任務(wù)十四測定食品中毒素天然毒素和激素

任務(wù)十四測定食品中毒素天然毒素和激素1第一頁，共三十九頁，2022年，8月28日項目一：測定貝類食品中麻痹性貝類毒素一、案例二、選用的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.213-2008貝類中麻痹性貝類毒素的測定。2第二頁，共三十九頁，2022年，8月28日三、測定方法1．試樣制備（1）牡蠣、蛤、貽貝、扇貝等：用清水洗凈貝類外殼，切斷閉殼肌，開殼，用清水淋洗內(nèi)部，除去泥沙及其它外來雜質(zhì)，仔細取出貝肉，勿割破肉體，開殼前不用麻醉劑或加熱。收集約200g肉瀝水5min，避免貝肉堆積，撿出碎殼等雜物，貝肉均質(zhì)。（2）冷凍貝類：室溫下將樣品自然融化，其余操作同上。（3）貝類罐頭：將罐內(nèi)所有內(nèi)容物（包括貝肉和汁液）倒入均質(zhì)器中均質(zhì)，大容量罐頭可以過濾貝肉，分別稱重，然后將固形物和汁液按比例混勻，充分均質(zhì)。（4）干貝類：等體積0.18mol/L鹽酸溶液浸泡24～48h（4℃冷藏），按照上法瀝干，分別存放貝肉和酸液備用。3第三頁，共三十九頁，2022年，8月28日2．保存樣品不能及時送檢，可以取200g樣品用200mL0.18mol/L鹽酸浸泡，4℃冷藏保存。3．麻痹性貝類毒素(PSP)標(biāo)準(zhǔn)品對照試驗4第四頁，共三十九頁，2022年，8月28日4．試樣提?。?）將100g處理后樣品于800mL燒杯中，加0.18mol/LHCl溶液100mL，充分攪拌，均質(zhì)，調(diào)pH于2.0～4.0，需要時可以用5mol/LHCl或0.1mol/LNaOH逐滴滴加，并不斷攪拌，防止毒素破壞。（2）混合物加熱，徐徐煮沸5min，室溫冷卻后倒入200mL量筒中，調(diào)pH于2.0～4.0，pH勿大于4.5稀釋至200mL。（3）混合物倒回?zé)校瑪嚢杈鶆?，自然沉降至上清液半透明，不阻塞針頭為止，必要時可以用3000r/min離心上清液或混合物5min。5第五頁，共三十九頁，2022年，8月28日5．小鼠試驗（1）取19.0～21.0g健康雄性小鼠6只，稱重并記錄重量，分空白組和實驗組，每組3只。（2）對每只實驗組小鼠腹腔注射1mL提取液，注射時若有一滴以上提取液逸出，須將該小鼠丟棄，并重新注射1只小鼠。（3）記錄注射完畢時間，仔細觀察并用秒表記錄小鼠停止呼吸時的死亡時間（到小鼠呼出最后一口氣時）。（4）若小鼠死亡時間小于5min則要稀釋樣品提取液后，注射另一組3只小鼠，得到5～7min的死亡時間，稀釋提取液時，要逐滴加入0.1mol/L或0.01mol/LHCl，調(diào)節(jié)pH至2.0～4.0。注射樣品后，有1只或2只小鼠的死亡時間大于7min，則需要注射至少3只小鼠以確定樣品的毒力。6第六頁，共三十九頁，2022年，8月28日6．結(jié)果計算與判斷（1）待測樣品校正鼠單位（CMU）確定：根據(jù)待測樣品的小鼠死亡時間，在表14-1PSP死亡時間-鼠單位的關(guān)系，查出相應(yīng)的鼠單位；再根據(jù)小鼠的質(zhì)量，在表14-2小鼠體重校正表中查出質(zhì)量校正系數(shù)，同一只小鼠的鼠單位（MU）與質(zhì)量校正系數(shù)之積，即該小鼠的CMU。受試組3只小鼠CMU的中位數(shù)受試組中位數(shù)。7第七頁，共三十九頁，2022年，8月28日（2）PSP的計算與結(jié)果陳述：①PSP結(jié)果計算：X=CMU1×CF×DF×200式中X——每100g樣品中PSP的含量，μg/100g；CMU1——檢測樣品受試組小鼠的中位數(shù)校正鼠單位CF——毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)；DF——稀釋倍數(shù)；200——樣品提取液體積，mL。②PSP毒力結(jié)果表述：若空白對照組小鼠正常，則報告待測樣品中PSP含量為：×××μg/100g。8第八頁，共三十九頁，2022年，8月28日（3）MU毒力的計算與結(jié)果陳述：①MU毒力計算：Y=CMU1×DF×200Y——每100g樣品的MU值，MU/100g；其余同上式②MU毒力與結(jié)果表述：空白組正常情況下表述如下：若小鼠死亡時間大于60min，則待測樣品的鼠單位即小于0.875MU/g。若小鼠死亡時間小于5min，則應(yīng)對樣品提取液稀釋后，注射另一組3只小鼠，得到中位數(shù)死亡時間在5～7min為止，根據(jù)最后的稀釋實驗結(jié)果計算樣品的鼠單位毒力，報告該樣品的鼠單位為×××MU/100g。若實驗組中位數(shù)死亡時間大于7min，則直接計算確定樣品鼠單位毒力，報告該樣品的鼠單位為×××MU/100g。若實驗組中所有小鼠在15min內(nèi)無死亡，則報告該樣品鼠單位小于400MU/100g。9第九頁，共三十九頁，2022年，8月28日7.試劑（1）0.18mol/L鹽酸：15mL濃鹽酸稀釋至1L。（2）5mol/L鹽酸：41.7mL濃鹽酸稀釋至100mL。（3）0.1mol/L氫氧化鈉溶液：4.0g氫氧化鈉溶于1L水。（4）PSP毒素（saxitoxin）標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/mL)：20%乙醇溶液，用5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0～4.0之間，用該液配制PSP標(biāo)準(zhǔn)溶液。（5）小鼠：體重在19～21g雄性小鼠。（6）蒸餾水（pH為3）：用鹽酸調(diào)。8．儀器（1）均質(zhì)器。（2）離心機。（3）天平。（4）注射器。（5）電爐。（6）秒表。（7）玻璃器皿。10第十頁，共三十九頁，2022年，8月28日四、相關(guān)知識（一）貝類中麻痹性貝類毒素的測定——生物法原理根據(jù)小鼠注射貝類提取液后死亡的時間，查出鼠單位，并按小鼠體重，查表校正鼠單位，計算確定每100g貝類肉內(nèi)的PSP含量，所測結(jié)果代表存在于該貝肉內(nèi)各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的PSP總量。本法摘自GB/T5009.213-2008，適用于貝類及其制品中PSP檢測。（二）注意事項1．鼠單位（MU）：對體重20g的雄性小鼠腹腔注射1mL麻痹性貝類毒素提取液，使其在15min內(nèi)死亡所需最小毒素量。2．毒素對人體有害，應(yīng)該在有保護情況下進行操作，所用玻璃實驗室儀器應(yīng)該用5%次氯酸鈉溶液浸泡1h，使毒素分解；廢棄提取液也需用5%次氯酸鈉處理。3．PSP死亡時間與MU的關(guān)系表11第十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日五、測定食品中麻痹性貝類毒素的方法（一）進出口貝類中麻痹性貝類毒素檢測方法本法摘SN/T1773-2006酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定貝類中麻痹性貝類毒素，適用于雙殼類貝肉、貝柱和其他可食用部分麻痹性貝類毒素的篩選檢測。（二）高效液相色譜法測定貝類產(chǎn)品中麻痹性貝類毒素本法摘自SN/T1735-2006進出口貝類產(chǎn)品中麻痹性貝類毒素檢驗方法，適用于貝類產(chǎn)品中麻痹性貝類毒素的檢驗。12第十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日

項目二測定食品中的黃曲霉毒素一、案例二、選用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.22-2003食品中黃曲霉毒素B1的測定——薄層色譜法。13第十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日三、測定方法1．取樣試樣中污染黃曲霉毒素B1高的霉粒一粒左右可以測定結(jié)果。由于有毒霉粒的比例小，且分布不均勻，為避免取樣帶來的誤差，應(yīng)大量取樣，并將該大量試樣粉碎，混合均勻，才有可能得到確能代表一批試樣的相對可靠的結(jié)果，因此采樣應(yīng)注意以下幾點：（1）根據(jù)規(guī)定采取有代表性試樣。（2）對局部發(fā)霉變質(zhì)的試樣檢驗時，應(yīng)單獨取樣。（3）每份分析測定用的試樣應(yīng)從大樣經(jīng)粗碎與連續(xù)多次用四分法縮減至0.5～1kg，然后全部粉碎。14第十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日2．提?。?）玉米、大米、麥類、面粉、薯干、豆類、花生、花生醬等。甲法：稱取20.00g粉碎過篩試樣（面粉、花生醬不需粉碎），置于250mL具塞錐形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴防漏。振蕩30min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，待下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶內(nèi)。取20.00mL甲醇水溶液（相當(dāng)于4g試樣）置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振搖2min，靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層。放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯甲烷潤濕的無水硫酸鈉的定量慢速濾紙過濾于50mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量洗過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放在通風(fēng)柜于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后放在冰盒上冷卻2～3min后，準(zhǔn)確加入1mL苯-乙腈混合液（或?qū)⑷燃淄橛脻饪s蒸餾器減壓吹氣蒸干后，準(zhǔn)確加入1mL苯-乙腈混合液）。用帶橡膠皮頭的滴定管的管尖將殘渣充分混合，若有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL具塞試管中。乙法（限于玉米、大米、小麥及其制品）：15第十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日（2）花生油、香油、菜油等：（3）醬油、醋。（4）干醬類（包括豆豉、腐乳制品。（5）發(fā)酵酒類：16第十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日3．測定（1）單向展開法①薄層板的制備：稱取約3g硅膠G，加相當(dāng)于硅膠量2～3倍左右的水，用力研磨1～2min至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi)，推成5cm×20cm，厚度約為0.25mm的薄層板三塊。在空氣中干燥約15min后，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2天～3天，若放置時間較長，可再活化后使用。17第十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日②點樣：將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血色素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個點，點距邊緣和點間距約為1cm，點直徑約為3mm。在同一塊板上滴加的大小應(yīng)一致，滴加時可用吹風(fēng)機用冷風(fēng)邊吹邊加。滴加樣式如下：第一點：10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）。第二點：20μL樣液。第三點：20μL樣液+10μL0.04μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。第四點：20μL樣液+10μL0.2μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。18第十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日③展開與觀察：在展開槽內(nèi)加10mL無水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展開10～12cm，取出。在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下。由于樣液點上加滴黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液，可使黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點與樣液中的黃曲霉毒素B1熒光點重疊。如樣液為陰性，薄層板上的第三點中黃曲霉毒素B1為0.0004μg，可用作檢查在樣液內(nèi)黃曲霉毒素B1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；如為陽性，則起定性作用。薄層板上的第四點中黃曲霉毒素B1為0.002μg，主要起定位作用。若第二點在與黃曲霉素標(biāo)準(zhǔn)點的相應(yīng)位置上無藍紫色熒光點，表示試樣中黃曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下；如在相應(yīng)位置上有藍紫色熒光點，則需進行確證試驗。19第十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日④確證試驗：為了證實薄層板上樣液熒光系由黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的，加滴三氟乙酸，產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的衍生物，展開后此衍生物的比移值約在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個點。第一點：0.04μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液10μL。第二點：20μL樣液。于以上兩點各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機吹熱風(fēng)2min后，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40℃，再于薄層板上滴加以下兩個點。第三點：0.04μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液10μL。第四點：20μL樣液。再展開，在紫外光燈下觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點相同的衍生物。未加三氟乙酸的三四兩點，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對照。20第二十頁，共三十九頁，2022年，8月28日⑤稀釋定量：樣液中的黃曲霉毒素B1熒光點的熒光強度如與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點的最低檢出量（0.0004μg）的熒光強度一致，則試樣中黃曲霉毒素B1含量即為5μg/kg。如樣液中熒光強度比最低檢出量強，則根據(jù)其強度估計減少滴加微升數(shù)或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液點的熒光強度與最低檢出量的熒光強度一致為止。滴加式樣如下：第一點：10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）。第二點：根據(jù)情況滴加10μL樣液。第三點：根據(jù)情況滴加15μL樣液。第四點：根據(jù)情況滴加20μL樣液。21第二十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日（2）雙向展開法滴加兩點法①點樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上滴加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板的距左邊緣0.8～1cm處各滴加10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL），在距左邊緣2.8～3cm處各滴加20μL樣液，然后在第二塊板的樣液點上加滴10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL），在第三塊板的樣液點上加滴10μL0.2μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。②展開：橫向展開：在展開槽內(nèi)的長邊置一玻璃支架，加10mL無水乙醇，將上述點好的薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點的長邊置于展開槽內(nèi)展開，展至板端后，取出揮干，或根據(jù)情況需要時可再重復(fù)展開1～2次?？v向展開：揮干的薄層板以丙酮-三氯甲烷（8+92）展開至10～12cm為止。丙酮與三氯甲烷的比例根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。22第二十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日③觀察及評定結(jié)果在紫外燈光下觀察第一、第二板，若第二板的第二點在黃曲霉毒素B1的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而第一板在與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點，則試樣中黃曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下。若第一板在與第二板的相同位置上出現(xiàn)熒光點，則將第一板與第三板比較，看第三板上第二點與第一板上的第二點的相同位置上的熒光點是否與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點重疊，如果重疊，再進行確證試驗。在具體測定中，第一、二、三板可以同時做，也可按照順序做。如按順序做，當(dāng)在第一板出現(xiàn)陰性時，第三板可以省略，如第一板為陽性，則第二板可以省略，直接作第三板。23第二十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日④確證試驗另取薄層板兩塊，于第四、第五兩板距左邊緣0.8～1cm處各滴加10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）及1小滴三氟乙酸；在距左邊緣2.8～3cm處，于第四板滴加20μL樣液及1小滴三氟乙酸；于第五板滴加20μL樣液、10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）及1小滴三氟乙酸，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機吹熱風(fēng)2min，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40℃。再用雙向展開法展開后，觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點重疊的衍生物。觀察時，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。如樣液黃曲霉毒素B1含量高時則將樣液稀釋后，按單向展開法中確證試驗的方法做確證試驗。24第二十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日⑤稀釋定量如樣液黃曲霉毒素B1含量高時，按單向展開法中稀釋定量操作。如黃曲霉毒素B1含量低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果的判斷，可將樣液再做雙向展開法測定，以確定含量。25第二十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日滴加一點法①點樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上滴加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板距左邊緣0.8～1cm處各滴加20μL樣液，在第二板的點上加滴10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）在第三板的點上加滴10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2μg/mL）。②展開：同滴加兩點法的橫向展開與縱向展開。26第二十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日③觀察及評定結(jié)果：在紫外光燈下觀察第一、二板，如第二板出現(xiàn)最低檢出量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點，而第一板與其相同位置上未出現(xiàn)熒光點，試樣中黃曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下。如第一板在與第二板黃曲霉毒素B1相同位置上出現(xiàn)熒光點，則將第一板與第三板比較，看第三板與第一板相同位置上的熒光點是否與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點重疊，如果重疊再進行以下確證試驗。27第二十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日④確證試驗：另取兩板，于距左邊緣0.8～1cm處，第四板滴加20μL樣液、1滴三氟乙酸；第五板滴加20μL樣液、10μL0.04μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液及1滴三氟乙酸。產(chǎn)生衍生物及展開方法同滴加兩點法中的“④確證試驗”。再將以上二板在紫外光燈下觀察，以確定樣液點是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點重疊的衍生物，觀察時可將第一板作為樣液的衍生物空白板。經(jīng)過以上確證試驗定為陽性后，再進行稀釋定量，如含黃曲霉毒素B1低，不需稀釋或稀釋倍數(shù)小，雜質(zhì)熒光仍有嚴重干擾，可根據(jù)樣液中黃曲霉毒素B1熒光的強度，直接用雙向展開法定量。28第二十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日4．結(jié)果計算：式中X——試樣中黃曲霉毒素B1的含量，μg/kg；V1——加入苯-乙腈混合液的體積，mL；V2——出現(xiàn)最低熒光時滴加樣液的體積，mL；D——樣液的總稀釋倍數(shù)；m——加入苯-乙腈混合液溶解時相當(dāng)試樣的質(zhì)量，g；0.0004——黃曲霉毒素B1的最低檢出量，μg。5．試劑三氯甲烷、正己烷或石油醚、甲醇、苯、乙腈、無水乙醚或乙醚經(jīng)無水硫酸鈉脫水、丙酮、硅膠G、三氟乙酸、無水硫酸鈉、氯化鈉、苯-乙腈混合液、甲醇水溶液（55+45）、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液。6．儀器小型粉碎機、樣篩、電動振蕩器、全玻璃濃縮器、玻璃板（5cm×20cm）、薄層板涂布器、展開槽、紫外光燈、微量注射器或血色素吸管。29第二十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日四、相關(guān)知識食品中黃曲霉毒素B1測定——薄層色譜法原理試樣中黃曲霉毒素B1經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定含量。本法摘自GB/T5009.22-2003，適用于糧食、花生及其制品、薯類、豆類、發(fā)酵食品及酒類等各種食品中黃曲霉毒素B1的測定。本法黃曲霉毒素B1的最低檢出量為0.0004μg，檢出限為5μg/kg。五、測定食品中黃曲霉毒素的方法（一）食品黃曲霉毒素的限量（二）食品黃曲霉毒素測定方法測定食品中黃曲霉毒素的其它方法包括薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附劑法、高效液相色譜法、微柱篩選法等，出自GB/T5009.22-2003，GB/T5009.23-2003，GB/T5009.24-2003。1．酶聯(lián)免疫吸附劑法測定食品中黃曲霉毒素B1原理2．高效液相色譜法測定食品中黃曲霉毒素。。3．GB/T23212-2008《牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的測定》——液相色譜-熒光檢測法。30第三十頁，共三十九頁，2022年，8月28日項目三：測定食品中鹽酸克倫特羅的含量一、案例二、選用國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T5009.192-2003動物性食品中克倫特羅殘留量的測定——高效液相色譜法。31第三十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日三、測定方法1．提?。?）肌肉、肝臟、腎臟試樣：稱取肌肉、肝臟或腎臟試樣10g(精確0.01g)，用20mL0.1mol/L高氯酸溶液勻漿，置于磨口玻璃離心管中；然后置于超聲波清洗器中超聲20min，取出置于80℃水浴中加熱30min，取出冷卻后4500r/min離心15min。傾出上清液，沉淀用5mL0.1mol/L高氯酸溶液洗滌，再離心，將兩次的上清液合并。用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9.5，若有沉淀產(chǎn)生，再以4500r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至磨口玻璃離心管中，加人8g氯化鈉，混勻，加人25mL異丙醇+乙酸乙酯(40+60)，置于振蕩器上振蕩提取20min。提取完畢，放置5min(若有乳化層稍離心—下)。用吸管小心將上層有機相移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，用20mL異丙醇+乙酸乙酯(40+60)再重復(fù)萃取—次，合并有機相，于60℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至近干。用1mL0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)充分溶解殘留物，經(jīng)針筒式微孔過濾膜過濾，洗滌三次后完全轉(zhuǎn)移至5mL玻璃離心管中，用0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)定容至刻度。（2）尿液試樣：（3）血液試樣：32第三十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日2．凈化依次用10mL乙醇、3mL水、3mL0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)，3mL水沖洗弱陽離子交換柱，取適量上述提取液至弱陽離子交換柱上，棄去流出液，分別用4mL水和4mL乙醇沖洗柱子，棄去流出液，用6mL乙醇+濃氨水(98+2)沖洗柱子，收集流出液。將流出液在N2-蒸發(fā)器上濃縮至干。3．試樣測定前的準(zhǔn)備于凈化、吹干的試樣殘渣中加入100～500μL流動相，在渦漩式混合器上充分振搖，使殘渣溶解，液體渾濁時用0.45μm的針筒式微孔過濾膜過濾，上清液待進行液相色譜測定。33第三十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日4．測定（1）液相色譜測定參考條件色譜柱：BDS或ODS柱，250mm×4.6mm，5μm。流動相：甲醇+水(45+55)。流速：1mL/min。進樣量：20～50μL。柱箱溫度：25℃。紫外檢測器：244nm。（2）測定吸取20～50μL標(biāo)準(zhǔn)校正溶液及試樣液注入液相色譜儀，以保留時間定性，用外標(biāo)法單點或多點校準(zhǔn)法定量。34第三十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日5．結(jié)果計算式中X——試樣中克倫特羅的含量，μg/kg或μg/L；A——試樣色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的峰面積比值對應(yīng)的克倫特羅的質(zhì)量，ng；f——試樣稀釋倍數(shù)；m——試樣的取樣量，g或mL。6．試劑氯化鈉、高氯酸溶液(0.1mol/L)、氫氧化鈉溶液(1mol/L)、磷酸二氫鈉緩沖液(0.1mol/L，pH6.0)、異丙醇+乙酸乙酯(40+60)、乙醇+濃氨水(98+2)、甲醇+水(45+55)、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液、弱陽離子交換柱(LC-WCX)(3mL)。7．儀器水浴超聲清洗器、磨口玻璃離心管、5mL玻璃離心管、酸度計、離心機、振蕩器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、渦漩式混合器、針筒式微孔過濾膜(0.45μm，水相)、N2-蒸發(fā)器、勻漿器、高效液相色譜儀。35第三十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日四、相關(guān)知識動物性食品中克倫特羅殘留量測定——高效液相色譜法原理。固體試樣剪碎，用高氯酸溶液勻漿，液體試樣加入高氯酸溶液，進行超聲加熱提取后，用異丙醇+乙酸乙醋(40