時(shí)間分辨熒光免疫分析

時(shí)間分辨熒光免疫分析時(shí)間分辨熒光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初問世的一種超靈敏度的標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)。其主要特點(diǎn)是以銅系元素箱(Eu3+)等標(biāo)記抗體或抗原為示蹤劑，利用增強(qiáng)液的熒光放大作用和時(shí)間分辨熒光法排除樣品或試劑中非特異性熒光物質(zhì)的干擾，最大限度地提高了檢測(cè)方法的靈敏度和特異性，還具有量程寬，操作簡(jiǎn)便，標(biāo)記物容易制備，穩(wěn)定性好，保存期長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。一、基本原理與放免分析相似，總體上分為競(jìng)爭(zhēng)法和非競(jìng)爭(zhēng)法兩類，前者多用于小分子半抗原,后者用于大分子化合物。鐮1系元素錯(cuò)(Eu)、杉(Sm)、鉞(Tb)和鈦(Nd)通過雙功能螯合劑，在水溶液中很容易與抗原或抗體分子以共價(jià)雙鍵結(jié)合。經(jīng)抗原、抗體間特異性的免疫結(jié)合反應(yīng)，測(cè)定免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，就可推算待測(cè)物質(zhì)的濃度。錮系離子的熒光信號(hào)極弱，需要在酸性條件下，解離出輛系離子，然后與熒光增強(qiáng)液中的二酮體生成新的螯合物，經(jīng)紫外光激發(fā)可產(chǎn)生強(qiáng)而持久的熒光信號(hào),其增強(qiáng)效力可達(dá)100萬倍，故又稱解離增強(qiáng)鍋系熒光免疫分析(dissociation-enhanced-lanthanidefluoroimmunoassay,DELFIA)。輛系元素的發(fā)光時(shí)間延長(zhǎng)，如Eu"和Sn?+的熒光衰變時(shí)間分別達(dá)到4.3X105ns和4.IX10ns,而樣品和試劑中的自然本底熒光的衰變時(shí)間僅為4—10ns,通過延遲測(cè)量時(shí)間，使信號(hào)不受本底熒光影響。此外，錮系元素螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，stokes位移大，有利于排除非特異性散射光的干擾,進(jìn)一步提高熒光信號(hào)的特異性。二、試劑組成(-)E心標(biāo)記物：可分為標(biāo)記抗體、標(biāo)記抗原，要求有較高的純度、比活性和免疫活性。密封后42或-2(rc保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。若發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)聚合，非特異性結(jié)合升高，則應(yīng)停止使用。(二)固相抗體或抗原：固相載體多用聚苯乙烯微孔條，要求透明度高，吸附性能好，材質(zhì)均勻，孔間差異小，不同品牌甚至不同批號(hào)的微孔條間都會(huì)有明顯的性能差異，應(yīng)引起注意。包被抗原純度要求高；包被抗體要求效價(jià)高，親和力強(qiáng)。包被后經(jīng)牛血清白蛋白封閉，干燥后在4寸、密封、避光、干燥的環(huán)境中保存。（三）增強(qiáng)液：試劑純度不高、器皿清潔度不良或不明原因的污染均可導(dǎo)致增強(qiáng)液熒光本底升高。因此必須注意試劑的純度；批號(hào)的差異，器皿要用10g/L的EDTA-Na2溶液浸泡，再用三蒸水洗滌。新配制增強(qiáng)液應(yīng)用100ml塑料瓶在4C下保存。（四）校準(zhǔn)試劑或標(biāo)準(zhǔn)品：指用生物液或緩沖液配制的一組不同濃度的待測(cè)物質(zhì)溶液，用于制作計(jì)量一反應(yīng)曲線或用作陰、陽性對(duì)照和cutoff值校準(zhǔn)。其濃度已用法定標(biāo)準(zhǔn)物為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)示值與實(shí)測(cè)值的偏差不得超過±10虬蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)應(yīng)進(jìn)行免疫活性測(cè)定，證明其同質(zhì)性。42或-2CTC保存。（五）質(zhì)量控制樣品：參見放射免疫部分。三、檢測(cè)步驟以Wallac公司autoDELFIA全自動(dòng)時(shí)間分辯熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定hTSH為例，其免疫反應(yīng)原理為雙抗體夾心法，全部試驗(yàn)過程均在autoDELFIA全自動(dòng)時(shí)間分辯熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)上按預(yù)設(shè)程序自動(dòng)完成，整個(gè)檢測(cè)過程用時(shí)約2.5hr左右。步驟如下：.將100樣品或標(biāo)準(zhǔn)品按順序加入抗體包被的微孔條中。.每孔加入100U1稀釋過的E1+標(biāo)記抗體工作液。.孵育2hro.洗滌6次，除去游離Ei?一標(biāo)記抗體。.每孔加增強(qiáng)液200口1,反應(yīng)5min。.測(cè)定熒光強(qiáng)度并經(jīng)數(shù)據(jù)處理計(jì)算待測(cè)物質(zhì)濃度。四、資料保存及報(bào)告要求所有原始記錄應(yīng)妥善保存，以被查考。報(bào)告內(nèi)容包括病人姓名、編號(hào)、項(xiàng)目、送檢日期、測(cè)定日期、測(cè)定結(jié)果和正常參考值，推薦使用計(jì)算機(jī)管理系統(tǒng)對(duì)資料進(jìn)行儲(chǔ)存、分類、查詢、報(bào)告、收費(fèi)和制作統(tǒng)計(jì)報(bào)表。五、質(zhì)量控制見放射免疫部分。六、注意事項(xiàng)TRIFA法易受內(nèi)源性和外源性污染，因?yàn)樵谧匀画h(huán)境中錮系離子存在十分廣泛，如空氣中的塵埃、煙霧，北方地區(qū)尤甚。故需嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，防止污染。（一）器材的清潔度實(shí)驗(yàn)所用的一切器材，包括微孔條、加樣器、加樣頭、試劑瓶必須專用，并經(jīng)嚴(yán)格洗滌，方法是：2mol/L鹽酸浸泡24h,再經(jīng)0.1%環(huán)化二乙烯三胺五乙酸（DTPA）浸泡2?4h,蒸儲(chǔ)水沖洗3?5次，再用高純度蒸儲(chǔ)水沖洗2?3次，45?5CTC干燥后密封儲(chǔ)存。（二）蒸僧水的質(zhì)量蒸儲(chǔ)水的純度直接影響所制的緩沖液、增強(qiáng)液和洗滌液的本底熒光，通常要求采用三蒸水，最后一次蒸儲(chǔ)采用亞沸石英蒸偏器處理。（三）所有實(shí)驗(yàn)用試劑必須作本底熒光測(cè)定，首先測(cè)增強(qiáng)液本底熒光，應(yīng)<1500cps,其余試劑各取25R1,加增強(qiáng)液200R1,振蕩15min,放置20min后測(cè)熒光強(qiáng)度，以不高于增強(qiáng)液本底熒光30%為