酸堿性有關(guān)。細(xì)胞各組成部分染色的強(qiáng)弱，與細(xì)胞的組成（酸、堿性）及染料的性質(zhì)（酸性、堿性、中性）有更密切的關(guān)系。兩者親和力強(qiáng)，染色就深。第二節(jié)染色理論

第三章二、化學(xué)學(xué)說

蛋白質(zhì)（兩性基團(tuán)）在酸性溶液中：呈鹽基性，帶正電荷，與帶負(fù)電荷的離子化合在堿性溶液中：呈酸性，帶負(fù)電荷，與帶正電荷的離子化合等電點(diǎn)（PI）：當(dāng)在某一pH時，分子的正負(fù)離子等量，分子所帶電荷呈中性，此時的pH即是該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。RCCOO-NH3+第二節(jié)染色理論

第三章二、化學(xué)學(xué)說染液pH>組織PI染堿性染料PI時染液pH<組織PI-Pr+OH--Pr+-Pr+H+染酸性染料分子狀態(tài)呈中性染液pH>組織PI：組織較偏酸性，染堿性染料染液pH<組織PI：組織較偏堿性，染酸性染料第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

第三章一、細(xì)胞核染料與配方細(xì)胞核主要成分是核酸和蛋白質(zhì)，細(xì)胞核染料多屬堿性染料1.蘇木精（蘇木色素，Hematoxylin）C16H14O6

淡黃色或褐黃色。必須氧化成氧化蘇木精（深紅色）。氧化過程也叫成熟過程。COHHOOCH2CHOHCH2OHOH氧化對鯤基COHHOO

CH2COHCH2OOH性質(zhì)：第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

第三章一、細(xì)胞核染料與配方

蘇木精自然氧化需要時間長。急用時，可加入氧化汞、高錳酸鉀、過氧化氫、碘酸鈉等強(qiáng)氧化劑加速氧化，隨配隨用。

蘇木精易溶于酒精，微溶于水及甘油。

氧化蘇木精與組織的親和力較弱，常與媒染劑鐵明礬、鉀明礬、銨明礬等混合使用。機(jī)理：蘇木精的色素根+媒染劑沉淀色素（帶正電荷），其作用如同堿性染料，增強(qiáng)了親和力。第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

第三章一、細(xì)胞核染料與配方1.愛氏（Ehrlich）酸性蘇木精蘇木精2g95%Alc100ml

蒸餾水100ml

甘油100ml

鉀明礬3g

冰醋酸10ml2.海登漢氏（Heidenhain）蘇木精甲液：鐵明礬2.5g

蒸餾水100mL

乙液：蘇木精0.5g95%Alc10ml

蒸餾水100ml配方：冰醋酸：使染色穩(wěn)定，不易褪色，同時防止蘇木精因存放過久而沉淀甘油：避免染液蒸發(fā)、過染，使染色均勻（用前配制）（氧化成熟）甲、乙液用前混合，有效期為24h第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

第三章一、細(xì)胞核染料與配方愛氏酸性蘇木精可配成儲備液，而海登漢氏蘇木精則需要在使用前混合？？

鉀明礬的鋁離子+蘇木精色素根藍(lán)色沉淀

(溶于水)，但與組織結(jié)合后則難以用水或酒精溶去。鐵明礬+蘇木精色素根黑色或深蘭色沉淀（不溶于水）第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

第三章一、細(xì)胞核染料與配方2.胭脂紅（洋紅、卡紅）Carmine

優(yōu)良的細(xì)胞核染料，對粘液和肝糖的染色也有良好效果。用于切片或組織塊染色，特別適宜于小型材料的整體染色。性質(zhì)：

單純的洋紅不能染色，它與組織無直接的親和力。

等電點(diǎn)pH4.07~4.5。需要用低于或高于它的等電點(diǎn)的溶液溶解。酸性溶液常用冰醋酸或苦味酸，堿性溶液用氨、鎂、鋰、硼砂等。第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

第三章一、細(xì)胞核染料與配方1.硼砂洋紅（Grenacher's）（葛萊那息爾氏）洋紅2g4%硼砂水溶液100ml70%酒精100ml2.醋酸洋紅液（Schneider's）（施尼得氏）洋紅4~5g

冰醋酸

45ml

蒸餾水55ml例：

切片（染5－10min）一般動植物（如原生動物，腔腸動物，扁型動物等）的整體染色昆蟲、寄生蟲染色

適合于新鮮細(xì)胞學(xué)材料快速觀察，速染新鮮細(xì)胞的染色體。如：無脊椎動物的精巢、卵細(xì)胞、上皮組織等的中心體和染色體；植物的根尖細(xì)胞及花藥等圖示洋紅染色日本小簾蛤腸道內(nèi)渦蟲醋酸洋紅染闊葉蔥花粉囊分裂細(xì)胞洋紅染輪蟲第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

第三章一、細(xì)胞核染料與配方3.番紅Ｏ或沙黃Ｏ（SafraninＯ）

細(xì)胞學(xué)及動植物組織學(xué)常用染料所染組織：細(xì)胞核及染色體，維管束植物的木質(zhì)化、木栓化及角質(zhì)化的組織，植物蛋白質(zhì)，孢子囊等。番紅Ｏ的染色以Flemming氏液固定的為佳。常與快綠、亮綠作對比染色。番紅O-快綠染骨切片第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

一、細(xì)胞核染料與配方第三章4.地衣紅（補(bǔ)充）從茶漬地衣中提取的一種弱酸，堿性溶液中呈紫色，酸性溶液中呈橙紅色。染植物細(xì)胞的染色體效果比醋酸洋紅好，常用2.2%醋酸地衣紅液地衣紅酒精溶液可用于動物彈性纖維染色。5.堿性復(fù)紅（堿性品紅）Basicfuchsin第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

一、細(xì)胞核染料與配方第三章

暗綠色粉末或結(jié)晶，水溶液呈紅色。較強(qiáng)的核染色劑，在生物學(xué)染色中用途很廣?？扇荆赫畴?、彈性組織、嗜復(fù)紅性顆粒；維管束植物的木質(zhì)化壁；原球藻、輪藻的優(yōu)良染色劑；細(xì)菌學(xué)中結(jié)核桿菌的鑒別染色；中樞神經(jīng)組織的核染色劑；組織化學(xué)試劑Schiff試劑的主要成分，顯示DNA（Feulgen反應(yīng)）和多糖類（PAS反應(yīng)）。缺點(diǎn)是容易褪色。第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

一、細(xì)胞核染料與配方第三章6.甲基綠（甲烷綠、甲綠）Methylgreen7.美蘭（亞甲蘭、次甲基蘭、甲烯蘭）常用以染染色體。與吡羅紅Pyronin（又叫派若寧、焦寧）合用顯示DNA、RNA。

染神經(jīng)組織、肥大細(xì)胞、嗜堿性顆粒、漿細(xì)胞、尼氏體、粘液、血液等無鋅美蘭對活體無毒，可做神經(jīng)組織活體染色。生物學(xué)、病理學(xué)、細(xì)菌學(xué)常用的胞核染料優(yōu)點(diǎn)：不易過染8.中性紅Neutralred（補(bǔ)充）9.結(jié)晶紫（Crystalviolet)，又叫龍膽紫第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

一、細(xì)胞核染料與配方第三章

紅色粉末，弱的核染色劑，呈弱堿性。無毒，活體染色劑，常用1%水溶液?；铙w染色時可用相應(yīng)的等滲液配制。如：染原生動物或動植物組織中活細(xì)胞內(nèi)含物

核的重要染料，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)及細(xì)菌學(xué)細(xì)胞分裂的優(yōu)良染色劑，能顯示染色體、中心體、類淀粉、纖維蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)等，與番紅用作染色體的雙重染色，可將染色體染成紅色，紡錘絲染成紫色。中性紅染肺癌細(xì)胞第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

二、細(xì)胞質(zhì)染料第三章1.曙紅（伊紅）

Eosin

常用曙紅Y，四溴熒光素，帶黃綠色熒光蘇木精的最好對比染色劑，優(yōu)良的細(xì)胞質(zhì)染料染細(xì)胞質(zhì)、膠原纖維、肌肉纖維、神經(jīng)纖維、嗜酸性顆粒及酶原顆粒等，也是血液染色劑中的重要成分

酸性染料第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

二、細(xì)胞質(zhì)染料第三章2.桔黃G（金橙G、橙黃G）OrangeG

強(qiáng)酸性染料蘇木精的對比染色，特別是鐵蘇木精的對比染色

Mallory三色染色劑中的重要成分3.苦味酸

與酸性復(fù)紅作對比染色染結(jié)締組織。4.水溶性苯胺蘭（棉蘭）AnilinblueW.S.Mallory氏三色染色劑的重要成分鐵蘇木精的對比染色組織學(xué)和病理學(xué)中經(jīng)常使用，染細(xì)胞質(zhì)、神經(jīng)鞘。第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

二、細(xì)胞質(zhì)染料第三章5.耐綠—FCF（快綠、固綠）FastgreenFCF

性質(zhì)與亮綠相似，但染色力較亮綠強(qiáng)，不易褪色。常用于植物染色，作番紅O、蘇木精及Feulgen反應(yīng)的對比染色。6.亮綠（光綠、淺綠）LightgreenSF

性質(zhì)同耐綠，易褪色。7.藻紅Erythrosin

與曙紅相似，主要用作蘇木精的對比染色，細(xì)胞質(zhì)較好的染色劑，也是真菌的染色劑。

第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

二、細(xì)胞質(zhì)染料第三章8.酸性復(fù)紅（酸性品紅）Acidfuchsin

堿性復(fù)紅的一個磺化衍生物細(xì)胞質(zhì)染色劑，但也可染細(xì)胞核及線粒體

VanGiesen氏及Mallory氏結(jié)締組織染色劑與苦味酸染色鑒別平滑肌和結(jié)締組織。在植物制片中染皮層、髓部及纖維質(zhì)壁。第三章第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

三、脂肪染料特點(diǎn)：油溶性，不溶于水，使用時用醇配制。染色時間不能過久，否則酒精會把組織內(nèi)脂肪溶解。第三章第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

三、脂肪染料1.蘇丹Ⅲ（SudanⅢ）用95％或70％酒精配成飽和液使用。將動、植物脂肪組織染成紅色。植物方面可作角質(zhì)化、栓質(zhì)化的鑒別染色。

2.蘇丹Ⅳ較強(qiáng)的脂肪染色劑，目前代替蘇丹Ⅲ染脂肪。用丙酮與70％酒精的等混液溶解。脂肪染成紅色第三章第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

三、脂肪染料3.油溶紅—O較強(qiáng)的脂肪染料，用法與蘇丹Ⅳ相同

4.蘇丹黑Ｂ

主要染細(xì)菌的脂肪，染成黑色。

標(biāo)準(zhǔn)蘇丹黑B法和溴蘇丹黑B法可作為有無脂類的掃描實驗。Baker’s甲醛鈣固定液固定。四、活體染料第三章第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

用來作活體染色的染料，無毒或毒性很小。如：中性紅、詹納氏綠、臺盼蘭（曲利本藍(lán)、錐蘭）、硫酸尼羅蘭、無鋅美蘭、結(jié)晶紫、俾氏麥棕等，甲基紫、茜素紅可用于原生動物活體染色。五、熒光染料第三章第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

熒光：有些物質(zhì)當(dāng)用紫外光照射時，吸收了某種波長的紫外光后發(fā)射出各種顏色和不同強(qiáng)度的可見光，當(dāng)紫外光停止照射后，這種光線也隨之消失，將這種光線稱為熒光（一般持續(xù)10-7~10-8S）。熒光色素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染料物質(zhì)。如：異硫氰酸熒光素（FITC）、四乙基羅達(dá)明（RB200)、溴化乙啶（EB)等六、特殊試劑第三章第三節(jié)染色劑的配方與應(yīng)用

本身無色，但與切片作用后可顯色。金屬浸鍍劑：硝酸銀、氯化金、四氧化鋨等。組織化學(xué)試劑：氧化劑有過碘酸、過氯酸、過氧化氫等。還原劑有偏重亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鉀等。另外還有β－甘油磷酸鈉、巴比妥鈉、聯(lián)苯胺等。氯化金染色，顯示運(yùn)動終板第三章第四節(jié)染色方法

整體染色法如：原生動物、單胞藻、生物小型器官等。2.組織塊染色法將組織塊固定、水洗后，用稀染液染色，再包埋切片。3.蠟帶染色法用于如水解酶等易被破壞物質(zhì)的染色。4.切片染色法：制片時常用染色方法。5.特殊染色法4.切片染色法：（1）因染色步驟，即染色劑對材料的反應(yīng)不同分為：①單一染色法：如鐵蘇木精染細(xì)胞有絲分裂制片②復(fù)染色法（對比染色法）：如H-E染色③多重染色法：如Mallory三色染色法染結(jié)締組織。

微生物的染色：單染色法：形態(tài)觀察復(fù)染色法：革蘭氏染色法（可鑒別染色）第三章第四節(jié)染色方法

鐵蘇木精染色馬蛔蟲卵Mallory三色染色法H-E染色革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌（2）據(jù)染色時所用染料濃稀程度不同分為：漸進(jìn)法：稀染色液中，由淺而深漸漸著色。如：整體染色法后退法：較濃的染液中，先行濃染色后再褪色。如：切片的染色（3）據(jù)染色時是否使用媒染劑分為：直接法：不需經(jīng)過媒染劑的作用。如：一般的合成染料

間接法：必須經(jīng)過媒染劑的作用。如：蘇木精第三章第四節(jié)染色方法

5.特殊染色法：（1）活體染色法：活體內(nèi)染色活組織的染色（2）金屬沉淀法：也稱金屬浸潤法或金屬浸鍍法

常用于組織塊；纖毛蟲等（3）熒光染色法：靈敏度高，特異性強(qiáng)。

熒光染液濃度一般10-4-10-5，普通染色劑的濃度一般為10-2

。第三章第四節(jié)染色方法

將無毒或毒性很小的活體染料的稀染液注入動植物體內(nèi)或加入培養(yǎng)基（液)中，使其被細(xì)胞吸收而染色。用可溶性重金屬鹽的稀溶液處理細(xì)胞組織，再用有機(jī)酸類如甲酸、醋酸、草酸等進(jìn)行還原，使金屬鹽形成不溶性的黑褐色金屬或金屬氯化物，沉積于結(jié)構(gòu)的表面，形成黑褐色的影像，顯示其結(jié)構(gòu)。親銀性：銀染法中有些組織結(jié)構(gòu)可直接使硝酸銀還原而顯示，稱為~。嗜銀性：有些結(jié)構(gòu)無直接還原作用，需加入還原劑方能顯色，稱為~。銀染色方法：硝酸銀溶液直接染色(或+還原劑)

第三章鍍銀染色，顯示大腦皮質(zhì)神經(jīng)元第四節(jié)染色方法

網(wǎng)狀纖維具有嗜銀性，可以用銀鹽染色來顯示。第三章第四節(jié)染色方法

圖示：不同的染色方法的不同效果第三章第四節(jié)染色方法

H&E染色的中等動靜脈醛復(fù)