第13章 細(xì) 胞 凋 亡 技 術(shù)

第13章細(xì)胞凋亡技術(shù)細(xì)胞凋亡〔Apoptosis〕又稱程序性細(xì)胞死亡〔Programmedcelldeath簡(jiǎn)稱PCD〕，是細(xì)胞衰老自然死亡的主要方式之一，在機(jī)體中承當(dāng)著重要的調(diào)控作用。它不僅在維持細(xì)胞群體數(shù)量的穩(wěn)定、胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)的克隆選擇方面，而且在腫瘤發(fā)生、開(kāi)展、抗腫瘤藥物的治療等方面均具有十分重要的作用。細(xì)胞凋亡是由基因編程控制的細(xì)胞主動(dòng)參與的自殺過(guò)程，是一種生理性調(diào)節(jié)機(jī)制，與細(xì)胞壞死的死亡機(jī)制是完全不同的，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的癌和抑癌基因有兩類，一類是促進(jìn)凋亡的如C-myc、野生型P53、Fas和Fasl、bcl-xs、bax、ICE、bak、bad等；另一類是抗細(xì)胞凋亡的基因，如突變型P53、bcl家庭的bcl-2、bcl-XL及病毒來(lái)源的BHRF1等，這兩類基因與調(diào)控細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，在腫瘤研究中，如果促凋亡基因活化和高表達(dá)，將會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和惡化，用藥后受抑，說(shuō)明藥物療效好，預(yù)后佳，腫瘤發(fā)生與開(kāi)展受抑制。反之，假設(shè)促凋亡基因受抑，腫瘤發(fā)生和開(kāi)展惡化。如果抗凋亡的基因活化和高表達(dá)將促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與開(kāi)展，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥、預(yù)后不良；反之腫瘤的發(fā)生與開(kāi)展受抑，對(duì)放/化療敏感，療效好。由此可見(jiàn)，研究細(xì)胞凋亡不僅對(duì)研究組織和細(xì)胞的分化有理論研究?jī)r(jià)值，而且對(duì)腫瘤的發(fā)生和開(kāi)展及臨床治療均有指導(dǎo)意義。一、細(xì)胞凋亡的特征細(xì)胞凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活，染色質(zhì)DNA被有規(guī)律地切成整數(shù)倍的核小體片斷，凝膠電泳呈梯形圖像，電鏡下可見(jiàn)有形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞鄒縮，胞膜完整，胞漿致密，染色質(zhì)濃縮成新月形并斷裂，有核膜包繞含核碎片的凋亡小體形成。經(jīng)DAPI即4-6-二脒基二苯基吲哚(4.6-diamido-2-phenylindolehyodrochloride)熒光染色，可見(jiàn)有細(xì)胞固縮，核斷裂后形成大小不等的塊狀或顆粒狀的熒光碎片。由于核斷裂后形成的小片斷可透過(guò)膜而喪失，僅剩下大片斷在流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)可測(cè)出，稱“G1〞期的AP峰〔即凋亡峰〕。細(xì)胞死亡包括壞死和凋亡兩種形式，兩者區(qū)別如表13-1所示。表13-1細(xì)胞壞死與凋亡的區(qū)別凋亡(Apoptosis)壞死(Necrosis)〔1〕、定義：一種與遺傳機(jī)制有關(guān)的(即由基因調(diào)控的)主動(dòng)的、自發(fā)死亡的方式，無(wú)炎癥反響。外在的致?lián)p傷因素作用到達(dá)一定強(qiáng)度，持續(xù)一定時(shí)間后所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡〔被動(dòng)〕，有炎癥反響?！?〕、形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞核：核濃縮、碎裂(染色質(zhì)濃縮→有規(guī)律性、斷裂成核碎片)，有新月形凋亡小體。細(xì)胞器：完整細(xì)胞膜：完好細(xì)胞體積：細(xì)胞濃縮在組織中：常呈單個(gè)細(xì)胞發(fā)生核溶解(無(wú)規(guī)律的染色質(zhì)團(tuán)塊→溶解)無(wú)規(guī)律性。崩解尚失去完整性細(xì)胞腫脹常成群細(xì)胞發(fā)生〔3〕、生物化學(xué)檢測(cè)核DNA有規(guī)律斷裂50～300kb/或180bp左右的片斷凝膠電泳：呈梯形條帶(ladder)DAPI螢光染色，片狀、顆粒狀核熒光。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：可見(jiàn)亞G1峰(AP峰)核基因表達(dá)：必須DNA酶活性：必須蛋白激酶活性：必須細(xì)胞器環(huán)境：Na+/K+泵功能完好DNA無(wú)規(guī)律地?cái)嗔褩l帶不清〔smears〕無(wú)顆?；蚱瑺詈藷晒獬霈F(xiàn)無(wú)此峰——————功能喪失二、細(xì)胞凋亡試驗(yàn)常用的方法我們?cè)没熕幬锛捌淇拱┲兴帉?duì)腫瘤細(xì)胞如HL-60，K562和肝癌細(xì)胞系(SMMC-7721)進(jìn)行了細(xì)胞凋亡的研究，我們利用流式細(xì)胞儀測(cè)AP峰，熒光法測(cè)核斷裂熒光碎片，凝膠電泳測(cè)梯形條帶，電鏡法觀察凋亡小體的存在，為了掌握好用藥的劑量和作用時(shí)間，又先用MTT法測(cè)試藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，探索IC50以及藥物的劑量依賴性和作用時(shí)間的依賴性，其試驗(yàn)方法如下：(一)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)的MTT法(1)用RPMI1640全培將腫瘤細(xì)胞調(diào)整至2×108/L，在96孔板中每孔參加100ul細(xì)胞懸液于37℃5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。(2)次日每孔參加不同濃度的藥物100mg/L作為試驗(yàn)組，設(shè)加完全培養(yǎng)基不加藥物的陰性對(duì)照組，并用功能明確的藥物為陽(yáng)性對(duì)照和0.5%的乙醇為溶劑對(duì)照，每組均設(shè)4～6個(gè)復(fù)孔〔平行孔〕、37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。(3)培養(yǎng)至12h、24h、48h，實(shí)驗(yàn)終止前4～6小時(shí)參加10ulMTT〔5g/L〕，培養(yǎng)4～6小時(shí)后，陰性對(duì)照孔中已形成明顯的藍(lán)紫色甲顆粒結(jié)晶時(shí)加100μl/孔SDS-HCL終止反響，于37℃存放過(guò)夜。(4)用酶標(biāo)儀在A570波長(zhǎng)下測(cè)吸光度A值，按下式計(jì)算抑制率。抑制率〔%〕=〔1-試驗(yàn)組平均A值/陰性對(duì)照組平均A值〕×100%。(二)熒光法(1)選用上述最正確濃度作用于腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后，收獲細(xì)胞用PBS洗2～3次后用0.4%多聚甲醛(用pH7.4PBS配)室溫下固定30分鐘。(2)棄去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton、X-100作用4分鐘參加適量的0.5mg/LDAPI熒光染色60分鐘，用PBS沖洗3次，取10ul滴片枯燥后于熒光顯微鏡示檢斷裂的顆粒和片狀熒光(見(jiàn)書(shū)后照片)。凋亡細(xì)胞的核熒光×400(三)DNA瓊脂糖凝膠電泳法1.DNA提取(1)用大方瓶培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，每瓶10ml，細(xì)胞濃度為3×108/ml每個(gè)藥物濃度、作用時(shí)間均設(shè)2瓶，共分三個(gè)時(shí)間段，四個(gè)藥物濃度，共培養(yǎng)26瓶細(xì)胞〔24瓶試驗(yàn)組，2瓶陰性對(duì)照組〕。〔2〕分別于細(xì)胞中參加不同濃度的藥物，于37℃5%CO2中分別培養(yǎng)12、24、48小時(shí)收獲細(xì)胞，用PBS洗2～3次?！?〕于-20℃將細(xì)胞冷處理10分鐘后將細(xì)胞收集至離心管中，加1ml細(xì)胞裂解液〔10mmol/LTris-HClpH8.0、1mmol/LEDTA、10mmol/LNaCl、1%SDS〕再加蛋白酶K〔終濃度1g/L〕輕輕振搖使懸液混勻，呈粘糊狀，50℃過(guò)夜。〔4〕冷卻后參加等體積的飽和酚溶液，混合后10000g離心10分鐘，小心吸出上層水相，移至另一離心管中，再參加等體積飽和酚溶液重復(fù)抽提一次，直到無(wú)蛋白為止?！?〕吸上清參加氯仿：異戊醇〔24:1〕按上述方法再抽提一次?！?〕吸取水相層參加1/10體積的3mol/L醋酸鈉溶液，混勻。〔7〕再參加2.5倍體積冷無(wú)水乙醇，混合置-20℃處理30分鐘后，10000g離心10分鐘，沉淀局部為提取的DNA，棄去無(wú)水乙醇后用70%乙醇漂洗兩次，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干乙醇?！?〕參加200ulTE緩沖液〔1mmol/LEDTA40mmol/LTrisHClpH7.8〕溶解DNA，再參加25ul的RNA酶〔10g/L〕放置37℃作用30分鐘，置4℃冰箱保存。2、瓊脂糖凝膠電泳〔1〕用TBE〔1mMEDTA、PH8.0、45mM/LTris-硼酸〕緩沖液配制1.8%瓊脂糖凝膠。在微波爐內(nèi)煮沸至瓊脂糖溶解，待冷卻至60℃時(shí)，參加溴化乙錠〔10mg/ml〕使其終濃度為0.5mg/ml,混勻后灌膠?！?〕待膠凝固后放入含TBE電泳液的電泳槽內(nèi)，使TBE液蓋過(guò)凝膠。〔3〕取10～15μl提取的各組DNA樣品液與上樣緩沖液〔含0.25%溴酚蘭，4%蔗糖〕按4:1比例混勻后點(diǎn)樣。〔4〕60V電泳1小時(shí)，用紫外射透射儀觀察梯形條帶，并攝影〔見(jiàn)書(shū)后照片〕。凋亡細(xì)胞核酸電泳的梯形條帶(四)透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察法(1)收集藥物作用后最正確凋亡時(shí)期的凋亡腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞總量大于106細(xì)胞，用PBS洗兩遍后用3%戊二醛固定1小時(shí)，PBS洗兩次，再用1%鋨酸固定1小時(shí)，丙酮酸梯度脫水。(2)細(xì)胞用樹(shù)脂包埋，并進(jìn)行超薄切片，用醋酸鈉-枸椽酸鉛染色，透射電鏡下觀察凋亡的細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)有染色質(zhì)濃集，不均勻分布，靠核周邊形成有核膜包裹斷裂的核碎片，呈新月體即凋亡小體(Apoptoticbodies)，并選擇典型切片圖象攝影(見(jiàn)書(shū)后照片)。凋亡細(xì)胞核內(nèi)形成的早期凋亡小體〔染色質(zhì)邊聚〕×12000凋亡細(xì)胞核內(nèi)形成的星形凋亡小體×12000凋亡細(xì)胞核內(nèi)形成的晚期凋亡小體×12000(五)流式細(xì)胞儀檢測(cè)法1、原理處于增殖周期中的細(xì)胞，根據(jù)其所處不同周期時(shí)相(G0/G1SG2/M期)其DNA含量分布在2n～4n之間，發(fā)生凋亡的細(xì)胞內(nèi)與核內(nèi)DNA裂解成許多小片斷，用細(xì)胞膜通透法可使小分子量的DNA片斷穿過(guò)胞膜而喪失，僅剩下大片斷DNA，這些失去局部DNA的細(xì)胞可形成一個(gè)DNA含量小于2n的分布區(qū)，稱“亞G1峰〞即AP峰〔即凋亡峰〕。圖13-1流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞的凋亡峰圖2、特點(diǎn)〔1〕經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，僅需單一染色；〔2〕可判斷凋亡細(xì)胞發(fā)生于哪一周期；〔3〕可定量測(cè)定凋亡率，結(jié)果客觀可信；〔4〕用同樣本可同時(shí)進(jìn)行“亞G1峰〞及DNA凝膠電泳。3、方法步驟〔1〕收獲不同劑量藥物作用于各不同時(shí)期的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)應(yīng)大于106細(xì)胞，用PBS洗2次，參加70%酒精固定4℃存放?！?〕染色前用PBS離心沉淀去除固定液，并用PBS洗1～2次，參加200ulRNaseA,37℃水浴30分鐘?！?〕每毫升細(xì)胞懸液中參加碘化丙錠〔PI〕染色液100ul混勻，至4℃避光30分鐘，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析，低于G1期DNA含量細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，測(cè)定“亞G1峰〞〔即AP峰值〕和細(xì)胞凋亡率。除上述常用的方法外，還可采用ELISA法。其凋亡的斷裂核可被抗組蛋白抗體及抗-DNA抗體混合物反響后形成雙抗體“夾心〞結(jié)構(gòu)，再經(jīng)酶顯色也可判斷?！?〕末端轉(zhuǎn)移的酶標(biāo)記技術(shù)，利用核裂解碎片上含有3'-OH末端，在末端轉(zhuǎn)移酶〔或DNA多聚酶〕作用下參加已標(biāo)記的核苷酸〔或核苷酸混合物〕，在3'-OH末端上合成一段含標(biāo)記的尾巴，再經(jīng)過(guò)酶顯色或用熒光抗體顯示出來(lái)。三、BCL-2凋亡基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)(一)原理細(xì)胞凋亡是一個(gè)受基因調(diào)控的主動(dòng)過(guò)程，bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的原癌基因，在正常細(xì)胞的激活和發(fā)育過(guò)程中都有表達(dá)，但在發(fā)育成熟的細(xì)胞中，其表達(dá)降低，在低分化或癌變的細(xì)胞中，bcl-2高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、開(kāi)展相關(guān)，bcl-2過(guò)量表達(dá)常導(dǎo)致對(duì)化療藥物的耐藥性而阻止細(xì)胞凋亡，影響治療效果，一旦細(xì)胞發(fā)生凋亡，其bcl-2表達(dá)降低，甚至完全消失。bcl-2家族由bcl-2、bcl-x、bax、mcL-1和A1組成，現(xiàn)認(rèn)為bcl-2基因是凋亡抑制基因，其易位和高表達(dá)與腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。因此，進(jìn)行bcl-2基因表達(dá)的檢測(cè)有兩種，一種是用抗bcl-2蛋白抗體的流式細(xì)胞儀測(cè)定法，檢測(cè)細(xì)胞漿中的bcl-2蛋白量；另一種是采用RT-PCR法測(cè)細(xì)胞中bcl-2mRNA的表達(dá)。(二)方法1、bcl-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀和間接免疫熒光法測(cè)定細(xì)胞中bcl-2蛋白量的，具體方法為：(1)收集藥物不同劑量、不同作用時(shí)間的凋亡腫瘤細(xì)胞，用含2%小牛血清的PBS洗2次。(2)參加2%多聚甲醛(用PBS配制)室溫固定20分鐘，再用PBS配制的Staing緩沖液(2%滅活的人AB血清，0.1%NaN3)洗滌。(3)1500r/min離心5分鐘，棄上清置-20℃存放過(guò)夜。(4)在凍存的細(xì)胞內(nèi)參加1mlPBS配制的TB穿透夜(0.2%Triton、X-100,0.1%小牛血清)放置5分鐘，用Staing緩沖液洗一次后，加2%滅活的人AB血清1ml，37℃放10分鐘。(5)參加bcl-2多抗(免抗人)工作液40ul，4℃孵育30分鐘，對(duì)照組不加多抗。隨后用PBS洗3次，5分鐘1次。(6)參加FITC熒光標(biāo)記的二抗(羊抗免)工作液40ml，4℃孵育30分鐘后，用PBS洗3次，用流式細(xì)胞檢測(cè)熒光強(qiáng)度(MFI)的變化，計(jì)算bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率和bcl-2蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度。2、RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞bcl-2mRNA的表達(dá)(1)總RNA提取。為了獲得高質(zhì)量的真核細(xì)胞mRNA，必須使用RNA酶抑制劑。操作過(guò)程中應(yīng)防止RNA酶污染器材和試劑，因此所有玻璃、塑料器材先用0.1%DEPC水溶液浸泡12小時(shí)，然后用無(wú)菌的新鮮蒸餾水淋洗數(shù)次，塑料器材應(yīng)采用高壓蒸氣滅菌。玻璃器材應(yīng)于180℃干烤4～6小時(shí)，所有溶液配制用水均用已滅菌的新鮮蒸餾水配制，所用試劑要用新開(kāi)封的試劑，或無(wú)菌分裝至已處理的容器中，操作時(shí)應(yīng)戴60Co輻照的一次性手套，并勤換，以防止環(huán)境中或操作時(shí)的RNA酶污染。提取總RNA，采用異硫氰酸胍一步提取法即可。方法如下：①收集藥物處理和對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞，用PBS洗2次，冷藏5分鐘。②參加變性液SolutionD1ml(4mol/L異硫氰酸鈉，25mmol/L檸檬酸鈉，0.1mol/L巰基乙醇，0.5%十二烷基肌氨酸鈉)。③用4號(hào)針頭抽打混勻，再參加0.1ml的3mol/L乙酸鈉(pH4.2)充分混勻，加80%水飽和酚(pH5.6)1ml，氯仿:異戊醇(24:1)，0.2ml混勻后置冰上15分鐘。④于4℃12000r/min離心5分鐘，取上清移入另一潔凈的塑料離心管中，加2.5倍體積的無(wú)水乙醇〔-20℃預(yù)冷〕于-20℃過(guò)夜。⑤次日以4℃12000rmin離心30分鐘棄上清，用70%預(yù)冷乙醇洗兩次，枯燥10分鐘，加100ulDEPC水溶解RNA，再參加300ul，SolutionD液混合，再加2.5倍乙醇，-20℃放2h。⑥用70%預(yù)冷乙醇洗兩次，加DEPC水溶解，紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260，OD280值。當(dāng)OD260/OD280在1.8～２時(shí)，RNA純度較好。為了證明所提RNA是否降解，可采用RNA甲醛變性電泳。(2)RT-PCR①合成cDNA第一鏈各組取5μg至RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反響體系共20ul。5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5ul；DTT1ul；dNTP(200μM)2ul；RNasin1.5ul；OligodT2ul；m-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ul)2ul；RNA樣本5μg；DEPC水補(bǔ)充加至20ul〔即6.5ul〕上述組分充分混合后，先在室溫作用10分鐘，后在42℃反響1h，經(jīng)95℃10分鐘，立即至冰浴冷卻至4℃，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即cDNA第一鏈于-20℃凍存?zhèn)溆谩＂赑CR反響擴(kuò)增Cdna。設(shè)計(jì)bcl-2的引物序列如下：P1上鏈：5'-GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG-3'P2下鏈：5'-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3'外參照β-actin的引物序列如下：P3上鏈：5'-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3'P4下鏈：5'-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3'擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為459bp，339bp。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板分別與bcl-2引物，β-action引物混合，反響體系共有50ul。ddH2O32.5ul；10×buffer5ul；MgCl25ul；dNTP(200μmol/L)1ul；p1/p30.5ul；P2/P40.5ul；TaqDNA多聚酶0.5ul；cDNA樣品〔逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物〕5ul；擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性7分鐘，設(shè)計(jì)PCR循環(huán)程序，94℃變性60秒，55℃復(fù)性50秒，72℃延伸60秒，共30個(gè)循環(huán)周期，然后72℃延伸5分鐘，4℃保存?zhèn)溆?，并供凝膠電泳〔方法同前〕。每組取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8ul在TBE緩沖液中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(2%)。電壓80V，電泳40分鐘，紫外透射儀下觀察電泳條帶，其熒光帶亮度可隨凋亡的程度而有變化，證明bcl-2基因表達(dá)與不同劑量化療藥物作用不同時(shí)間，bcl-2基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡呈劑量、時(shí)間依賴性(見(jiàn)書(shū)后照片)。此法只能從電泳條帶熒光亮度進(jìn)行目測(cè)不夠準(zhǔn)確，最好采用熒光PCR定量?jī)x更加準(zhǔn)確可靠。四、細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制細(xì)胞凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的生理和病理過(guò)程，機(jī)體內(nèi)外多種因素可影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生，如Ca++、Mg++、糖皮質(zhì)激素能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Zn++能顯著抑制Ca++和糖皮質(zhì)激素這種誘導(dǎo)凋亡的作用，鈣離子通道劑A23187可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但又可被內(nèi)切酶阻斷劑玫紅三羧酸阻斷。此外，類固醇、細(xì)胞毒性物質(zhì)、秋水仙堿均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前發(fā)現(xiàn)某些因素或因子可以特異性地誘導(dǎo)某種或某類細(xì)胞發(fā)生凋亡，某些對(duì)生長(zhǎng)因子依賴性細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)因子耗盡或撤除時(shí)那么發(fā)生凋亡；某些基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯的促進(jìn)或抑制作用。1、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素或因子誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的因素或因子很多，有些具有普遍性作用，如各種因素(射線輻射、熱休克和紫外線照射等)導(dǎo)致的DNA損傷，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡。有些那么具有一定的組織特異性，如糖皮質(zhì)激素對(duì)淋巴細(xì)胞，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)對(duì)肝細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。在胸腺細(xì)胞發(fā)育的一個(gè)時(shí)期，T細(xì)胞抗原受體的誘導(dǎo)作用可導(dǎo)致胸腺細(xì)胞發(fā)生凋亡。在某些靶細(xì)胞中，腫瘤壞死因子(TNF)可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，這些靶細(xì)胞外表具有TNF受體，其TNF受體與Fas同源。許多抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，如阿霉素和道諾霉素、順鉑、表鬼臼脂表、長(zhǎng)春新堿和秋水仙素等。表13-4列舉了一些細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素或因子。表13-4一些細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)因子細(xì)胞類型T細(xì)胞抗原受體胸腺細(xì)胞Fas/Apo激活胸腺細(xì)胞和其他細(xì)胞TNF各種細(xì)胞細(xì)胞毒T細(xì)胞溶解受感染細(xì)胞糖皮質(zhì)激素淋巴細(xì)胞DNA損傷各種細(xì)胞Dioxin胸腺細(xì)胞谷氨酸神經(jīng)元TGFβ1肝細(xì)胞細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞2、細(xì)胞生長(zhǎng)因子去除后的細(xì)胞凋亡越來(lái)越多的研究說(shuō)明，最初被作為細(xì)胞增殖因子的多肽生長(zhǎng)因子中，有一些是細(xì)胞的存活因子(viabilityfactor)具有抑制細(xì)胞死亡、減少正常細(xì)胞喪失的功能，為多種類型細(xì)胞〔或許是所有類型的細(xì)胞〕的存活所必需。幾乎可以說(shuō)，所有的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞都要依賴于一種以上的生長(zhǎng)因子來(lái)維持其存活，這些依賴的細(xì)胞因子存在和去除，對(duì)PCD有抑制和誘導(dǎo)作用。然而，在許多情況下，這些細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)其靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡抑制作用并非特異，可被各種生長(zhǎng)因子所替代。表13-5列舉了一些生長(zhǎng)因子去除后發(fā)生的細(xì)胞凋亡。去除生長(zhǎng)因子誘發(fā)PCD反響的機(jī)制，目前尚未完全弄清楚。不過(guò)，一些研究者提出，生長(zhǎng)因子去除后，靶細(xì)胞受體獲得的信號(hào)減少，引起信號(hào)傳導(dǎo)途徑的削弱，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞許多根本功能的下調(diào)。例如，代謝速率減慢后，基因表達(dá)模式也會(huì)因此而發(fā)表13-5細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子細(xì)胞類型因子造血原始干細(xì)胞各種細(xì)胞因子T淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素-2B淋巴細(xì)胞抗原嗜酸性細(xì)胞白細(xì)胞介素-5神經(jīng)元神經(jīng)生長(zhǎng)因子膠質(zhì)細(xì)胞血小板源性生長(zhǎng)因子乳腺雌激素，黃體酮前列腺雄激素表達(dá)c-myc的纖維母細(xì)胞血清生改變。Evan等人的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，生長(zhǎng)因子去除后基因的“不平衡〞表達(dá)，對(duì)這些細(xì)胞的PCD生成起關(guān)鍵作用。例如，IL-3依賴的祖細(xì)胞，去除IL-3后，細(xì)胞c-myc基因表達(dá)過(guò)度，加速了PCD的生成。已報(bào)道的誘導(dǎo)凋亡物質(zhì)見(jiàn)表13-6。表13-6已報(bào)道的誘導(dǎo)凋亡的物質(zhì)生理性激活劑損傷相關(guān)誘導(dǎo)劑治療相關(guān)因素毒素1.TNF家庭1.熱休克1.化療藥物1.乙醇FAS配體2.病毒感染順鉑2.β淀粉肽TNF3.細(xì)菌毒素阿糖胞苷2.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)4.癌基因myc,長(zhǎng)春新堿因子βrel,ElA氨甲喋呤3.神經(jīng)遞質(zhì)5.腫瘤抑制因子阿霉素谷氨酸P53爭(zhēng)光霉素多巴胺6.細(xì)胞溶解性氨芥NA-甲基-D-天門冬氨酸T細(xì)胞2.γ射線4.生長(zhǎng)因子7.自由基3.UV射線缺乏8.抗氧化劑5.基質(zhì)的喪失9.營(yíng)養(yǎng)素缺乏-附著體抗代謝物6.鈣7.糖皮質(zhì)激素3、細(xì)胞凋亡的抑制對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用的因素主要有以下幾個(gè)方面。某些癌基因或細(xì)胞凋亡相關(guān)基因具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，如bcl-2、bcl-Xl(大分子蛋白)和突變型P53等。某些病毒感染靶細(xì)胞后，為延長(zhǎng)其宿主細(xì)胞的壽命，以利其自身的修復(fù)，那么抑制宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡。如EB病毒在感染宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)bcl-2表達(dá)，并編碼bcl-2基因產(chǎn)物的同類物；腺病毒的E1B19000蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。某些細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如造血集落刺激因子(CSF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子〔NGF〕、以及白細(xì)胞介素類〔IL〕具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。正常的造血細(xì)胞因子，如粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子〔GM-CSF〕、IL-3和IL-6對(duì)細(xì)胞毒抗癌藥或TGFβ1所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用，IL-6對(duì)野生型P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用，IL-4對(duì)用氫化可的松介導(dǎo)的慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞凋亡具有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，在某些細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中，存在大分子蛋白質(zhì)的主動(dòng)合成，某些藥物如放線菌酮和放線菌素D，可通過(guò)抑制RNA和蛋白質(zhì)的合成，可抑制某些因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。已報(bào)道的抑制凋亡物質(zhì)見(jiàn)表13-7。表13-7抑制細(xì)胞凋亡的物質(zhì)生理抑制劑病毒基因藥理學(xué)因素1.生長(zhǎng)因子1.腺病毒ElB1.鈣蛋白酶抑制劑2.細(xì)胞外基質(zhì)2.桿狀病毒P352.半胱氨酸蛋白酶3.CD40配體3.牛痘病毒CrmA抑制劑4.中性氨基酸4.桿狀病毒IAP3.腫瘤啟動(dòng)劑5.鋅5.EB病毒BHRFI，LMA-1PMA6.雌激素6.非洲豬熱病毒LMW5-HL苯巴比妥7.雄激素7.皰疹病毒y34.5α-六氯環(huán)乙烷〔二〕細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及其調(diào)節(jié)許多研究資料說(shuō)明，細(xì)胞凋亡的激發(fā)與抑制是受遺傳因素影響的.有多種基因參與細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控，其詳細(xì)的機(jī)制目前尚不清楚。表13-8中列舉了多種對(duì)細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)或抑制作用的基因，其中一局部是癌基因，一局部是應(yīng)用減數(shù)雜交等方法從凋亡細(xì)胞中別離的特異性細(xì)胞凋亡相關(guān)基因。表2-8誘導(dǎo)或抑制凋亡的基因誘導(dǎo)抑制野生型P53bcl-2去調(diào)節(jié)c-mycPM