酶工程課后習題答案

第一章酶工程基礎

L名詞解釋：酶工程、比活力、酶活力、酶活國際單位、酶反應動力學

①酶工程：由酶學與化學工程技術、基因工程技術、微生物學技術相結合而產(chǎn)生的一門新

技術，是工業(yè)上有目的地設計一定的反應器和反應條件，利用酶的催化功能，在常溫常壓下

催化化學反應，生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品或服務于其它目的地一門應用技術。

②比活力：指在特定條件下，單位質量的蛋白質或RNA所擁有的酶活力單位數(shù)。

③酶活力：也稱為酶活性，是指酶催化某一化學反應的能力。其大小可用在一定條件下，

酶催化某一化學反應的速度來表示，酶催化反應速度愈大，酶活力愈高。

④酶活國際單位：1961年國際酶學會議規(guī)定：在特定條件(25C,其它為最適條件)下，

每分鐘能轉化1Nmol底物或催化1lxmol產(chǎn)物形成所需要的酶量為1個酶活力單位，即為國

際單位(IU)O

⑤酶反應動力學:指主要研究酶反應速度規(guī)律及各種因素對酶反應速度影響的科學。

2.說說酶的研究簡史

酶的研究簡史如下：

(1)不清楚的應用：釀酒、造醬、制飴、治病等。

(2)酶學的產(chǎn)生：1777年，意大利物理學家Spallanzani的山鷹實驗；1822年，美國外科

醫(yī)生Beaumont研究食物在胃里的消化；19世紀30年代，德國科學家施旺獲得胃蛋白酶。

1684年，比利時醫(yī)生Helment提出ferment一引起釀酒過程中物質變化的因素(酵素)；

1833年，法國化學家Payen和Person用酒精處理麥芽抽提液，得到淀粉酶；1878年，德國

科學家Kuhne提出enzyme一從活生物體中分離得到的酶，意思是“在酵母中”(希臘文)。

(3)酶學的迅速發(fā)展(理論研究)：1926年，美國康乃爾大學的“獨臂學者”薩姆納博士從

刀豆中提取出腺酶結晶，并證明具有蛋白質的性質；1930年，美國的生物化學家Northrop

分離得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶結晶，確立了酶的化學本質。

3.說說酶工程的發(fā)展概況

I.酶工程發(fā)展如下：

①1894年，日本的高峰讓吉用米曲霉制備淀粉酶，酶技術走向商業(yè)化：

②1908年，德國的Rohm用動物胰臟制得胰蛋白酶，皮革軟化及洗滌；

③1911年，Wallerstein從木瓜中獲得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；

④1949年，用微生物液體深層培養(yǎng)法進行a—淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)，揭開了近代酶工業(yè)的序幕;

⑤1960年，法國科學家Jacob和Monod提出的操縱子學說，闡明了酶生物合成的調節(jié)機制,

通過酶的誘導和解除阻遏，可顯著提高酶的產(chǎn)量；

@1971年各國科學家開始使用“酶工程”這一名詞。

H.在酶的應用過程中，人們注意到酶的一些不足之處，如：穩(wěn)定性差，對強酸堿敏感，只

能使用一次，分離純化困難等，解決的方法之一是固定化。

固定化技術的發(fā)展經(jīng)歷如下歷程：

①1916年，Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性；

②1969年，日本千佃一郎首次在工業(yè)規(guī)模上用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸生產(chǎn)L一氨基

酸；

③1971年，第一屆國際酶工程會議在美國召開，會議的主題是固定化酶。

4.酶的催化特點

酶催化作用特性有：

①極高的催化效率：在37七或更低的溫度下，酶的催化速度是沒有催化劑的化學反應速率

的1012To2°倍;

②高度的專一性：一種酶僅作用于一種或一類化合物，或一定的化學鍵，催化一定的化學反

應并生成一定的產(chǎn)物；

③活性的不穩(wěn)定性：酶的催化反應需要溫和的條件，強酸、強堿、高溫等條件都能使酶破壞

而完全失去活性，所以酶作用一般都要求比較溫和的條件，如常溫、常壓、接近中性的酸堿

度等；

④活，i生的可調節(jié)性：酶的催化活性是受調節(jié)和控制的酶促反應受多種因素的調控，以適應機

體對不斷變化的外環(huán)境和生命活動的需要。其中包括三方面的調節(jié)，a.對酶生成與降解量的

調節(jié);b.酶催化效力的調節(jié);c.通過改變底物濃度對酶進行調節(jié)等。

5.簡要說說影響酶催化作用的因素

影響酶催化作用的因素有因和外因，因有：酶濃度、底物濃度和產(chǎn)物濃度；

外因有：溫度、PH、激活劑和抑制劑。

①底物濃度：當?shù)孜餄舛群艿蜁r，反應速度隨底物濃度的增加而急劇加快，兩者呈正比關

系，表現(xiàn)為一級反應；隨著底物濃度的升高，反應速度不再呈正比例加快，反應速度增加的

幅度不斷下降；如果繼續(xù)加大底物濃度，反應速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應，此時，無論

底物濃度增加多大，反應速度也不再增加。

②產(chǎn)物濃度：生物代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物是酶的變構劑，使酶變構而影響酶

的反應速度，即反饋調節(jié)作用。

③酶濃度：在底物濃度足夠高的條件下，酶催化反應速度與酶濃度成正比。

④溫度：在一定溫度圍，反應速度隨溫度升高而加快，一般溫度每升高10℃,反應速率

大約增加一倍；超過一定圍，較高溫度會引起酶三維結構變化，甚至變性，導致催化活性下

降，反應速度反而隨溫度上升而減緩。

⑤PH：酶分子處于最適PH時，催化反應速度達最大值；當反應介質PH偏離酶最適PH,

會影響酶與底物結合，進而影響反應速度，故必須控制好PH。

⑥激活劑：凡能提高酶活性的物質，都稱為激活劑，大部分是離子或簡單的有機化合物。

⑦抑制劑：凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質稱為酶的抑制劑，通常抑制作

用分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。

6說說米氏方程的意義

y=M/S］這個方程即為米氏方程,是在假定存在一個穩(wěn)態(tài)反應條件下推導出來的。

K,"+S

其中：K.,值稱為米氏常數(shù)，是酶促反應速度為最大酶促反應速度值一半時的底物濃度；

V,3是酶被底物飽和時的反應速度；

［S］為底物濃度。

米氏方程表示一個酶促反應的起始速度（v）與底物濃度（S）關系的速度方程。其意義為：

①方程反映了反應性質、反應條件、反應速度之間的關系；

②反映了反映速度與底物濃度之間的關系，當［S］遠大于K.時,反應速度與底物濃度無關；

③反映了酶反應速度與酶濃度的關系，當［S］遠大于兒時,v=k2［E。］為線性關系，酶活正比于酶

濃度。

第二章酶的發(fā)酵工程

1.名詞解釋：誘導物、（誘導作用）、終產(chǎn)物阻遏、分解代謝產(chǎn)物阻遏、葡萄糖效應

①誘導物：誘導酶起始合成的物質（通常是酶的底物），可以引起阻遏蛋白的構象變化，

使之不利于與操縱基因結合，如乳糖；而能引起阻遏蛋白的構象變化從而有利于其與操縱基

因結合，阻遏酶產(chǎn)生的物質稱為輔助阻遏，如氨基酸和核昔酸等。

②終產(chǎn)物阻遏：催化某一特異產(chǎn)物合成的酶，在培養(yǎng)基中有該產(chǎn)物存在的情況下常常是不

合成的，即受阻遏的。

③分解代謝產(chǎn)物阻遏：大腸桿菌在含有能分解的兩種底物（如葡萄糖和乳糖）的培養(yǎng)基中

生長時，首先分解利用其中的一種底物（葡萄糖），而不分解另一種底物（乳糖），這是因為

葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物阻遏了分解利用乳糖的有關酶合成的結果，此作用即為分解代謝產(chǎn)物

阻遏。

④葡萄糖效應：由于葡萄糖常對分解利用其他底物的有關酶的合成有阻遏作用，故分解代

謝產(chǎn)物阻遏又稱為葡萄糖效應。

2.舉例說明酶生物合成調節(jié)機制在酶發(fā)酵過程優(yōu)化中的指導意義

乳糖是大腸桿菌合成B-半乳糖甘酶的誘導物，若只采用乳糖作為碳源，雖然提高了發(fā)酵單

位卻增加了成本。若采用葡萄糖和乳糖以適當比例組成的混合碳源，則在提高產(chǎn)量的同時又

能降低發(fā)醉原料成本。在利用嗜熱脂肪芽飽桿菌生產(chǎn)a-淀粉酶時，采用甘油替代果糖解除

分解代謝阻遏，可以使產(chǎn)量提高約25倍。在利用枯草芽抱桿菌活菌生產(chǎn)蛋白酶時，若培養(yǎng)

基中含有氨基酸，酶產(chǎn)量很低：如果除去培養(yǎng)基中的氨基酸，蛋白酶產(chǎn)量會大幅度提高。再

如，枯草芽苑桿菌的鳥昔發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵，采用腺嘿吟營養(yǎng)缺陷型突變株。發(fā)酵

過程中人為限制腺嘿吟的濃度，使細胞代謝途徑中的腺嘿吟類核甘酸濃度保持在不致引起關

鍵酶的反饋抑制和阻遏的水平，有利于鳥昔的積累。

3.舉例說明酶生物合成調節(jié)機制在產(chǎn)酶生物菌種改造中的指導意義

若通過基因工程手段和傳統(tǒng)誘變的技術獲得在抗代謝物存在時也能正常生長的突變株，有的

突變株的相關酶系合成對這種抗代謝物不敏感，這也就解除了某些代謝物對有關酶系的反饋

阻遏。例如，異亮氨酸合成途徑中的關鍵酶一一高絲氨酸脫氫酶受蛋氨酸的反饋阻遏，通過

選育蛋氨酸結構類似物抗性突變株或者蛋氨酸缺陷型菌株，可提高該酶量，從而提高異亮氨

酸產(chǎn)量。此外，在育種工作中，還可以篩選組成型菌株以提高酶的產(chǎn)量。以B-半乳糖普酶

的生產(chǎn)為例，將誘導型菌株培養(yǎng)在含有抑制物質鄰硝基-B-D巖藻糖昔和乳糖的培養(yǎng)基中時,

由于誘導酶的合成被抑制，野生型因不能利用乳糖而不能生長，但組成型酶突變株對于乳糖

的利用則不受限制，因而此環(huán)境中生長的突變株為組成型酶產(chǎn)生菌。

4.在酶的發(fā)酵過程中，提高酶產(chǎn)量的措施有哪些

①添加誘導物：對于誘導酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導物能使酶的產(chǎn)量顯著增

加。誘導物一般分為三類：酶的作用底物，如青霉素是青霉素?；傅恼T導物；酶的反應產(chǎn)

物，如纖維素二糖可誘導纖維素酶的產(chǎn)生；酶的底物類似物，如異丙基B-D-硫代半乳糖昔

對半乳糖普酶的誘導效果比乳糖高幾百倍。

②降低阻遏物濃度：微生物酶的生產(chǎn)受到代謝末端產(chǎn)物的阻遏和分解代謝物阻遏的調節(jié)。

為避免分解代謝物的阻遏作用，可采用難于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法培養(yǎng)液

中的碳源保持在不至于引起分解代謝物阻遏的濃度。

③添加表面活性劑：在發(fā)酵生產(chǎn)中，非離子型的表面活性劑常被用作產(chǎn)酶促進劑，但它的

作用機制尚未完全研究清楚。

④添加產(chǎn)酶促進劑：產(chǎn)酶促進劑是指那些非微生物生長所必須，能提高酶產(chǎn)量但作用機制

尚未闡明的物質，它可能是酶的激活劑或穩(wěn)定劑.

5.說說微生物產(chǎn)酶菌種的要求

對于生產(chǎn)酶的菌種來說一般必須符合以下條件：

①酶的產(chǎn)量高；

②容易培養(yǎng)和管理，產(chǎn)酶細胞容易生長繁殖，適應性較強，便于管理；

③菌株遺傳性要穩(wěn)定，不易變異退化，不易感染噬菌體，保證生產(chǎn)的穩(wěn)定性；

④菌株能利用廉價原料，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低；

⑤發(fā)酵產(chǎn)物利于酶產(chǎn)品的分離純化，最好是分泌型的胞外酶；

⑥菌株安全可靠，不是病原菌，不產(chǎn)毒素及其他有害物質，不影響生產(chǎn)人員的身體健康；

⑦基因工程菌株必須符合安全性要求。

6.如果篩選酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株，如何進行篩選

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1出發(fā)菌株：黑曲霉

1.1.2分離及斜面培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)基是在察氏

培養(yǎng)基中加入1%的酪蛋白。

（1）PDA培養(yǎng)基；

（2）查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂（MgSO「7HQ）0.5g、氯化鉀0.5g、

硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g、瓊脂20g、蒸鐳水1L,加熱溶解，自然PH,分裝后121℃滅菌

20mino

培養(yǎng)方法：按要求配制發(fā)酵基質，調節(jié)初始含水量和pH后，取150g分裝于1L三角瓶中，

在0.1Mpa壓力條件下滅菌30min后，冷卻接種，接種量為0.3%,于不同條件下發(fā)酵84h,

干燥后，進行酶活的測定。

2實驗方法

2.1菌種的分離和純化：采用常規(guī)稀釋分離法。

2.2菌株的誘變處理

取0.1ml稀釋的電子懸液涂布初篩平板，30（培養(yǎng)4h,紫外燈預熱30min后，將平皿置于距

15W紫外燈30cm處距分別照射0s（對照用）、4min、6min、8min、lOmin、12min（各

做2組）。隨后在暗光條件下，用5mL無菌生理鹽水對平皿上的菌進行洗脫，適當稀釋后，

涂布于分離平皿，以黑布包裹3（TC下避光培養(yǎng)3-4天，從長出菌落與其水解圈直徑比的大小

及菌落形態(tài)的變化，挑選所需菌種，編號并保存，同時根據(jù)平皿菌落數(shù)計算致死率,從而求

得成活率。

致死率（％）=（A-B）/AX100

式中：A為對照組平皿上的菌落數(shù)；B為誘變處理后平皿上的菌落數(shù)。

2.3酶活測定方法

酶活定義：1g酶粉在4（TC,pH值為3.0反應條件下，1分鐘水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個

酶活力單位（U/g）。

3結果與分析

3.1菌株選育結果

為了篩選在固體培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶高的菌株，經(jīng)紫外線誘變處理后，得到100余株突變

株。這些菌株在形態(tài)上有一定的差異，依照其菌落的形態(tài)、菌落大小、抱子顏色和抱子豐滿

程度以及水解圈的大小，從中挑選出20株先經(jīng)三角瓶液體發(fā)酵產(chǎn)酶測定，獲得10個高產(chǎn)菌

株再經(jīng)三角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)復選。其中zTO的酶活最高為9284U/g（干基），比出發(fā)菌株

（CK）提高了11.1倍。紫外線誘變的機理是能作用于嘴咤，形成喀唳二聚體（主要是TT）,

影響DNA正常解鏈與堿基配對，從而引起基因突變，提高酶產(chǎn)量。

7.結合酶生物合成模式，淺談該如何提高酶的合成量

（1）遺傳控制

①誘變育種

a.使誘導型變?yōu)榻M成型：選育組成型突變株

b.使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?/p>

c.解除反饋阻遏：選育營養(yǎng)缺陷型突變株、選育結構類似物抗性突變株

d.解除分解代謝物阻遏：選育抗分解代謝阻遏突變株

②基因工程育種：改變細胞調節(jié)基因，使菌種由誘導型變?yōu)榻M成型；增加結構基因的拷貝數(shù),

增加細胞專一性酶的生產(chǎn)。

(2)條件控制

①添加誘導物酶的作用底物、作用底物的前體、反應產(chǎn)物、酶的底物類似物或底物修飾物

②降低阻遏物濃度：

產(chǎn)物阻遏：除去終產(chǎn)物；添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑

分解代謝物阻遏：避免使用葡萄糖、避免培養(yǎng)基過于豐富、添加一定量的cAMP

③添加表面活性劑：離子型(Tween—80),對細胞有毒害作用；

非離子型(TritonX-100),增加細胞通透性.

④添加產(chǎn)酶促進劑：酶促進劑對不同細胞、不同酶的效果各不相同，需通過試驗選用適當

的產(chǎn)酶促進劑并確定最適濃度，其作用機制并未闡明清楚。如添加植酸鈣鎂可使桔青霉素生

產(chǎn)磷酸二酯酶的量提高10-20倍。

第三章酶的分離工程

1.名詞解釋：ATPE,IEC,HPLC,2-DEo

2.細胞破碎的方法有哪些?原理是什么？

細胞破碎按照處理方法一般分為機械破碎法、物理破碎法、化學破碎法和酶促破碎法等。

①機械破碎法：通過機械運動產(chǎn)生壓縮力和剪切力，將組織細胞打碎，具有處理量大、破

碎效率高、速度快等優(yōu)點。細胞的機械破碎主要有搗碎法、研磨法和勻漿法等。

②物理破碎法：利用溫度、壓力、聲波等物理因素，使細胞破碎的方法，多用于微生物細

胞的破碎。常用的破碎方法有溫度差法、壓差法和超聲波法等。

③化學破碎法：利用各種化學試劑作用于細胞膜，從而使細胞破碎的方法。常用的化學試

劑有甲苯、丙醇、丁醇、氯仿等有機溶劑，曲拉通和吐溫等表面活性劑。

④酶促破碎法：根據(jù)細胞壁結構特點，選用適當?shù)拿?、破壞細胞壁，并在低滲透壓的溶液

中使細胞破裂的方法稱為酶促破碎法。其中在一定條件下，利用細胞自身酶系的催化作用使

細胞破碎的方法稱為自溶法，自溶法的作用效果受溫度、PH、離子強度等因素的制約。必要

時需加入適量的甲苯、氯仿等防腐劑，以防止其他微生物在自溶體系中的生長。

3.酶的提取方法有哪些？影響酶提取的主要因素有哪些？

根據(jù)酶提取時所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、

堿溶液提取和有機溶劑提取等。

①鹽溶液提取法：蛋白質在低濃度鹽溶液中，其溶解度會隨著鹽溶液濃度的升高而增加，

這種現(xiàn)象稱為鹽溶這是因為蛋白質分子吸附某種鹽類離子后，帶電表層使蛋白質分子彼此排

斥，而蛋白質分子與水分子間的相互作用卻加強，因而溶解度提高。

②酸溶液提取法：有些酶在酸性溶液中的溶解度比較大，且比較穩(wěn)定，這類酶宜采用酸溶

液提取，PH一般控制在2—6,針對酶的性質選擇合適的PH,避免PH過低引起酶失活。

③堿溶液提取法：有些酶在堿性溶液中的溶解度比較大，且比較穩(wěn)定，這類酶宜采用堿溶

液提取，PH一般控制在8—12,針對酶的性質選擇合適的PH,避免PH過高引起酶失活。

④有機溶劑提取法：一些和脂類結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的酶蛋白難溶于水、

稀鹽、稀酸或稀堿中，則常用能夠與水混溶的有機溶劑提取，如乙醇、丙酮、丁醇等。

酶主要是蛋白質，影響蛋白質提純的因素同樣會影響酶的提純，而在酶提取過程中最重要的

就是要防止酶的變性失活。影響酶提取的最主要因素是酶在所用溶劑中的溶解度及酶向溶劑

中擴散的難易。此外，在提取過程中還要注意一下因素的影響：

1)溫度：為防止酶的變性失活，提取時溫度不宜過高。特別是采用有機溶劑提取時，整個

提取操作應盡可能在低溫下進行。

2)PH：酶提取液的PH首先應保證蛋白質穩(wěn)定，為了增加酶的溶解度，提取時溶液的PH應

遠離酶的等電點。

3）攪拌：攪拌能促進酶在提取液中的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快易產(chǎn)生大量

氣泡，增大了與空氣的接觸面，會引起酶蛋白的變性失活。

4）污染：酶液是微生物生長的良好培養(yǎng)基，在提純過程中應盡可能防止微生物對酶的破壞。

5）提取液的體積：提取液的用量增加可提高提取率。但過量的提取液，使酶濃度降低，對

進一步分離純化不利。所以提取液的用量一般為含酶原料體積的3—5倍，少量多次，以得

到較好的提取效果。

4.差速離心和密度梯度離心分離酶的原理及各自特點是什么？

差速離心原理：采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法稱

為差速離心。操作時，采用均勻的懸浮液進行離心，選擇好離心力和離心時間，使大顆粒先

沉降，取出上清液，在加大離心力的條件下再進行離心，分離較小的顆粒。如此多次離心，

使不同大小的顆粒分批分離。

特點：差速離心所得到的沉降物含有較多雜質，需經(jīng)過重新懸浮和再離心若干次，才能獲得

較純的分離產(chǎn)物。差速離心主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。操作簡單方便，但分

離效果較差。

密度梯度離心原理：密度梯度離心又稱速度區(qū)帶離心。密度梯度離心是指樣品在密度梯度介

質中進行的一種沉降速度離心。密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的梯度介質制成的。梯度

介質應有足夠大的溶解度，以形成所需的密度，不與分離組分反應，不會引起分離組分的凝

聚、變性或失活，常用的有蔗糖、甘油等。等密度梯度離心又稱平衡密度梯度離心。等密度

梯度離心雖然也是在密度梯度介質中進行的離心，但被分離的物質是依靠他們的密度不同進

行分離的。此種離心常用無機鹽類制作密度梯度。

特點：離心后，不同大小、不同形狀、有一定的沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成

若干條界面清晰的不連續(xù)區(qū)帶如左圖。各區(qū)帶的顆粒較均一，分離效果較好。在密度梯度離

心過程中，區(qū)帶的位置和寬度隨離心時間的不同而改變。隨離心時間的加長，區(qū)帶會因顆粒

擴散而越來越寬。為此，適當增大離心力而縮短離心時間，可減少區(qū)帶擴寬。

5.雙水相萃取和反膠束萃取的原理?各自如何在酶的分離純化中應有？

雙水相萃取原理：是依據(jù)樣品中目標組分在兩相間的分配系數(shù)不同來進行選擇性分離，當樣

品加入雙水相體系后，由于表面性質、電荷作用和各種作用力（如疏水鍵、氫鍵和離子鍵等）

的存在和環(huán)境條件的影響，各組分在兩相中的濃度不同。由于分配系數(shù)等于系統(tǒng)平衡時兩相

中目標組分的濃度比，因此，在雙水相萃取體系中可以利用各組分K值的不同對物質進行分

離。

應用：雙水相萃取已經(jīng)用于多種生物酶的分離，如利用PEG/磷酸鹽雙水相體系提取發(fā)酵液

中的堿性木聚糖酶，利用PEG/羥丙基淀粉體系從黃豆中分離磷酸甘油酸和磷酸甘油醛脫氫

酶，利用PEG/K3P04雙水相體系萃取純化葡萄糖淀粉酶，利用PEG/Dextran雙水相體系分離

過氫氧化酶等。此外，a-淀粉酶、膽固醇氧化酶、脂肪酶、纖維素酶、L-天冬酰胺酶等在

雙水相體系中也得到較好的分離。

反膠束萃取的原理：當?shù)鞍踪|樣品與反膠束溶液表面和蛋白質表面的相互作用，在兩相界面

形成了包含蛋白質的反膠束團，此時蛋白質以最大限度擴散進入反膠束中，從而實現(xiàn)蛋白質

的正萃取。然后，含有蛋白質的反膠束與另一水相接觸，通過改變水相條件（如PH、離子

強度等），可以調節(jié)蛋白質反萃取回水相，從而實現(xiàn)正萃取或反萃取過程，回收目的蛋白質。

應用：反膠束萃取已經(jīng)用于多種酶蛋白的分離，如利用十六烷甲基三甲基溟化錠（CTAB）、

異辛烷/正辛醇反膠束溶液萃取纖維素酶，利用二烷基磷酸鹽/異辛烷反膠束溶液萃取溶菌酶,

利用琥珀酸二酯磺酸鈉/異辛烷反膠束溶液提取發(fā)酵液中的堿性蛋白酶和a-淀粉酶等。此外,

胰蛋白酶、堿性蛋白酶、異檸檬酸脫氫酶、B-羥基丁酸脫氫酶、脂肪酶等也可以利用反膠

束萃取進行分離。

6.如何理解灌注色譜是生物大分子分離純化技術的一個重大突破？以酶為例加以說明。

灌注色譜的建立是近年色譜技術發(fā)展的一個重大突破，它打破了傳統(tǒng)的流速與分辨率、容量

間的三角關系，即在流速增加的情況下，柱容量和分辨率不會降低，柱壓力也不會升高，使

得生物大分子的快速分離純化成為可能。

灌注色譜法利用流動相和溶質的對流作用，降低了溶質在介質滯留的限制，明顯地縮短了蛋

白質的分離時間。因此，它能以比HPLC快10-100倍的速度在較短的循環(huán)時間進行生物大

分子的分離。同時，該方法得到的蛋白質質量、產(chǎn)量和產(chǎn)率都有所提高，具有高流速下譜帶

不會因傳質而展寬的特點，分離度基本不受影響，室溫下操作，生物活性物質活性損失少，

回收率高，可同時進行分析和制備等特點。

灌注層析技術代表了一種解決液相色譜傳質問題的先進技術，已經(jīng)開始用于酶等蛋白質、多

肽、核酸、激素等生物大分子的分析和制備，如超氧化物歧化酶、核糖核酸酶、溶菌酶等。

7.酶結晶的原理是什么?影響酶結晶的主要因素？

酶結晶的原理：通過緩慢地改變母液中酶蛋白溶解度，使酶略處于過飽和狀態(tài)，再配合適當

結晶條件，從而得到酶的晶體。

影響酶蛋白結晶的因素眾多，具體可分為物理因素、化學因素、和生物化學因素。

物理因素：達到平衡的方法、溫度、重力、壓力、介質的電解質性質和黏度、均相或非均相

成核等。

化學因素：PH、沉淀劑類型和濃度、離子種類和強度、過飽和度、氧化/還原環(huán)境、酶濃度、

交聯(lián)體、去垢劑和雜質的存在等。

生物化學因素：酶純度、抑制劑、酶蛋白的聚集狀態(tài)、酶水解、化學和遺傳修飾、蛋白質自

身的對稱性、穩(wěn)定性和等電點等。

第四章固定化酶與固定化細胞

1.比較使用游離酶、固定化酶和固定化細胞作為催化劑的優(yōu)缺點。

(1)酶作為生物催化劑的優(yōu)缺點

優(yōu)點：專一性強；催化效率高；催化反應的條件溫和；活性可以調節(jié)。

缺點：穩(wěn)定性差；分離純化困難，因此一般成本都比較高；使用后回收困難，不能重復使

用，同時也為產(chǎn)物的純化帶來困難。

(2)固定化酶的優(yōu)缺點

優(yōu)點

①極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。

②可以在較長時間反復使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。

③酶反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化。

④在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。

⑤較能適應于多酶反應。

⑥酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質量有保障，成本低。

缺點

①酶固定化過程中發(fā)生的物理化學變化會使酶的活性中心受損，可能導致酶活性降低。

②酶連接于固相載體后，酶蛋白的構象和活性中心都可能發(fā)生改變，而且載體骨架和側鏈可

能造成空間位阻，從而影響底物與酶分子接近，進而降低酶分子的實際催化活力。

③只適用于催化可溶性和較小分子的底物，對大分子底物不適宜。

④與完整細胞相比，其不適宜于多酶反應，特別是需要輔助因子的反應。

（3）固定化細胞的優(yōu)缺點

固定化細胞的優(yōu)勢

固定化細胞與固定化酶比較，其優(yōu)越性在于：

①固定化細胞保留了胞原有的多酶系統(tǒng)。使得它既可以作為單一的酶發(fā)揮作用，又可利用它

所包含的復合酶系完成一部分代謝乃至整個發(fā)酵過程，特別是那些需要輔助因子參與的合成

代謝過程，如乙醇發(fā)酵、合成干擾素等。

②固定化細胞保持了胞酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，因而更穩(wěn)定。由于固定化細胞兼具游離

細胞完整的酶系統(tǒng)和酶的固定化技術二者的優(yōu)點，因而它可以省去酶的分離純化工作，大大

降低成本，并減少酶的活性損失，這一點對于細胞酶與不穩(wěn)定的酶來說特別有意義，加上固

定化細胞的制備與使用都比固定化酶更簡便，所以固定化細胞在工業(yè)生產(chǎn)和科學研究中都得

到了廣泛的應用。

固定化生長細胞與游離細胞相比，其優(yōu)越性表現(xiàn)為：

①固定化生長細胞可以增殖，提高細胞的密度，因此可以獲得高度密集而體積縮小的基因工

程菌集會體，不需要經(jīng)歷普通發(fā)酵的多次培養(yǎng)、放大，從而可以縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)能

力。

②可以提高基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性，發(fā)酵性能較穩(wěn)定，可以較長時間反復使用或連續(xù)使用,

有利于生產(chǎn)自動化。

③用固定化細胞發(fā)酵時，發(fā)酵液中基本不含（或含有很少）菌體，有利于產(chǎn)品的分離純化和

提高產(chǎn)品質量。由于固定化細胞既利用了固定化酶所具有的一些優(yōu)點，如產(chǎn)物易分離、生產(chǎn)

易連續(xù)化和自動化，又利用了細胞所具有的完整酶系統(tǒng)和細胞膜的選擇通透性，同時固定化

細胞的制備又比固定化酶容易，因此目前認為固定化細胞的應用前景可能會更好一些。

固定化細胞的局限性

①這種技術僅能用于產(chǎn)生胞酶的菌體。

②細胞多種酶的存在，會形成不需要的副產(chǎn)物。因此有時需要采取加熱、加酸、加堿或表面

活性劑等預處理措施。例如，用固定化產(chǎn)氨短桿菌把延索酸轉化為蘋果酸，為了阻止琥珀酸

的同時生成，可先用膽酸鹽進行抽提處理；解決副反應問題的另一辦法則是采用不同菌株。

③固定化細胞不僅有固定化帶來的擴散限制，比如載體形成的孔隙大小會影響高分子底物的

通透性等，而且還增添了細胞膜、細

胞壁的擴散限制作用。

④由于微生物本身的復雜性，形成的固定化細胞一般在穩(wěn)定性和酶活力水平上都比較低。

⑤使用初期往往會有一些細胞組分滲出，影響產(chǎn)品質量。

⑥如果底物（或產(chǎn)物）為高分子物質或不溶性物質，使用時就十分麻煩。

2.簡述常見的酶的固定化方法、固定化的基本原理以及各自的優(yōu)缺點。

（1）載體結合法

就是把酶結合到一種水不溶的固體載體上，根據(jù)結合的方式不同又可分為下列幾種方法。

①物理吸附法

無機載體，如高嶺土、硅膠、氧化鋁、活性炭、羥基磷灰石等。

有機載體，如纖維素、合成樹脂、骨膠原、淀粉等。吸附容量比無機載體高。

②離子結合法

離子結合法是指在適宜的pH和離子強度條件下，酶通過離子鍵結合到具有離子交換基的水不

溶性載體中的固定化方法，因而也稱離子交換吸附法。

物理吸附法的優(yōu)點是：利用此法進行固定化，酶的活性中心不易被破壞，且酶的高級結構變

化少，因而酶活力損失很少。但是物理吸附法固定的酶與載體相互作用力弱、酶容易從載體

上脫落下來。與物理吸附法相似，離子結合法的優(yōu)點是：操作簡單，處理條件溫和，酶的高

級結構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率高的固定化酶。缺點是：載

體和酶的結合力比較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強度高的條件下進行反應時,

酶往往會從載體上脫落。但是與物理吸附劑相比，離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附

劑，約50?150mg蛋白每克載體。

③共價結合法

共價結合法是指借助共價鍵將酶的活性非必需側鏈基團和載體的功能基團進行偶聯(lián)的固定化

方法。

(2)無固體載體交聯(lián)法

交聯(lián)法是指利用雙功能或多功能試劑(bifunctionalormulti-functionalreagent)在酶

分子間、酶分子與惰性蛋白間進行交聯(lián)反應，以共價鍵制備固定化酶的方法。它與共價結合

法的不同之處是它不使用載體。

交聯(lián)法的優(yōu)點是操作簡便。其缺陷則是交聯(lián)反應的過程往往比較激烈，因為交聯(lián)反應可能發(fā)

生在酶分子間，也可能發(fā)生于分子，分子間交聯(lián)和分子交聯(lián)的比例在一定程度上和酶的濃度

與交聯(lián)試劑的濃度有關，也與pH、離子強度有關，如果交聯(lián)條件控制不合適，許多酶易在固

定化過程中失效，酶回收率不高。

(3)包埋法

包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合促進劑(包括交聯(lián)劑)的作用進行聚

合，酶被包埋在聚合物中以達到固定化。

包埋法操作簡單，由于酶分子只被包埋，未受到化學反應，可以制得較高活力的固定化

酶.對大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細胞都是適用的。但是，只有小分子底物和產(chǎn)

物可以通過凝膠網(wǎng)絡，而對大分子底物不適宜。

①凝膠包埋

凝膠包埋法是將酶分子包埋在多孔凝膠中。

?微囊化

微囊型包埋是指將一定量的酶溶液包在半透性的高分子微孔膜。

與凝膠包埋法相比，微囊法包埋的優(yōu)點是：固定化酶顆粒比前者要小得多，比較有利于底物

和產(chǎn)物擴散，能容許小分子底物和產(chǎn)物自由出入膜外，由于囊的表面積與相對體積的比值大,

故物質交換可以進行得十分迅速。另一方面半透膜還能阻止蛋白質分子滲漏和進入，注人體

時既可避免引起免疫過敏反應，同時也可免遭蛋白水解酶的降解，因此其具有較大的醫(yī)學價

值。缺點是反應條件要求高，制備成本也較高。

(4)不同固定化方法的聯(lián)用

不同的固定化方法有各自的優(yōu)缺點，在實際的固定化操作中，經(jīng)常把各種固定化方法聯(lián)用，

以獲得最佳效果。通常的聯(lián)用有吸附加交聯(lián)和包埋加交聯(lián)。

3.如何評價固定化酶的固定化效果。

由于選用的固定化方法不同，固定化酶的活力和性質也有所不同，因此需要對不同的固定化

方法進行評價。評價的指標主要有：

（1）固定化酶的比活

每克（毫克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍簡挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示

（酶膜、酶管、酶板）。

（2）操作半衰期

是衡量穩(wěn)定性的指標。指在連續(xù)使用的條件下，固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的

時間（tl/2）o固定化酶的操作半衰期是影響其實際應用的重要因素。

（3）偶聯(lián)效率=（加入的蛋白量一溶液中殘留的蛋白量）/加入的總蛋白量X100%

（4）活力回收=（固定化酶活力/投入的總酶活力）X100%

（5）相對酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值。

（6）酶載量單位載體所固定的酶活力（或酶蛋白量）。

4.簡述固定化對酶性質的影響（固定化酶的性質）。

（1）穩(wěn)定性大多數(shù)酶固定化后，穩(wěn)定性都增強，操作壽命和保存壽命也

延長。

（2）固定化酶的最適溫度和最適pH固定化后，大多數(shù)酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度

也隨之提高。酶固定化后，對底物作用的最適pH和酶活力一pH曲線常常會發(fā)生偏移。帶負電

荷的載體固定化的酶的最適pH向堿性偏移，帶正電荷的載體固定化的酶的最適pH向酸性偏移。

（3）固定化酶的動力學特征固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。

（4）固定化酶的專一性酶固定化后，一般不會改變其專一性。但也有少數(shù)情況酶固定化

后專一性會發(fā)生改變。

5.簡述固定化細胞作為生物催化劑的優(yōu)點和缺點。

固定化細胞的優(yōu)勢和局限性（第1題第（3）項）

6.設計實驗固定化釀酒酵母進行乙醇生產(chǎn)。

7.設計實驗測定固定化葡萄糖異構酶的活力和比活力的方法。

8.涉及啤酒生產(chǎn)中常用的木瓜蛋白酶的固定化方法。

9.查閱資料分析某種交聯(lián)酶晶體的制備過程以及應用。

10.比較有載體固定化和無載體固定化生物催化劑各自的優(yōu)勢。

第五章化學酶工程

1.簡述酶分子化學修飾的基本原理

酶的化學修飾主要是對一些活潑性比較強的氨基酸側鏈基團進行修飾。主要包括氨基、竣基、

疏基、胭基、酚基氨基、竣基、流基、胭基、酚基等。這些基團在酶蛋白分子中可以形成各

種次級鍵，對酶蛋白空間結構的形成和穩(wěn)定有重要作用。這些側鏈基團一旦改變將引起酶蛋

白空間構象及微環(huán)境的改變，從而改變酶的特性和功能。對這些基團進行修飾后，對酶的性

質影響大，修飾效果明顯。

2.酶分子被化學修飾后在性質上有哪些變化？

首先要強調的是，我們對酶進行修飾的目的就是要改變酶的結構和特性，而且要使這種

改變朝著對人類有用的方向進行。不管是從理論上分析還是從實際修飾的結果來看，酶經(jīng)修

飾之后，性質朝任何方向改變的可能性都存在，而且多數(shù)改變都是不利的。酶修飾之后，性

質的變化因酶、修飾劑和修飾方法的不同而出現(xiàn)很大的差異。

(1)熱穩(wěn)定性

用前面介紹的一些修飾劑對酶進行修飾，在多數(shù)情況下可以提高酶的穩(wěn)定性。但PEG沒

有明顯的提高。

(2)抗原性

抗原性是藥物用酶必須解決的問題。在前面介紹過的修飾劑中，被認為可以消除酶的抗

原性的修飾劑只有PEG和人血清白蛋白。

(3)對各類失活因子的抵抗力

由于酶修飾之后，表面會帶上修飾劑而受到保護，因此，酶修飾之后，抵抗蛋白酶水解

和其它失活因子的能力普遍增強。

(4)在生物體的半衰期

由于修飾之后，穩(wěn)定性和對抗各種失活因子的能力增強，因此，半衰期也普遍延長。

3.酶分子的哪些側鏈可以被修飾？

①峻基可用碳二亞胺、硼氟化三甲洋鹽和甲醇修飾

②氨基可用酸肝、鹵代乙酸、芳基鹵和芳香族磺酸等修飾

③疏基包括形成二硫鍵、有機汞、取代、氧化等幾種方式。

④咪哇基

⑤(酚)羥基

⑥胭基

⑦色氨酸片I喋基

4.為什么環(huán)糊精及其衍生物可以作為模擬酶模型，該模型與大型環(huán)冠酰模擬酶模型有何區(qū)

別？

5.簡述抗體酶催化的反應類型有哪些？

①氨基轉移酶

生物體蛋白質的合成是一個非常復雜過程。氨基酸在摻入肽鏈之前必需進行活化以獲得額外

能量，這活化過程即酰基轉移反應，又稱氨?；磻?/p>

②重排反應

Claisen重排是有機化合物異構化的一種重要形式，生物體由一些化合物在光照下會發(fā)生

Claisen重排。

③氧化還原反應

氧化還原反應在生物體十分廣泛，主要是呼吸鏈的一系列反應。

④金屬螯合反應

金屬螯合反應對于輔酶、輔因子和酶的結合來說意義重大。

⑤磷酸酯水解反應

磷酸二酯鍵是自然界最穩(wěn)定的鍵之一，因此，它的水解對抗體酶來說是個挑戰(zhàn)。

⑤其它反應

抗體酶還可催化磺酸酯水解反應和光誘導反應等反應類型，隨著抗體酶的研究與開發(fā)的深入,

抗體酶催化的反應類型也將越來越多，并為人們所用。

6.抗體酶有何特性？

①能催化一些天然酶不能催化的反應

抗體酶的多樣性決定了抗體酶的催化反應類型多樣性；催化抗體的構建，表明可通過免疫學

技術，為人工酶的設計和制備開辟一條新的、實用化的途徑。這種利用抗原-抗體識別功能,

把催化活性引入免疫球蛋白結合位點的技術，或許可能發(fā)展成為構建某種具有定向特異性和

催化活性的生物催化劑的一般方法。

②有更強的專一性和穩(wěn)定性

抗體酶作為一種具酶和抗體雙重功能的新型大分子用作分子識別元件，具有優(yōu)于酶和抗體的

突出特點。因為配體底物與抗體酶的活性部位結合后，會立即發(fā)生催化反應，釋放產(chǎn)物，所

以每一次分子反應之后，抗體的分子識別位點都可以再生，這就使催化抗體能夠作為一種可

以連續(xù)反復使用的可逆性分子。

③催化作用機制不同

酶催化機制是“鎖鑰學說"(LockandKey)及“誘導契合學說"(Induced-

Fit)；而抗體酶的催化劑至目前還沒有完全搞清楚。Janda曾提出“識別開關”或“誘餌

開關”(BaitandSwitch)機制，即抗體將底物“釣進”抗體結合部位，然后使其與抗

體結合，打開底物轉化為反應過渡態(tài)的“開關”，導致共價鍵斷裂，形成產(chǎn)物，還有待研究。

7.簡述分子印跡的基本過程

所謂分子印跡(molecularimprinting)是制備對某一化合物具有選擇性的聚合物的過程。

這個化合物叫印跡分子(printmolecular,P)或叫模板分子(template,T)。印跡技術

包括下列容：

①選定印跡分子和功能單體，使兩者發(fā)生互補反應。

②與印跡分子發(fā)生互補作用的單體與其它單體共同發(fā)生聚合反應。

③將印跡分子從聚合物中去除。這樣形成的聚合物就保留有和印跡分子的形狀、大小完全

一樣的空穴，印跡的聚合物能維持相對于印跡分子的互補性，因此，該聚合物能以高選擇性

重新結合印跡分子。

第六章生物酶工程

1.什么是酶基因的克隆，其基本步驟有哪些？

指在體外將各種來源的目的酶基因與載體連接形成具有自我復制能力的DNA分子，即重

組載體，然后通過轉化或轉染將重組載體導入宿主細胞并培養(yǎng)，篩選出含有目的基因的轉化

子細胞，再進行擴增、提取，從而獲得大量所需酶基因。

步驟：1）目的酶基因的獲取

2）克隆載體的選擇

3）目的基因與載體的連接

4）帶有目的基因的重組載體轉化宿主

5）正確重組子的篩選與鑒定

2.酶基因克隆有哪些常用的方法？

1）根據(jù)已知序列來擴增目的基因

2）根據(jù)已知探針從基因文庫中釣取目的基因

3）未知序列基因的打靶

3.原核生物基因表達系統(tǒng)有什么特點？

在原核生物中表達具有其自身的特點：表達效率高，多數(shù)選用

大腸桿菌為表達宿主。

4.真核生物基因表達系統(tǒng)有什么特點？

由于原核生物缺少翻譯后的加工系統(tǒng)，所以在很多情況下，人

們不得不采用真核細胞表達系統(tǒng)，最常用的真核表達宿主是酵

母菌。有時由于被表達基因的特殊性，也可用植物細胞、動物

細胞和昆蟲細胞作為真核表達系統(tǒng)。

5.舉例說明酶異源表達的應用

目前酶的異源表達已經(jīng)得到廣泛應用，已經(jīng)應用到工業(yè)、農(nóng)業(yè)、

醫(yī)藥、環(huán)境和能源等各個領域。

6.酶分子定向進化的主要方法有哪些？

1）易錯PCR（error-pronePCR）

可以用Mn2+來替代Mg2+,使PCR時發(fā)生突變。

2）DNA重組（改組）（DNAshuffling）

重組可以在同一基因的不同突變體之間進行，也可以在不

同物種的同源基因間進行。因此，DNA重組就是把不同來

源的同源基因斷裂成不同大小的片段，然后對這些片段進

行重新組合。

3）隨機引物體外重組

4）交錯延伸法（Staggeredextensionprocess）

7.酶分子的定向進化有哪些方面的應用？

1）提高酶分子的催化活力

提高酶分子的催化能力是對酶分子進行定向進化的最重要目標之一。目前已獲成功的例子比

較多。

2）提高酶的穩(wěn)定性

酶作為生物催化劑，一個最典型的缺點是不穩(wěn)定，因此，提高酶的穩(wěn)定性是酶分子定向進化

改造的另個重要目標。

3）提高底物專一性

通過定向進化改變酶的專一性的例子有：B一半乳糖普酶。腺昔環(huán)化酶，經(jīng)突變后使酶對鳥

甘酸和腺普酸的相對親和力發(fā)生了明顯的變化。

4)改善酶的其它性能

如提高酶在有機相中催化活性和穩(wěn)定性，提高酶的耐酸性和耐堿性，改變酶的最適pH。

8.什么是融合酶？

融合酶又叫雜合酶(hybridenzyme)。雜合酶的概念比較模糊，一般認為，雜合酶是指由

來自兩種以上不同酶分子中的結構單元(單個功能基團、二級結構、結構域或功能域)或是

整個酶分子進行組合或交換，而產(chǎn)生的具有明顯優(yōu)良特性的酶雜合體。

9.融合酶的構建有哪些策略？

產(chǎn)生融合酶的方法有兩種：一種是通過隨機重組的方法，即把來自不同酶的基因片段進行隨

機組合，從這些隨機組合中篩選出具有明顯優(yōu)良特性的酶雜合體。

另一種方法是在對要進行融合的酶的結構與催化功能有比較全面的了解的時候，對酶的融合

提出合理的設計方案，進行有一定目標的融合。

(1)二級結構融合

通過對酶的某些特定功能的二級結構(如底物識別位點螺旋結構)進行替換可以明顯改變酶

的某些特性。

(2)功能域的融合

功能域融合成功的例子比較多。如將一個限制酶的催化中心與一個特異DNA結合結構域融合

在一起可構建具有新的特異性的限制性酶。

(3)整個蛋白的融合

現(xiàn)在能夠大量表達的各種帶專一性標簽的融合蛋白，如MBP融合蛋白，GST

融合蛋白，GFP融合蛋白。

10.融合酶有哪些方面的應用？

融合酶是人們改進現(xiàn)有酶的特性和創(chuàng)造新酶的最重要方法之一。雜合酶的構建和研究不

僅對酶學理論的研究具重要意義，也有重要的實際應用價值。

(1)基礎理論研究方面的應用

確定酶的結構與功能之間的關系

研究蛋白質之間的相互作用

研究酶及其它蛋白在細胞或生物體的定位

(2)實際應用

酶的非催化特性的優(yōu)化(如穩(wěn)定性)

創(chuàng)造新催化活性的酶

構建具雙功能或多功能的酶

在酶部創(chuàng)建別構作用

第七章核酶

1.核酶的發(fā)現(xiàn)具有什么樣的生物學意義？

為揭開生命起源的奧秘提供了有利的證據(jù)。具多種催化功能的核酶的發(fā)現(xiàn)及人工篩選的成功,

支持了在蛋白質產(chǎn)生以前核酶可能參與催化最初的新代謝的設想。

(以下答案來自網(wǎng)上：打破了酶是蛋白質的傳統(tǒng)觀念；在生命起源問題上，為先有核酸提供

了依據(jù)；為治療破壞有害基因，腫瘤等疾病提供手段。)

2.四膜蟲rRNA前前體的剪接是如何進行的？

見《酶工程》守文P163倒數(shù)第三段P164圖7-1

四膜蟲rRNA前體的剪接：在26SrRNA前體的自我剪接作用下，rRNA基因轉錄產(chǎn)物的I型含子

得到剪切和外顯子得到連接。

*3.核酶主要具有那些催化類型？作用底物是什么？

根據(jù)催化反應的種類分為剪接型核酶（包括I型含子和II型含子）和剪切型核酶（包括自身

剪切型和異體剪切型），作用底物為RNA。

4.含子就是核酶嗎？它們有著什么樣的關系？

5.核酶作為一種金屬依賴酶，金屬離子在I型含子中發(fā)揮的作用是什么？

鎂離子等二價金屬離子是核酶催化核心的組分之一，核酶通過堿基配對與其底物接觸并發(fā)生

相互作用，二價陽離子的存在可與底物的活性部位直接作用，參與過渡態(tài)的中間復合物的形

成，形成類似于酶的活性中心。

6.簡述I型含子和II型含子的結構特點。

I型含子的大小為140?4200個核甘酸，一級結構的保守性較低，二級結構呈現(xiàn)出很高的保守

性，含有9個配對螺旋結構的結構特征。

n型含子一級結構間的差異比較大，二級結構基本相似。n型含子有一個保守的二級結構，

由六個螺旋組成，構成六個結構域，這六個結構域可形成發(fā)夾環(huán)。

7.簡述HDV核酶的結構。

肝炎3病毒（HDV）核酶（又稱斧頭狀核酶）大小為L7kb,是一種缺陷型單鏈環(huán)狀RNA病毒。

HDV核酶的三維結構是一個呈雙假結樣、巢狀折疊的立體構型，對其催化活性必不可少的C75

深深地埋在由部兩個螺旋形成的一個活性中心裂口，即核酶的核心部。

8.脫氧核酶具有哪些催化功能？

具水解酶活性，DNA連接酶活性，DNA激酶活性，DNA"戴帽"活性，N-糖基化酶活性，嚇琳

金屬化酶和過氧化酶活性等。

9.SELEX法篩選核酶主要過程是什么？

指數(shù)擴增法系統(tǒng)進化配體（SELEX）篩選核酶首先要求構建一個隨機的多核甘酸單鏈DNA庫，

然后將單鏈庫轉變?yōu)殡p鏈庫，并引入RNA靶序列，再利用鏈親和素柱對雙鏈隨機庫核酸分子

進行洗脫，在一定溫度和pH的特定離子緩沖液洗脫柱子，若有切割反應發(fā)生，被切割的分子

就被洗脫下來，再經(jīng)過PCR放大和分離，可重新回到與起始庫類似的隨機庫，從而完成第一

輪篩選。經(jīng)過10多輪篩選就可以產(chǎn)生具有催化功能的活性分子。

10.舉例說明核酶的應用。

（1）在基礎理論研究方面的應用

為揭開生命起源的奧秘提供了有利的證據(jù)。具多種催化功能的核酶的發(fā)現(xiàn)及人工篩選的成功,

支持了在蛋白質產(chǎn)生以前核酶可能參與催化最初的新代謝的設想。

（2）在醫(yī)學領域的應用

①對抗病毒設計能夠識別和切割病毒RNA或DNA的核酶。

②基因治療設計能夠識別和切割某些致病基因的核酶。

(3)核酶在植物抗病毒方面的應用

已有的研究實例：人工構建錘頭型核酶來抑制煙草花葉病毒。用具有相應特異性的核酶來抑

制馬鈴薯卷葉病毒、水稻矮縮病毒、條紋葉枯病毒、番木瓜環(huán)斑病毒等的復制都有一定的效

果。

第八章非水相酶催化

1,簡述水在酶促反應中的作用

①影響酶分子的空間構象。

②影響酶催化反應的速度。在某些有機介質體系中，酶催化反應的速度與體系中含水量的關

系存在著最適含水量。

③影響酶的立體選擇性和催化反應的平衡點。

2、簡述非水體系中酶催化反應的優(yōu)點

(1)有利于疏水性底物的反應。

(2)可提高酶的熱穩(wěn)定性。非水介質中酶的構象的可塑性降低

(3)能催化在水中不能進行的反應。

(4)可改變反應平衡移動方向。如脂肪酶催化甘油三酯的水解，在水相中有利于水解，在

有機溶劑中有利于合成。

(5)可控制底物專一性。

(6)可防止由水引起的副反應。

(7)可擴大反應pH值的適應性。

(8)酶易于實現(xiàn)固定化。

(9)酶和產(chǎn)物易于分離和回收。

(10)可避免微生物污染。

3,舉例說明如何選擇酶催化有機體中的有機溶劑

選擇有機溶劑的標準主要是有機溶劑的極性(親水性)強弱。有機溶劑的親水性強弱一般用

IgP來表述。P代表某有機溶劑在正辛醇/水體系中的分配系數(shù)。

4、舉例說明非水體系中酶的催化性質與水體系的差異，并解釋原因

1)有機介質中酶活性的變化

在大多數(shù)情況下，酶在有機介質中的活性要比水中的活性低得多。主要原因是：①底物和

產(chǎn)物的擴散出現(xiàn)障礙②有機溶劑會使酶催化反應的活化能增加底物的溶劑化程度越低，基

態(tài)越穩(wěn)定，所以活化能就會增加。③有機溶劑使酶分子活性中心構象的剛性增加，可塑性

降低

2)有機介質中酶穩(wěn)定性的變化

多數(shù)情況下，酶在有機介質的穩(wěn)定性(包括熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性和對變性劑的穩(wěn)定性)提

高。

3)有機介質中酶分子對pH記憶與分子印記

4)有機介質對酶專一性的改變

5)有機介質對酶促反應平衡的影響

6)有機介質酶催化反應的應用

酶在非水介質中，可以大大提高其對一些水不溶底物的催化能力，同時也可以改變酶的底物

特異性。因此酶在有機相的催化反應，受到了廣泛重視，也得到了一定實際應用，特別是在

拆分藥物光學異構體方面。

*5、什么是酶的分子印記？其在改變酶的催化活性上有什么應用價值。

酶分子記憶原來在水相中的一些特性的現(xiàn)象稱為分子印記，其同樣是有機溶劑中酶分子結構

剛性的一種表現(xiàn)。

6、說明如何對酶在有機溶劑中的酶催化活性進行調節(jié)和控制（百度的）

1）酶的選擇

2）底物的選擇和酶的控制

3）有機溶劑的選擇

4）含水量的選擇

5）溫度的控制

6）PH的控制

7、什么是超臨界流體？超臨界流體中酶催化有哪些特點？

溫度及壓力均處于臨界點以上的液體叫超臨界流體（supercriticalfluid,簡稱SCF）

特點：

1）有似液體的高密度、似氣體的高擴散系數(shù)、低粘度和低表面力，因此顯示出較大的溶解

能力和較高傳遞特性，從而大大降低酶反應的傳質阻力，提高酶反應速率；

2）反應底物的溶解性對超臨界的操作條件（如溫度、壓力）特別敏感，通過簡單改變操作條

件或附加其他設備，就可達到反應物和底物分離的目的；

3）超臨界流體可以與其他氣體混溶，得到任意濃度，使得反應易于控制；

4）很多超臨界流體溫度小于100℃,不會使產(chǎn)物熱分解，溫和的溫度適合酶反應；

5）因為超臨界流體在常壓下是氣體，所以不存在反應產(chǎn)物中溶劑殘留的問題

第九章酶反應器和酶傳感器

1、酶反應器與化學反應器和發(fā)酵罐有何區(qū)別？

酶反應器是以酶或固定化酶為生物催化劑，進行酶促反應的裝置。酶反應器不需要考慮催化

劑自身的再生問題，而細胞反應器就需要考慮細胞自身的繁殖問題。

2、試比較各類型酶反應器的優(yōu)缺點。

?6-1京用的■反應器類型

反應H類型適用的掾作方式適用的■特點

分批式由反應■.援笄U和保溫裝置01成.設著筒

援件■式反應器漉加分批式?.掾作容馬.■勺底物稷合較均勾.傳質用力

固定化?

連續(xù)式較小.反應比較完全,反應條件容易調節(jié)控制

設備尚??!?作方便.6位體根反應床的固定

填充床式反應器連續(xù)式因定化?化?密度大?可以提高?催化反應的速度.在

工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用

分批式流化床反應II混合均勻.傳質和傳雋效果好，

漉化床反應器漉加分批式團定化,溫度和pH的調節(jié)控制比較容易,不易堵塞,對

連續(xù)式黠度較大反應液也可進行催化反應

分批式鼓泡式反應的結構簡單,操作容易.打切力

游育陶II

鼓泡式反應器漉加分批式小,催合效果好.傳質、傳給效率高.適合于有氣

國定化?

連續(xù)式體參與的反應

事反應A結構K瘦,集反應與分離于一體,利

臏反應H連續(xù)式于連續(xù)化生產(chǎn),但是容易發(fā)生津電極化而引起

國定化?

■孔用霖,清洗比較困爆

通人高壓41射蒸汽，實現(xiàn)?與底物的混合，進

■R射式反應器連續(xù)式行高次短時催化反應,適用于某些耐高溫*的

反應

3、在酶的應用中，如何選擇適宜的酶反應器？

1)根據(jù)酶的應用形式選擇酶反應器

如游離酶多采用攪拌灌式反應器，而固定化酶多采用填充床或流化床反應器。如有氣體參與

反應，可選用鼓泡式反應器。

2)根據(jù)酶反應動力學性質選擇酶反應器

主要考慮底物與酶的混合程度、高底物濃度是否會產(chǎn)生抑制現(xiàn)象、所要達到的底物轉化效率

和產(chǎn)物是否會對反應產(chǎn)生抑制作用。如有抑制可采用流加式反應器。

3)根據(jù)底物和產(chǎn)物的理化性質選擇酶反應器

要考慮的理化性質主要有分子大小、溶解度、粘度、揮發(fā)性等。

4)根據(jù)反應操作要求選擇反應器

5)根據(jù)酶的穩(wěn)定性選擇反應器

4、簡述酶反應器設計的一般步驟

1)確定酶反應器的類型

2)確定酶反應器的制造材料

3)進行熱量衡算

4)進行物料衡算

5、簡述傳感器，生物傳感器的酶傳感器的基本概念

傳感器是指能感受規(guī)定的被測量并按照一定的規(guī)律轉換成可用輸出信號的器件或裝置

生物傳感器是一類特殊的傳感器，是指以生物材料為敏感元件的傳感器

酶傳感器是以酶為感受元件的傳感器

6、酶傳感器有哪些類型

1)酶電極

2)離子敏場效應晶體管酶傳感器

3)熱敏電阻酶傳感器

4)光纖酶傳感器

5)聲波酶傳感器

7、電流型酶電極與電位型酶電極有那些不同？

結構相似但使用的基礎電極不同；

電流型酶電極是指通過酶促反應底物或產(chǎn)物在電極上發(fā)生氧化還原或還原電解反應所產(chǎn)生的

電流信號，從而檢測物質濃度，在一定條件下，測得的電流信號與被測物濃度呈線性關系；

電位型酶電極是將酶促反應所引起的物質量的變化轉化為電位信號輸出，從而測定物質濃度

的一種酶電極傳感器，電位輸出信號的強弱與酶催化反應底物濃度的對數(shù)呈線性關系。

8、簡述各種酶傳感器的基本檢測原理

電流型酶電極是指通過酶促反應底物或產(chǎn)物在電極上發(fā)生氧化還原或還原電解反應所產(chǎn)生的

電流信號，從而檢測物質濃度。

電位型酶電極是將酶促反應所引起的物質量的變化轉化為電位信號輸出，從而測定物質濃度

離子敏場效應晶體管酶傳感器將酶膜固定在離子敏