RNA的生物合成轉錄

概述轉錄（transcription）：以DNA為模板合成RNA的過程。轉錄的意義：基因表達的第一步，也是關鍵的一步。目前一頁\總數五十四頁\編于十六點基因(gene)：基因是負責編碼一個RNA的一段DNA序列。對于編碼蛋白質的基因，該RNA進而編碼產生一種蛋白質。啟動子（Promoter）：一段能夠被RNA聚合酶識別并結合的DNA序列，它決定著基因是否轉錄及轉錄的強度。轉錄起始位點（Startpoint）：RNA轉錄合成起始處所對應的DNA分子上的堿基對。用+1表示。上游（Upstream）和下游：轉錄起始位點的5’-端，稱為上游，上游單核苷酸的位置用-10、-35等表示。而在其3’-端稱為下游，下游單核苷酸的位置用+10、+100等表示。終止子（Terminator）：一段能夠引起RNA聚合酶終止合成RNA的DNA序列。1.一些重要的概念目前二頁\總數五十四頁\編于十六點AtranscriptionunitisasequenceofDNAtranscribedintoasingleRNA,startingatthepromoterandendingattheterminator.目前三頁\總數五十四頁\編于十六點轉錄單位（transcriptionunit）：從轉錄起始位點到終止位點的一段DNA，或能夠被轉錄成一個RNA分子的一段DNA，稱為一個轉錄單位。一個轉錄單位可以包含1個或幾個基因。單順反子（monocistron）：一條mRNA只代表一個基因，稱為單順反子。多順反子（polycistron）：很多情況下，一個mRNA分子中含有多個基因，稱為多順反子。初始轉錄物（Primarytranscript—precursor)：剛剛轉錄產生、未經任何形式加工的RNA，稱為初始轉錄物。目前四頁\總數五十四頁\編于十六點模板鏈（templatestrand）：DNA雙鏈中，按照堿基互補配對原則指導合成RNA的一條鏈。又稱反義鏈。編碼鏈（Codingstrand）：

DNA雙鏈中，與模板鏈互補的另一條鏈，稱為編碼鏈。又稱有意義鏈。目前五頁\總數五十四頁\編于十六點2.轉錄的一般特點

（1）以DNA為模板酶促合成RNA

細胞內RNA的生物合成過程是一個酶促反應過程，參與該過程的酶是RNA聚合酶（RNApolymerase）。此酶必須以雙鏈DNA中的一條鏈（或單鏈DNA）為模板，按照堿基配對原則，將NTP以3′,5′-磷酸二酯鍵的方式聚合起來，催化合成與模板互補的RNA。

（2）DNA雙鏈中只有一條鏈被轉錄成RNA—轉錄的不對稱性。

（3）RNA的合成方向：5′→3′。

（4）轉錄的起始不需要引物，RNA聚合酶無校正功能。目前六頁\總數五十四頁\編于十六點3.轉錄過程

共包括4步：

1）Templaterecognition模板識別

2）Initiation起始

3）elongation延伸

4）Termination終止目前七頁\總數五十四頁\編于十六點Transcriptionhasfourstages,whichinvolvedifferenttypesofinteractionbetweenRNApolymeraseandDNA.TheenzymebindstothepromoterandmeltsDNA,remainsstationaryduringinitiation,movesalongthetemplateduringelongation,anddissociatesattermination.MCB1.識別2.起始3.延伸4.終止目前八頁\總數五十四頁\編于十六點4.轉錄的主要產物

messengerRNA(mRNA)transferRNA(tRNA)ribosomalRNA(rRNA)

AnmRNAistranslatedintoaproteinsequence;tRNAandrRNAprovideothercomponentsoftheapparatusforproteinsynthesis.目前九頁\總數五十四頁\編于十六點§5-2原核生物基因的轉錄1.RNA聚合酶（RNApolymerase）

以DNA為模板合成RNA的聚合酶。又稱為DNA依賴的RNA聚合酶。大腸桿菌RNA聚合酶：

全酶（holoenzyme）:α2ββ′σ

核心酶（coreenzyme）:

α2ββ′sigmafactor:theσpolypeptide.

σ因子能夠使細菌RNA聚合酶穩(wěn)定地結合在啟動子上。只有全酶能夠起始轉錄。目前十頁\總數五十四頁\編于十六點Theαsubunitplaysaroleinpromoterrecognition.TheαsubunitalsoplaysaroleintheinteractionofRNApolymerasewithsomeregulatoryfactors.Theβandβ′subunitstogethermakeupthecatalyticcenter;TheβsubunitcanbecrosslinkedtothetemplateDNA,theproductRNA,andthesubstrateribonucleotides;SigmafactoristhesubunitofbacterialRNApolymeraseneededforinitiation;Itisthemajorinfluenceonselectionofbindingsites(promoters).目前十一頁\總數五十四頁\編于十六點起始時RNA聚合酶結合在-55to+20區(qū).當σ亞基脫離后核心酶向下游收縮至-30.當核心酶向下游移動一些堿基對后，形成延伸復合物，開始了RNA的合成。目前十二頁\總數五十四頁\編于十六點AsingletypeofRNApolymeraseappearstoberesponsibleforalmostallsynthesisofmRNA,andallrRNAandtRNA,inaeubacterium.由同一種RNA聚合酶合成所以的細菌RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。About7000RNApolymerasemoleculesarepresentinanE.colicell.Probably2000~5000enzymesaresynthesizingRNAatanyonetime,thenumberdependingonthegrowthconditions.每個細菌細胞內含有打印7000個RNA聚合酶分子。其中2000~5000個在工作，具體數量由生長條件決定。a,b,andb’亞基的大小恒定，而δ亞基大小有較大的變化。目前十三頁\總數五十四頁\編于十六點目前十四頁\總數五十四頁\編于十六點ControlsitesinDNAprovidebindingsitesforproteins;codingregionsareexpressedviathesynthesisofRNA.

2.PromoterandInitiation啟動子與轉錄起始

目前十五頁\總數五十四頁\編于十六點1）原核生物基因的啟動子有4個結構特征Fourconservedfeaturesinabacterialpromoter:Startpoint轉錄起始位點;-10sequence-10序列;-35sequence-35序列;-10and-35序列之間的間隔序列。

目前十六頁\總數五十四頁\編于十六點startpoint轉錄起始位點它通常是嘌呤單脫氧核苷酸(>90%)，其通用的核心序列是CAT,但該三聯(lián)體的保守性還不足以完全能夠進行轉錄起始。-10sequence

(Pribnowbox）其保守序列是

TATAAT（6bp），位于轉錄起始位點的上游-18to-9.目前十七頁\總數五十四頁\編于十六點-35sequence（Sextamabox):核心序列是TTGACA.其中心位于轉錄起始位點上游約~35bp處。-10and-35序列之間的間隔序列：在90%的原核基因啟動子中，長為16-18bp，很少有小于15bp或大于20bp的.Althoughtheactualsequenceintheinterveningregionisunimportant,thedistanceiscriticalinholdingthetwositesattheappropriateseparationforthegeometryofRNApolymerase.盡管此間隔的序列不重要，但其長短對于RNA聚合酶在空間上的準確識別是重要的。目前十八頁\總數五十四頁\編于十六點在生物進化過程中，形成了不同的σ因子。不同的σ因子可以幫助RNA聚合酶識別不同的啟動子序列。

E.colisigmafactorsrecognizepromoterswithdifferentconsensussequences.(Numbersinthenameofafactorindicateitsmass.)目前十九頁\總數五十四頁\編于十六點3.Elongation延伸RNA的合成—轉錄是在轉錄泡中進行的。轉錄泡即暫時打開的DNA雙鏈（17bp），RNA聚合酶以其中的一條鏈—模板鏈為模板，按照堿基配對原則合成RNA。Transcriptiontakesplaceinabubble,inwhichRNAissynthesizedbybasepairingwithonestrandofDNAinthetransientlyunwoundregion.隨著轉錄泡的前移，后方的DNA重新形成雙鏈，將單鏈RNA釋放出去。Asthebubbleprogresses,theDNAduplexreformsbehindit,displacingtheRNAintheformofasinglepolynucleotidechain.

目前二十頁\總數五十四頁\編于十六點Duringtranscription,thebubbleismaintainedwithinbacterialRNApolymerase,whichunwindsandrewindsDNA,maintainstheconditionsofthepartnerandtemplateDNAstrands,andsynthesizesRNA.目前二十一頁\總數五十四頁\編于十六點4.Termination終止Terminator

isasequenceofDNA,representedattheendofthetranscript,thatcausesRNApolymerasetoterminatetranscription.BacterialRNApolymerasehastwomodesoftermination.細菌RNA聚合酶的終止有兩種方式。目前二十二頁\總數五十四頁\編于十六點根據RNA聚合酶的終止是否需要其他因子的參與，將終止子分為2種。

1）內部終止子。不需要其他因子的幫助。Coreenzymecanterminateinvitroatcertainsitesintheabsenceofanyotherfactor.Thesesitesarecalledintrinsic（固有的，內在的）terminators.

2）依賴于Rho(ρ)因子的終止子。ρ-dependentterminatorsaredefinedbytheneedforadditionofρfactorinvitro.

factorisanessentialproteininE.coli.Itfunctionssolelyatthestageoftermination.Itisa~275kDahexamerofidenticalsubunits.Itfunctionsasanancillary(輔助的)factorforRNApolymeraseIthasNTPaseactivity.目前二十三頁\總數五十四頁\編于十六點Intrinsicterminatorsincludepalindromicregionsthatformhairpinsvaryinginlengthfrom7-20bp.Thestem-loopstructureincludesaG-C-richregionandisfollowedbyarunofUresidues.Intrinsicterminators:目前二十四頁\總數五十四頁\編于十六點A-dependentterminatorhasasequencerichinCandpoorinGprecedingtheactualsite(s)oftermination.Rho-dependentterminators:目前二十五頁\總數五十四頁\編于十六點factorpursuesRNApolymerasealongtheRNAandcancauseterminationwhenitcatchestheenzymepausingata-dependentterminator.目前二十六頁\總數五十四頁\編于十六點§5-3

Transcriptionofeukaryoticorganism真核生物基因的轉錄

共有3類，分別由不同的RNA聚合酶復制。

1.RNApolymerase

RNApolymeraseI:rRNA(28S,18S,5.8S)

RNApolymeraseII:mRNA

RNApolymeraseIII:tRNAand5SrRNAandothersmallRNAs(snRNA).目前二十七頁\總數五十四頁\編于十六點Amajordistinctionbetweentheeukaryoticenzymesisdrawnfromtheirresponsetoα-amanitin

（α-鵝膏蕈堿）.

AmanitinisabicyclicoctapeptidederivedfromthepoisonousmushroomAmanitaphalloides;itinhibitstranscriptionbycertaineukaryoticRNApolymerases.鵝膏蕈堿是一種來自毒蘑菇的雙環(huán)八聚體蛋白，它能抑制RNA聚合酶的活性。目前二十八頁\總數五十四頁\編于十六點2.PromotersandTranscriptionalfactorsPromoter:

真核啟動子可定義為位于轉錄起始位點附近啟動轉錄所必需的序列。Transcriptionalfactors轉錄因子：識別并結合在啟動子序列上的蛋白因子。PromoterelementsaredefinedbymutationsandfootprintingMutationsinthesitepreventfunctioninvitroorinvivo.

Proteinsthatactbybindingtoasitemaybefootprintedonit.目前二十九頁\總數五十四頁\編于十六點第二類RNA聚合酶的啟動子：PromoterofRNApolymeraseII

:由兩部分組成：startpointandupstreamelements上游元件.

startpoint:傾向起始于A，其側翼序列為嘧啶堿基。一般形式為Py2CAPy5.

Atthestartpoint,thereisnoextensivehomologyofsequence,butthereisatendencyforthefirstbaseofmRNAtobeA,flankedoneithersidebypyrimidines.Theinitiator(Inr)thegeneralformPy2CAPy5.TheInriscontainedbetweenpositions-3and+5.目前三十頁\總數五十四頁\編于十六點Upstreamelements:TATAbox:asacrucialpositioningcomponentofthecorepromotercontainsthesequenceTATAA/TAA/T.CAATbox:containsthesequenceGGC/TCAATCTplaysastrongroleindeterminingtheefficiencyofthepromoter.Itfunctionsineitherorientation.GCbox:containsthesequenceGGGCGG.Oftenmultiplecopiesarepresentinthepromoter,andtheyoccurineitherorientation.目前三十一頁\總數五十四頁\編于十六點Saturationmutagenesisoftheupstreamregionoftheb-globinpromoteridentifiesthreeshortregions(centeredat-30,-75,and-90)thatareneededtoinitiatetranscription.ThesecorrespondtotheTATA,CAAT,GCbox.目前三十二頁\總數五十四頁\編于十六點PromoterscontaindifferentcombinationsofTATAboxes,CAATboxes,GCboxes,andotherelements.目前三十三頁\總數五十四頁\編于十六點目前三十四頁\總數五十四頁\編于十六點轉錄因子（Transcriptionalfactors）:真核細胞基因的轉錄需要大量的轉錄因子的參與。共有三類轉錄因子。ThenumberoffactorsthatcanactinconjunctionwithRNApolymeraseIIislarge.Wemaydividethemintothreegeneralgroups.

通用轉錄因子generalfactors上游轉錄因子upstreamfactors可誘導的轉錄因子induciblefactors目前三十五頁\總數五十四頁\編于十六點

除了啟動子序列外，DNA分子中還有一種序列也與轉錄起始有關。這種序列能夠提高轉錄頻率，但它可能遠離轉錄起始位點，在轉錄位點的上游或下游，這種序列叫增強子（enhancer）。增強子與啟動子一樣，也是由不同的組件構成的。增強子可以在RNA聚合酶Ⅱ轉錄的基因中出現，也可以在RNA聚合酶Ⅰ轉錄的基因中出現。Enhancerelementisacis-actingsequencethatincreasestheutilizationof(some)eukaryoticpromoters,andcanfunctionineitherorientationandinanylocation(upstreamordownstream)relativetothepromoter.

增強子Enhancer:目前三十六頁\總數五十四頁\編于十六點

AtypicalgenetranscribedbyRNApolymeraseIIhasapromoterthatextendsupstreamfromthesitewheretranscriptionisinitiated.Thepromotercontainsseveralshort(<10bp)sequenceelementsthatbindtranscriptionfactors,dispersedover>200bp.Anenhancercontainingamorecloselypackedarrayofelementsthatalsobindtranscriptionfactorsmaybelocatedseveralkbdistant.目前三十七頁\總數五十四頁\編于十六點§14-4轉錄后加工—加帽、加polyA尾和剪接Post-transcriptionalevents—Capping,PolyadenylationandSplicing1.Capping：Cap0:m7GpppX:單細胞真核生物，如酵母。Cap1:m7GpppXm：除單細胞真核生物外的其他真核生物。Cap2:m7GpppXmpYm：某些真核生物。目前三十八頁\總數五十四頁\編于十六點Capstructure：Thecapblocksthe5’endofmRNAandmaybemethylatedatseveralpositions.目前三十九頁\總數五十四頁\編于十六點加帽的功能FunctionofCap:ProtectionofthemRNAfromdegradation.防止mRNA被降解。EnhancementofthemRNA’stranslatability.增強mRNA的翻譯能力。TransportofthemRNAoutofthenucleus.有利于mRNA從核內向細胞質轉運。Propersplicingofthepre-mRNA.有利于mRNA前體的正確剪接。目前四十頁\總數五十四頁\編于十六點2.Polyadenylation聚腺苷酸化MosteukaryoticmRNAsandtheirprecursorshaveachainofAMPresiduesabout250nucleotideslongattheir3’-ends.Thispoly(A)isaddedpost-transcriptionallybypoly(A)polymerase聚腺苷酸化酶.Polyadenylationsignals加尾信號:AAUAAA.Functions:Poly(A)enhancesboththelifetimeandtranslatabilityofmRNA.提高了mRNA的壽命和翻譯能力。目前四十一頁\總數五十四頁\編于十六點目前四十二頁\總數五十四頁\編于十六點Poly(A)+RNAcanbeseparatedfromotherRNAsbyfractionationonSepharose-oligo(dT).目前四十三頁\總數五十四頁\編于十六點3.Splicing剪接Productsoftranscription:1)rRNAsplicing2)tRNAsplicing3)Nuclearpre-mRNA目前四十四頁\總數五十四頁\編于十六點含有內含子的轉錄物中剪接區(qū)的堿基序列基因區(qū)域外顯子內含子外顯子卵清蛋白內含子2UAAGGUGAGC---------UUACAGGUUG卵清蛋白內含子3UCAGGUACAG---------AUUCAGUCUGβ‐珠蛋白內含子1GCAGGUUGGU---------CCUUAGGCUGβ‐珠蛋白內含子2CAGGGUGAGU―――CCACAGUCUC免疫蛋白λ內含子1UCAGGUCAGC―――UUGACGGGGCSV40病毒早期T-抗原UAAGGUAAAU―――UUUUAGAUUC1)真核生物基因內含子的結構特點目前四十五頁\總數五十四頁\編于十六點真核生物基因內含子的結構特點：1.內含子的大小:50～10000nt；2.5’-末端絕大多數為GU開始；3’-末端絕大多數為AG結束；3.在3’-末端的上游20～50nt處，有一段稱為分支點（branchsite）的序列，在酵母中，此序列幾乎都是UACUAAC，哺乳動物中有多種不同的序列；4.在5’-末端、3’-末端及分支點保持不變的情況下，可在內含子中插入不同大小的外源基因片段，而且不影響基因的加工。目前四十六頁\總數五十四頁\編于十六點Theonlythreesequencesneededforsplicingare:shortconsensussequencesatthe5’and3’splicingsitesandatthebranchsite分支位點.TheendsofnuclearintronsaredefinedbytheGT-AGrule.Splicingsignals剪接信號：目前四十七頁\總數五十四頁\編于十六點Thesplicingeventrequiresbreakageoftheexon-intronjunctionsandjoiningoftheendsoftheexons;MaturemRNAistransportedthroughnuclearporestothecytoplasm,whereitistranslated.

2)Nuclearpre-mRNA目前四十八頁\總數五十四頁\編于十六點3)剪接體催化的剪接機制（1）剪接體的定義在細胞核和胞質溶膠中都含有多種不到300個核苷酸的小RNA分子，它們被稱為核內小RNA（smallnuclearRNA，snRNA）和胞質內小RNA（smallcytplasmicRNA，scRNA）。這些RNA分子和特異的蛋白質結合在一起形成復合體，這些復合體分別叫做核內小核糖核蛋白顆粒（smallnuclearribonucleoproteinparticles，snRNPs