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文檔簡介
上次流式細(xì)胞術(shù)講座內(nèi)容(概述)流式細(xì)胞術(shù)的一般介紹流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢測和科研中的應(yīng)用流式細(xì)胞儀可檢測的細(xì)胞參數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒性程度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量細(xì)胞功能細(xì)胞表面蛋白抗原細(xì)胞胞漿內(nèi)蛋白性抗原細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞增殖細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)(immunolabellingtechnique):是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑,標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測蛋白質(zhì)分子:免疫熒光標(biāo)記技術(shù)
FACSCalibur流式細(xì)胞儀能夠檢測的熒光(Fluorescence)信號FL1(第一熒光)-FITC(異硫氰酸熒光素)FL2(第二熒光)-PE(藻紅蛋白)FL3(第三熒光)-PerCP,PeCy5等PL4(第四熒光)-APC(藻青蛋白)雙色直接染色流式細(xì)胞術(shù)免疫熒光標(biāo)記的應(yīng)用檢測細(xì)胞表面蛋白抗原檢測細(xì)胞胞漿內(nèi)蛋白性抗原檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子優(yōu)勢:在同一細(xì)胞上同時(shí)檢測多種標(biāo)志血液系統(tǒng)各型細(xì)胞免疫標(biāo)志CD34+抗原在早期造血祖細(xì)胞內(nèi)呈高水平表達(dá),隨著細(xì)胞成熟其表達(dá)呈進(jìn)化性下降,繼而消失。CD38抗原是造血干細(xì)胞向多系定向分化的標(biāo)志之一,并隨一定的分化過程表達(dá)上調(diào)最近發(fā)現(xiàn)CD90(Thy-1)是比CD34更早的干、祖細(xì)胞標(biāo)志結(jié)合多種分化抗原的表達(dá)可以作為造血細(xì)胞不同發(fā)育階段的標(biāo)志。如CD34+、CD33+細(xì)胞群為多能干細(xì)胞向髓系定向的標(biāo)志;CD34+、CD19+多為多能干細(xì)胞向B系定向的祖細(xì)胞。CD34+、TdT+、CD10+、CD7+則被認(rèn)為是向T系定向的祖細(xì)胞。造祖/干細(xì)胞
T細(xì)胞及其亞群T祖細(xì)胞(pro-T)的表型為CD34+、TdT+、CD10+、CD7+未成熟T細(xì)胞標(biāo)志CD3、CD4和CD8。在T細(xì)胞發(fā)育過程中,CD7是最早出現(xiàn)的T細(xì)胞標(biāo)志,且貫穿表達(dá)在整個(gè)T細(xì)胞分化發(fā)育過程中。胸腺細(xì)胞要分化發(fā)育為有功能的成熟T細(xì)胞,細(xì)胞表面標(biāo)志需經(jīng)歷一定的變化過程。T細(xì)胞標(biāo)志進(jìn)入外周淋巴器官和血液,執(zhí)行免疫功能CD7+、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR-(即CD4、CD8雙陰性)CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+(即CD4、CD8雙陽性)CD7+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8-、TCR+CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8+、TCR+CD3+、CD4+、CD8-:T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞(Th/Ti),占T細(xì)胞總數(shù)的60%~70%;CD3+、CD4-、CD8+:T抑制/殺傷細(xì)胞(Ts/Tc),20%~30%;CD3+CD4+CD8+:1%~3%;CD3+CD4-CD8-:1%~10%。前三種表型細(xì)胞的TCR主要為TCRαβ,而CD4-CD8-T細(xì)胞主要表達(dá)TCRγδ,他們都執(zhí)行細(xì)胞免疫功能。正常外周血中通常存在的T細(xì)胞亞群CD2是綿羊紅細(xì)胞受體和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-2(LFA-2),表達(dá)于人95%T細(xì)胞、50%~70%胸腺細(xì)胞和大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL/NK)的表面。CD3是T細(xì)胞表面抗原,表達(dá)于成熟胸腺細(xì)胞、靜息和激活的的外周血T細(xì)胞,是鑒定T細(xì)胞的重要標(biāo)志,其胞漿和膜CD3是早期和普通型T細(xì)胞白血病的主要分型標(biāo)記。CD5、CD7是T細(xì)胞白血病較特異的標(biāo)記,也是髓系白血病時(shí)最常見的伴隨標(biāo)記。CD45則是白細(xì)胞的共同標(biāo)記抗體CD25和CD28主要分布于活化T淋巴細(xì)胞表面,為活化T淋巴細(xì)胞標(biāo)志。胸腺細(xì)胞、靜止T細(xì)胞、靜止B細(xì)胞以及NK細(xì)胞表面無表達(dá)。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和II類人類白細(xì)胞抗原(HLA-DR)的陽性表達(dá)對早期T細(xì)胞白血病的診斷有重要價(jià)值。80%~90%和95%以上的NK細(xì)胞表達(dá)CD16和CD56。用CD3-CD16+CD56+可定義NK細(xì)胞。B細(xì)胞標(biāo)記B細(xì)胞B細(xì)胞的分化主要分為B祖細(xì)胞、前B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞、成熟B細(xì)胞、活化B細(xì)胞和漿細(xì)胞6個(gè)階段。(1)B祖細(xì)胞(pro-B):此期最早表達(dá)的B細(xì)胞特異性抗原是CD19,同時(shí)表達(dá)CD34、細(xì)胞核TdT、HLA-DR、CD40、CyCD22。(2)前B細(xì)胞(pre-B):CD34和TdT消失,出現(xiàn)CyCD79、CD10、CD20、CD9、CDw78、CD74,cμ+(胞漿IgM重鏈)。
(3)未成熟(早期)B細(xì)胞(immatureBcell):CD9、CD10消失,出現(xiàn)SIgM、CD22。CD20、CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表達(dá)增加。其他新的B抗原CD37、CD2、CDw75、CDw76相繼出現(xiàn)。(4)成熟B細(xì)胞(matureBcell):SIgM和IgD同時(shí)表達(dá),并出現(xiàn)CR、FcR和絲裂原受體,上述B細(xì)胞抗原繼續(xù)存在。
(5)活化B細(xì)胞(activatedBcell):成熟B細(xì)胞被抗原或絲裂原刺激后,成為活化B細(xì)胞,繼之增生和分化。在此過程伴隨表達(dá)B細(xì)胞激活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相關(guān)抗原如CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、CD71、CD38等。膜結(jié)合型Ig逐漸減少,分泌型Ig逐漸增加。(6)漿細(xì)胞(plasmacell):激活B細(xì)胞進(jìn)一步分化成為產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞,這時(shí)獲得PC-1、PCA-1和CD138漿細(xì)胞特異抗原,CD85表達(dá)增加,CD38抗原再出現(xiàn)。而SIg和上述B抗原消失。CD79仍可存在于胞質(zhì)中。B細(xì)胞上的CD抗原分為:①B細(xì)胞限制性(特異性)抗原:CD19、CD20、CD21、CD22、CD77和CD79,
它們的表達(dá)只限于B細(xì)胞上,在鑒別細(xì)胞系上是十分重要的標(biāo)志。②B細(xì)胞相關(guān)性抗原:CD5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。B細(xì)胞表面的受體SIg,是B細(xì)胞特異性識別抗原的受體,也是B細(xì)胞重要的特征標(biāo)志。CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B細(xì)胞白血病和淋巴瘤最常用的標(biāo)記抗體。對中國人而言,CD19是特異性和敏感性最高的。CD19是一種早期的、譜系特異的泛B細(xì)胞表面抗原,從最早期B細(xì)胞前體細(xì)胞階段即表達(dá),持續(xù)存在直至B細(xì)胞終末階段外周血T細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板表面不表達(dá)CD19。髓系細(xì)胞標(biāo)記包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、CD61、CD63和CD117等。這些免疫標(biāo)記種類繁雜,缺乏特異性和敏感性(與淋巴細(xì)胞標(biāo)記抗體相比)。3.髓系標(biāo)記從髓系祖細(xì)胞→終末分化的成熟細(xì)胞(粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞)間各階段細(xì)胞特征性標(biāo)志還不十分清楚。根據(jù)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上的髓系抗原表達(dá)試將其大致分為七種類型:(1)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上都有較強(qiáng)表達(dá)的抗原有:CD13、CDw17、CD32、CD87、CD88、CD89、CDw92、CD93、CD156、CD157、CD163。其中CD13在原粒細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)比膜上早,在AML診斷上十分重要。(2)以粒細(xì)胞為主,但也存在于單核細(xì)胞的抗原有:CD15和CD65。CD65是特異性髓系抗原,強(qiáng)表達(dá)在成熟粒細(xì)胞,弱表達(dá)在單核細(xì)胞上。
(3)基本表達(dá)在粒細(xì)胞上的抗原有:CD16b和CD66。
(4)以單核細(xì)胞為主,但也表達(dá)在粒細(xì)胞的抗原有:CD14和CD33。CD14主要強(qiáng)表達(dá)在單核-巨噬細(xì)胞,弱表達(dá)在粒細(xì)胞上。CD33抗原分布只限于造血系統(tǒng)內(nèi),表達(dá)在髓系祖細(xì)胞CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相應(yīng)的白血病細(xì)胞上。(5)基本只表達(dá)在單核細(xì)胞上的抗原有:CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是目前發(fā)現(xiàn)可靠的檢測造血系統(tǒng)內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的特異標(biāo)志。
(6)造血干、祖細(xì)胞抗原有:CD34和CD90。CD34除表達(dá)在早期造血干、祖細(xì)胞外,還表達(dá)在約40%的AML和60%的ALL上(7)其他髓系相關(guān)抗原:這些抗原主要存在于其他系細(xì)胞上,但在某些髓系細(xì)胞上也有表達(dá),如:CD4、CD7、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、CD38等。
巨核細(xì)胞系
在巨核細(xì)胞系發(fā)育過程中依次出現(xiàn)PPO、CD41a(Ⅱb/Ⅲa)、CD41b(Ⅱb)和CD61(Ⅲa)、CD42(Ⅰb)。還可表達(dá)CD36(強(qiáng))。正常情況下血小板處于靜止?fàn)顟B(tài)。目前研制出的抗血小板單抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD61,主要都針對靜止的血小板。當(dāng)血小板被激活時(shí),血小板中顆粒內(nèi)容物釋放,整合到活化的血小板質(zhì)膜內(nèi),成為一些激活抗原,如CD62(P-選擇素)、CD63及CD107a和CD107b。
紅細(xì)胞系
血型糖蛋白A、H。
流式細(xì)胞術(shù)免疫熒光標(biāo)記抗體的選擇有特異性標(biāo)志:選擇一種即可,如CD3標(biāo)記總T細(xì)胞;沒有明顯的特異性標(biāo)志:可以采用不同抗體組合,標(biāo)記某種細(xì)胞。如Treg細(xì)胞公認(rèn)的標(biāo)志為CD4+CD25+FoxP3+.表面分子標(biāo)記可以與胞內(nèi)分子標(biāo)記相結(jié)合;免疫熒光標(biāo)記也可以與其它的標(biāo)記方法相結(jié)合:如與CFSE進(jìn)行不同細(xì)胞亞群增殖分析。
流式細(xì)胞術(shù)表面分子免疫標(biāo)記操作舉例淋巴細(xì)胞亞群檢測操作程序
一、實(shí)驗(yàn)原理:人的淋巴細(xì)胞根據(jù)其生物功能和細(xì)胞表面抗原的表達(dá)可分為三大類:T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK自然殺傷細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞表達(dá)CD3;B淋巴細(xì)胞表達(dá)CD19;NK自然殺傷細(xì)胞表達(dá)CD56或CD16,并且不表達(dá)CD3。利用各種單克隆抗體與淋巴細(xì)胞表面抗原結(jié)合,再配多色熒光染料,即可以把淋巴細(xì)胞區(qū)分為各種亞型。進(jìn)面得到各亞群的比例。二、主要試劑:MultiTESTIMKKit(美國BDBiosciences公司;CAT:340503),其中包括:1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC3、FACSLysingSolution三、實(shí)驗(yàn)操作:1、標(biāo)本采集:使用EDTA-K2抗凝真空采血管,抽取靜脈血2ml。2、染色和固定細(xì)胞:標(biāo)本管編號A,取兩只流式專用管A1、A2。A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC20uL;A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC20Ul。A1、A2管中分別再加入
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