細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基本操作與實(shí)驗(yàn)室要求

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基本操作與實(shí)驗(yàn)室要求演示文稿目前一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)（優(yōu)選）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基本操作與實(shí)驗(yàn)室要求目前二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)1、植物實(shí)驗(yàn)室基本操作室無菌操作室培養(yǎng)室鑒定分析室溫室一、實(shí)驗(yàn)室目前三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)2、動物細(xì)胞培養(yǎng)室原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無塵。

實(shí)驗(yàn)室設(shè)置上至少有4個(gè)房間：

基本操作室，洗滌，滅菌。

緩沖間，位于準(zhǔn)備室和培養(yǎng)室之間。

無菌培養(yǎng)室，內(nèi)有超凈工作臺，一般應(yīng)在內(nèi)側(cè)，室內(nèi)可消毒，培養(yǎng)箱。鑒定分析室，用于細(xì)胞的觀察和分析研究。目前四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備（一）必要器皿1、培養(yǎng)器皿（動物細(xì)胞培養(yǎng)一般為塑料器皿，優(yōu)點(diǎn)是一次性使用，已消毒滅菌密封包裝，打開即可用；植物細(xì)胞培養(yǎng)一般用三角瓶）2、盛裝器皿（各種玻璃器皿）3、計(jì)量器皿（量筒、吸管、加樣器等）4、金屬器皿（用于解剖、取材、剪切組織等）目前五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)（二）常用儀器設(shè)備1．無菌操作儀器設(shè)備醫(yī)用超凈工作臺(氣流水平型和垂直型)，高壓蒸汽滅菌鍋(手提式、立式)，干熱滅菌烘箱，過濾除菌裝置。2．培養(yǎng)儀器設(shè)備

植物：培養(yǎng)架、搖床、振蕩式培養(yǎng)機(jī)(100次/min)、恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱、暗培養(yǎng)箱等。動物：恒溫培養(yǎng)箱及CO2恒溫培養(yǎng)箱。目前八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)3．藥品存貯和配制儀器設(shè)備4．觀察分析儀器設(shè)備顯微鏡（高倍、倒置、實(shí)體解剖和熒光顯微鏡等）及配套照相系統(tǒng)、解剖鏡、離心機(jī)、液氮容器、恒溫箱、精密天平等。5．其它儀器設(shè)備，如流式細(xì)胞儀，酶標(biāo)儀等。目前九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱目前十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前十三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前十五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)MB-IV型酶標(biāo)檢測儀

目前十六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前十七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前十八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前十九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)第二節(jié)實(shí)驗(yàn)室的基本操作實(shí)驗(yàn)室的基本操作是圍繞無菌要求進(jìn)行的，主要包括清洗、消毒滅菌，無菌操作等。目前二十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)一、清洗未用過的玻璃器皿：常有游離堿性物質(zhì)，使用前，先用1%稀鹽酸浸泡一夜，然后用洗衣粉洗滌，清水沖洗，蒸餾水沖洗一遍，晾干備用。已用過的玻璃器皿：用洗衣粉刷洗，清水沖洗，晾干備用。新的塑料器皿：打開即用。已用過的塑料器皿金屬器皿：一般不宜用洗滌液洗滌，新的用熱洗衣粉水洗凈、沖洗后，蒸餾水沖洗擦干即可。目前二十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的玻璃器皿常需用洗液浸泡，再拿出沖洗，洗液配方如下：配方成分弱液次強(qiáng)液強(qiáng)液常用配方重鉻酸鉀(g)濃硫酸(ml)蒸餾水(ml)

501001000100200100060800200100200800目前二十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)1、KCrO4液要冷卻后才能加濃硫酸。以防暴沸。2、濃硫酸要慢慢倒入KCrO4液中。3、洗液要密封保存，以免失效。

正常洗液黑棕色藍(lán)綠色（效用變?nèi)酰┠壳岸揬總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)二、消毒滅菌嚴(yán)格的消毒滅菌起著至關(guān)重要的作用，主要物理滅菌方法有：

濕熱滅菌:高溫高壓法、流動蒸汽或沸水121℃，1.0-1.1Kg/cm2，20-30分鐘

干熱滅菌：烤箱、焚燒、酒精燈,于150℃恒溫40min,或120℃恒溫2h，或160℃恒溫1.5-2h(芽孢桿菌)射線照射滅菌：紫外線(細(xì)胞培養(yǎng)室，超凈工作臺)、電離輻射

過濾滅菌：微孔濾膜、玻璃絲濾器0.22-0.45μm目前二十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)高溫高壓滅菌可能出現(xiàn)的問題：pH值下降0.3-0.5太高溫度滅菌時(shí)可能使糖焦化，可能產(chǎn)生毒性，對有些培養(yǎng)基應(yīng)選擇合適條件滅菌。滅菌時(shí)間過長使鹽沉淀，同時(shí)使瓊脂解聚揮發(fā)性物質(zhì)不能高溫滅菌，否則會被破壞目前二十五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前二十六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)化學(xué)消毒滅菌主要有：熏蒸滅菌

藥物蒸汽對室內(nèi)空氣進(jìn)行殺菌。

甲醛和高錳酸鉀混合后產(chǎn)生大量蒸汽。

醋燒開?；瘜W(xué)藥品滅菌

70%

-75%酒精，

升汞

漂白粉

新潔爾敏

過氧化氫抗生素抑菌法青霉素、鏈霉素、新霉素目前二十七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)消毒劑使用濃度(%)去除難易消毒時(shí)間(min)效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9~102飽和溶液1~210~120.1~170~754~5(mg/L)1易易易易最易較難易中較難5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好較好好常用消毒劑消毒滅菌效果比較表目前二十八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)三、無菌操作1、無菌操作前的準(zhǔn)備工作：穿好工作服、戴上工作帽和口罩。將各種操作所用的金屬器械浸泡在95％或70％的酒精，點(diǎn)燃酒精燈。將耐熱器皿（不銹鋼小盤）中加入少量酒精，將蘸有酒精的金屬器械及器械支架放入耐熱器皿中灼燒，待涼后備用。用70％～75％的酒精擦拭新培養(yǎng)容器和繼代培養(yǎng)容器表面，放置超凈臺上待用。用上述濃度的酒精擦拭雙手和前臂。目前二十九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前三十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前三十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)2、無菌操作步驟將培養(yǎng)材料滅菌后放入已消毒的培養(yǎng)皿中，置于超凈工作臺酒精燈火焰下方，進(jìn)行適當(dāng)切割或其他處理。在酒精燈火焰處將培養(yǎng)瓶蓋輕輕打開，瓶口在火焰處旋轉(zhuǎn)灼燒。將鑷子過火，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上將鑷子、瓶口及塞子過火后蓋回瓶口?！^代培養(yǎng)用滅菌的器具（鑷子或吸管）直接將培養(yǎng)材料放置在新培養(yǎng)基上。目前三十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)第三節(jié)培養(yǎng)基及其配制目前三十三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)定義：培養(yǎng)基是離體培養(yǎng)組織或細(xì)胞賴以生存的營養(yǎng)基質(zhì)，是為離體培養(yǎng)材料提供的近似生物體內(nèi)生存的營養(yǎng)環(huán)境。沒有任何一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的組織、細(xì)胞和器官的培養(yǎng)。目前三十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)必要元素在細(xì)胞內(nèi)的主要生理作用組成各種化合物，參與有機(jī)體的構(gòu)造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)。構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的生理代謝。元素間互相協(xié)調(diào)，維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學(xué)方面的作用。調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生和組織器官的建成。目前三十五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)一、植物細(xì)胞培養(yǎng)基及其配制完善的植物培養(yǎng)基配方為：

水分

無機(jī)營養(yǎng)成分

有機(jī)營養(yǎng)成分

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

瓊脂目前三十六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前三十七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)（一）培養(yǎng)基成分1、無機(jī)元素氮--各種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)和核酸的重要組成成分。鈣--細(xì)胞壁的成分之一鐵、鋅、鉬--某些酶的組成成分植物缺乏無機(jī)元素可能引起的疾病：植物失綠、細(xì)胞分裂停止、細(xì)胞分化受阻等。營養(yǎng)元素過多可以引起植物細(xì)胞代謝障礙、生長抑制。目前三十八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)2、有機(jī)營養(yǎng)成分提供促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞生長和分化所必需的有機(jī)碳、氮等營養(yǎng)物質(zhì)，包括：

氨基酸類維生素類糖類天然有機(jī)添加物類目前三十九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)氨基酸類常用：甘氨酸有時(shí)用：絲氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白和水解乳蛋白等。用量通常為2-3mg/L。水解酪蛋白CH和水解乳蛋白LH，對培養(yǎng)材料的細(xì)胞分化有良好的促進(jìn)作用，用量為100-2000mg/L目前四十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)維生素類維生素類是以輔酶形式參與植物細(xì)胞代謝活動的重要物質(zhì)，對生長、分化有很好的促進(jìn)作用。

用量：0.1-10mg/L常用：鹽酸硫胺素（維生素B1）

鹽酸吡哆醇（維生素B6）煙酸（維生素B3）葉酸（維生素Bc）有時(shí)用：生物素（維生素H）泛酸鈣（維生素B5）抗壞血酸（維生素C）目前四十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)糖類糖類是培養(yǎng)基的主要碳源。常用碳源是蔗糖，還有葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、甘露糖、山梨糖等。適宜的濃度為2%-5%。離體雙子葉植物根：以蔗糖為碳源最好。單子葉植物的根：以右旋糖（葡萄糖）為碳源最好。目前四十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)肌醇在糖類的互相轉(zhuǎn)化中起作用，是培養(yǎng)基中不可缺少的有機(jī)營養(yǎng)。形成細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)：果膠質(zhì)。形成植酸

與Ca2+、Mg2+結(jié)合成植酸鈣鎂。

形成磷脂，細(xì)胞膜組分?？梢娂〈紖⑴c了碳水化合物、磷脂代謝和離子平衡等生理活動。用量為50-100mg/L。目前四十三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)天然有機(jī)添加物類椰乳、馬鈴薯汁、酵母提取液、番茄汁等?；瘜W(xué)成分不明的復(fù)雜營養(yǎng)混合物，對細(xì)胞和組織的生長和分化有明顯的促進(jìn)作用，但質(zhì)和量受多種因素影響，實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性差。目前四十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是促進(jìn)培養(yǎng)植物生長良好的主要因素。由無機(jī)和有機(jī)營養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證了培養(yǎng)物的生存，只有配以適當(dāng)?shù)闹参锷L調(diào)節(jié)物質(zhì)時(shí)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的啟動，愈傷組織生長及根、芽分化和胚狀體的發(fā)育。目前四十五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)包括：

生長素（auxin）類細(xì)胞分裂素類（cytokinin）赤霉素（gibberellin）類脫落酸（abscisicacid）乙烯（ethylene）等目前四十六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)生長素類組織培養(yǎng)中生長素的作用：

促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和細(xì)胞分裂誘導(dǎo)愈傷組織形成促進(jìn)生根誘導(dǎo)不定芽的分化（與細(xì)胞分裂素配合）誘導(dǎo)側(cè)芽的萌發(fā)與生長胚狀體的產(chǎn)生等目前四十七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前四十八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)常用生長素有：2,4-二氯苯氧乙酸：有抑制芽形成的副作用，一般用于啟動細(xì)胞的脫分化。誘導(dǎo)分化則用NAA或IBA、IAA。萘乙酸（NAA）吲哚丁酸（IBA）：人工合成，120oC仍很

穩(wěn)定。組織培養(yǎng)中常用。生根效果好。吲哚乙酸（IAA）等：天然植物生長素，見光易分解，高溫高壓易破壞。目前四十九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)細(xì)胞分裂素類細(xì)胞分裂素的作用：

促進(jìn)細(xì)胞分裂誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化不定芽抑制頂端優(yōu)勢而促進(jìn)莖的增殖抑制離體組織或器官衰老等目前五十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前五十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)常用的細(xì)胞分裂素有：

激動素或糖基腺嘌呤（kinetin，KT）（見光易分解，需暗處保存）6-芐基腺嘌呤（6-BA）2-異戊烯腺嘌呤（2-Zip）玉米素（zeatin，ZT）等目前五十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)赤霉素類赤霉素（gibberellin，GA）有20多種。組織培養(yǎng)中僅使用GA3一種：能促進(jìn)誘導(dǎo)形成的不定胚正常發(fā)育成小植株。GA3不耐熱，溶水后不穩(wěn)定，需溶于酒精中，過濾除菌。目前五十三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)脫落酸脫落酸（abscisicacid，ABA）的作用：

抑制蛋白質(zhì)合成抵消和抑制生長素、細(xì)胞分裂素和GA發(fā)揮作用誘導(dǎo)休眠促進(jìn)衰老和脫落抑制氣孔開放，減少蒸騰作用對一些培養(yǎng)物芽的形成有促進(jìn)作用目前五十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)短日照條件誘導(dǎo)脫落酸合成，延緩生長、促進(jìn)落葉、形成休眠芽（秋季）。長日照條件誘導(dǎo)赤霉素合成，促進(jìn)生長、誘導(dǎo)開花（春夏季）。目前五十五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)乙烯乙烯的作用：

具有促熟果實(shí)促進(jìn)脫落和衰老促進(jìn)橡膠、漆、松脂等次生物質(zhì)的排泌促進(jìn)菠蘿開花增加黃瓜等雌花數(shù)量等目前五十六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)培養(yǎng)時(shí)植物組織自身會散發(fā)出乙烯。生長素用量過高時(shí)會誘導(dǎo)植物產(chǎn)生乙烯。較高的乙烯引起植物發(fā)生形態(tài)變化：豌豆上胚軸加粗、失去負(fù)向地性等。用高錳酸鉀進(jìn)行吸附可減少乙烯含量。常用乙烯利（2-氯乙基膦酸）：在pH值高于4.1時(shí)，即分解釋放出乙烯。目前五十七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)瓊脂固體培養(yǎng)基最好的固化劑是瓊脂。是從海藻中提取的一種高分子多糖類物質(zhì)，不提供任何營養(yǎng)成分，培養(yǎng)材料良好的支持物。用量為3-10g/L。溶于熱水，在40oC以下凝固為凝膠狀。瓊脂能吸附細(xì)胞代謝中的一些廢物。目前五十八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)在研究組織或細(xì)胞營養(yǎng)代謝時(shí)，應(yīng)避免使用瓊脂培養(yǎng)基，因?yàn)殡s質(zhì)會影響研究結(jié)果。液體培養(yǎng)基中用無灰濾紙制成的紙橋作為支持物來培養(yǎng)愈傷組織，避免了瓊脂雜質(zhì)的影響。目前五十九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)成分Bacto-瓊脂（%）Noble-瓊脂（%）純化瓊脂（%）灰分4.52.61.75鈣0.130.230.27鋇0.010.010.01硅質(zhì)0.190.260.09氯化物0.430.180.13硫酸鹽2.541.901.32氮0.170.100.14鐵11.00（mg/L）1.00（mg/L）1.00（mg/L）鎂285.00（mg/L）260.00（mg/L）695.00（mg/L）銅5.00（mg/L）7.50（mg/L）20.00（mg/L）植物組織培養(yǎng)中常用的瓊脂的化學(xué)成分

目前六十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)植物培養(yǎng)基的pH值植物培養(yǎng)材料大多要求弱酸性的環(huán)境。滅菌前需將pH值調(diào)節(jié)到5.6-5.8。當(dāng)pH高于6時(shí)，培養(yǎng)基變硬，不利于培養(yǎng)物的生長。而低于5時(shí)，瓊脂不能很好凝固。目前六十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)各種培養(yǎng)基在無機(jī)營養(yǎng)組成上的差異主要是鹽和離子數(shù)量上的不同。據(jù)無機(jī)鹽的含量可分為：高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基硝酸鉀含量較高培養(yǎng)基中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基應(yīng)用最為廣泛的培養(yǎng)基：MS。目前六十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)1、高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基主要有MS和ER培養(yǎng)基。特點(diǎn)：鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高。微量元素種類齊全。養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。目前六十三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)2、較高硝酸鉀含量培養(yǎng)基主要有B5和N6培養(yǎng)基。適合于木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。目前六十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)3、中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基主要有Nitsch和NT培養(yǎng)基。特點(diǎn)：大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半。微量元素種類減少，但含量較MS高。適合于花藥培養(yǎng)。目前六十五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)4、低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基主要有White和Heller。特點(diǎn)：培養(yǎng)基大量元素含量大幅降低和種類減少。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基。目前六十六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)（二）植物培養(yǎng)基配制母液的配制和培養(yǎng)基的配制1．母液的配制母液的配制是按藥品的種類和性質(zhì)分別配制，單獨(dú)保存或幾種混合4~5oC保存。配制好的母液種類一般有：大量元素、微量元素、鈣鹽、鐵鹽、有機(jī)營養(yǎng)和單獨(dú)保存的各種生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)。

目前六十七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)1、

培養(yǎng)基母液的配制大量元素母液：10~100倍濃度。微量元素和有機(jī)營養(yǎng)母液：100倍濃度?；旌隙ㄈ荩鹤⒁馑巹┑奶砑哟涡蚣跋♂尪?，以免發(fā)生沉淀。鈣鹽和鐵鹽：分別單獨(dú)配制。生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)：0.2~1.0mg/ml原液。IAA等醇溶性，先用少量95%酒精溶解，再用dH2O定容。KT、6-BA、2-Zip、ZT：先溶于少量1mol/L鹽酸，再用dH2O定容。葉酸：先用少量稀氨水溶解后再定容。目前六十八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)培養(yǎng)基的配制方法在干凈容器中加入終體積約3/4的dH2O及所需要的瓊脂和糖，煮沸溶解瓊脂。不時(shí)攪拌以防止瓊脂在鍋底燒焦或沸騰溢出。加入所需量的各種母液及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（不包括過濾除菌藥劑）。加dH2O至近終體積，再次煮沸并加dH2O至終體積。充分混合后用1N鹽酸或1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值。冷卻，加入過濾除菌藥劑，分裝，50ml培養(yǎng)基/150ml三角瓶，封口。高壓滅菌，室溫凝固備用。目前六十九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)水藥品糖混合pH調(diào)整加熱溶解瓊脂

玻璃器皿水洗干燥分裝加塞

高壓蒸氣滅菌

植物培養(yǎng)基配制程序冷卻過濾滅菌藥品接種目前七十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)需加入過濾滅菌的藥品，在高壓滅菌后，培養(yǎng)基凝固前加入，并輕搖使混勻。培養(yǎng)基終體積定容時(shí)，可以利用臺秤通過重量進(jìn)行培養(yǎng)基終體積的確定。目前七十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)培養(yǎng)基的pH值直接影響培養(yǎng)物對離子的吸收，過酸或過堿不僅影響到培養(yǎng)材料的生長，而且會影響到瓊脂的凝固。經(jīng)高壓高溫滅菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度會增加（pH值一般可降低0.2），調(diào)pH值時(shí)應(yīng)考慮。

目前七十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)二、動物培養(yǎng)基動物細(xì)胞的營養(yǎng)要求比植物細(xì)胞的要復(fù)雜得多。目前，絕大多數(shù)動物細(xì)胞必須在培養(yǎng)基中添加血清等成分不明確的天然培養(yǎng)基成分，還不能在成分完全明確的培養(yǎng)基中生長繁殖。目前七十三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)動物細(xì)胞培養(yǎng)基通常是液態(tài)。根據(jù)其是否能促進(jìn)細(xì)胞生長，可分為：

生長培養(yǎng)基（growthmedium）維持培養(yǎng)基（maintenancemedium）

按來源，又可分為：

合成培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基。

目前七十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)生長培養(yǎng)基生長培養(yǎng)基是指用來培養(yǎng)細(xì)胞使其快速生長增殖的培養(yǎng)基。對動物細(xì)胞來說，一般只要將生長培養(yǎng)基中的血清濃度降低或全部除去，就可獲得維持培養(yǎng)基。目前七十五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)維持培養(yǎng)基維持培養(yǎng)基是指只能用來維持培養(yǎng)細(xì)胞的存活，但不能促使細(xì)胞生長和增殖的培養(yǎng)基。培養(yǎng)細(xì)胞處于不分裂狀態(tài)下，更易分泌活性產(chǎn)物此時(shí)，若加入特定化學(xué)藥品，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性產(chǎn)物；若細(xì)胞感染了病毒，則在此狀態(tài)下病毒會大量擴(kuò)增，從而生產(chǎn)病毒疫苗。目前七十六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)特點(diǎn)：能在數(shù)周內(nèi)使培養(yǎng)細(xì)胞保持良好狀態(tài)，而不會使細(xì)胞的特性受到損害。目的：提高細(xì)胞的生產(chǎn)力，細(xì)胞不生長，能更多更快生產(chǎn)終產(chǎn)物。維持培養(yǎng)基成分可能很復(fù)雜，也可能很簡單。目前七十七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)條件培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中，有些細(xì)胞可能會分泌活性物質(zhì)到培養(yǎng)液中，這種培養(yǎng)過某種細(xì)胞以后，含有細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)液又稱為條件培養(yǎng)基(conditionedmedium）。目前七十八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基主要包括:各種動物的體液（血淋巴、血漿和血清）、組織提取液（胎汁、酵母提取物）等合成培養(yǎng)基是指按照體內(nèi)細(xì)胞所需營養(yǎng)的種類和數(shù)量配成的成分明確的培養(yǎng)基。一般來說，合成培養(yǎng)基只能維持動物細(xì)胞的生存，要想使細(xì)胞生長和增殖，還需補(bǔ)充部分天然培養(yǎng)基。

目前七十九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)(一)培養(yǎng)基的成分1、生長培養(yǎng)基培養(yǎng)動物細(xì)胞用的生長培養(yǎng)基組分包括9種：水、無機(jī)鹽、微量元素、維生素、緩沖系統(tǒng)、能源和碳源、氮源、激素和生長因子、添加劑等

目前八十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)水對水的要求極其嚴(yán)格水是細(xì)胞的主要組成成分之一，水在細(xì)胞內(nèi)主要起溶劑作用。細(xì)胞吸收的營養(yǎng)物質(zhì)、分泌的產(chǎn)物、代謝的廢物都要溶解在水中；細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞的運(yùn)動及維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓也離不開水。水是離體培養(yǎng)細(xì)胞的重要生存環(huán)境。目前八十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)

無機(jī)鹽（大量元素）解決培養(yǎng)細(xì)胞短期生存問題，重要的因素是滲透壓。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基的滲透壓必須接近或等于細(xì)胞本身的滲透壓，即等滲溶液。否則細(xì)胞就會失水皺縮或吸水膨脹而死亡。等滲溶液主要是通過培養(yǎng)基內(nèi)無機(jī)鹽中的各種離子來實(shí)現(xiàn)的。目前八十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)配制動物細(xì)胞培養(yǎng)基的無機(jī)鹽與植物細(xì)胞的很不相同NH4+對動物細(xì)胞是有毒的，但它卻是植物細(xì)胞必需的氮源；KCl和NaCl在動物細(xì)胞培養(yǎng)基中含量都較高，但它們對植物細(xì)胞的生長卻似乎并不重要。動物細(xì)胞以高氧化態(tài)的Fe3+（硝酸鐵）為鐵源，而植物細(xì)胞以Fe2+（硫酸亞鐵）為鐵源。

目前八十三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)微量元素缺乏稀有微量元素的培養(yǎng)基對任何真核細(xì)胞的培養(yǎng)都是不合適的。培養(yǎng)基中微量元素的含量通常都很低，一般小于1g/L，水和無機(jī)鹽中已有足夠量，不需要另加。目前八十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)維生素動物細(xì)胞培養(yǎng)也需要維生素，而且動物細(xì)胞對維生素種類的要求通常比植物細(xì)胞要多一些。

目前八十五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)維生素動物（mg/L）植物（mg/L）尼克酰胺1-4--尼克酸--0.5-1吡哆醇--0.5-1吡哆醛1-4--硫胺1-40.1-10核黃素0.1~0.4--維生素B121.36--葉酸1.6--泛酸1.6--氯化膽堿1.6--動植物細(xì)胞培養(yǎng)基中常用的維生素維生素目前八十六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)緩沖系統(tǒng)緩沖系統(tǒng)對維持培養(yǎng)基的pH值是至關(guān)重要的。動物細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值是通過模擬血漿內(nèi)天然存在的CO2/NaHCO3系統(tǒng)來控制的。目前八十七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)緩沖系統(tǒng)肺中:

空氣中O2擴(kuò)散到血液中，并與血紅細(xì)胞結(jié)合。血漿中CO2擴(kuò)散到空氣中，被排出體外。組織中：

血紅細(xì)胞釋放攜帶的O2并擴(kuò)散到組織細(xì)胞中，組織細(xì)胞呼吸產(chǎn)生的CO2被排放到血漿中。血漿中CO2的溶解與釋放與形成H2CO3有關(guān)。

目前八十八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)NaHCO3作為等滲溶液的一部分加到培養(yǎng)基內(nèi)。臨配制前加入，約2g/L在密閉式培養(yǎng)瓶內(nèi)，一方面，由于NaHCO3不穩(wěn)定，易分解產(chǎn)生CO2，CO2從培養(yǎng)液中游離出來，使培養(yǎng)液pH值升高；另一方面，細(xì)胞呼吸產(chǎn)生的CO2，以及細(xì)胞代謝產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物，又使培養(yǎng)液pH值降低。

目前八十九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)培養(yǎng)基顏色的變化在培養(yǎng)開始的時(shí)候，培養(yǎng)基的pH值可能會明顯上升，但隨著細(xì)胞的生長和細(xì)胞數(shù)目的增多，培養(yǎng)基的pH值就會逐漸降低。酚紅作為pH指示劑：

培養(yǎng)基的顏色變化是：櫻桃紅色粉紅色黃色。目前九十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)在使用培養(yǎng)基之前，先通入CO2；或在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，開放式培養(yǎng)的話培養(yǎng)基的顏色變化則是：

櫻桃紅色黃色目前九十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)pH動物細(xì)胞對pH的穩(wěn)定性要求較高，6.8-7.6。植物細(xì)胞則要求不高。一般通過改變培養(yǎng)基中的磷酸鹽或碳酸鹽的比例來達(dá)到一定的pH值。目前九十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)能源和碳源葡萄糖(1-4g/L)是動物細(xì)胞的主要碳源。丙酮酸、琥珀酸和肌酸等碳源也常常成為動物細(xì)胞的補(bǔ)充能源。當(dāng)不要求培養(yǎng)細(xì)胞以最大速度生長時(shí)，可以用半乳糖代替葡萄糖。目前九十三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)

能源和碳源植物細(xì)胞的能源包括蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖和淀粉。蔗糖不能直接穿過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被利用，但植物的細(xì)胞壁內(nèi)含有蔗糖酶（invertase），它能把蔗糖水解為葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖再穿膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被利用。目前九十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)氮源動物細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸的氮源有兩種：成分明確的氮源指動物細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和生長所必不可少的一些必需氨基酸和非必需氨基酸。成分不明確的氮源指動物細(xì)胞培養(yǎng)基中加入的各種動物血清、組織提取液以及蛋白水解產(chǎn)物（如水解乳蛋白）等。目前九十五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)血清（serum）血清是大多數(shù)生長培養(yǎng)基的一個(gè)成分。最常用的是牛血清，但馬、人、兔及其他來源的血清有時(shí)也用。一般來講，動物愈年輕，其血清愈有利于細(xì)胞生長。所以成年牛血清不如小牛血清，小牛血清不如胎牛血清（fetalbovineserum）。目前九十六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)血清（serum）血清中已知的貼壁和鋪展因子有：

纖粘蛋白（fibronectin）

冷不溶球蛋白（cold-insolubleglobulin，CIG）

血清鋪展因子（serumspreadingfactor，SSF）

胎球蛋白目前九十七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)目前尚不充分了解。血清中含有多種細(xì)胞生長和增殖所必不可少的激素、生長因子以及貼壁和鋪展因子，其作用：

血清和蛋白水解產(chǎn)物為培養(yǎng)細(xì)胞提供氮源。

具有促進(jìn)細(xì)胞生長的能力。

具有促進(jìn)細(xì)胞在培養(yǎng)基質(zhì)上附著和鋪開的能力。

抑制蛋白質(zhì)水解酶活性的能力。目前九十八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)血清對蛋白質(zhì)水解酶活性的抑制作用：

可以保護(hù)體外培養(yǎng)細(xì)胞不受死細(xì)胞所釋放的蛋白酶的傷害，抑制傳代時(shí)所用胰蛋白酶的消化作用，簡化傳代過程。目前九十九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)血清對培養(yǎng)細(xì)胞的不良影響A、血清中存在一些不利于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)，如補(bǔ)體、免疫球蛋白、病毒、支原體和一些生長抑制因子等；B、血清的成分不明確，影響對結(jié)果的分析；C、不同動物、不同批次血清的成分和活性差異較大，使培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。血清的滅活處理（滅活補(bǔ)體成分）：血清解凍后，于56℃水浴30min。滅活后的血清其促生長能力有所減弱，但可以在4℃保存很長時(shí)間。目前一百頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)激素和生長因子激素和生長因子都是培養(yǎng)動物細(xì)胞生長和增殖必不可少的物質(zhì)。二者的功能有時(shí)很難嚴(yán)格區(qū)分。目前一百零一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)添加劑微生物污染是細(xì)胞培養(yǎng)失敗的一個(gè)重要原因，因此培養(yǎng)基中常常要加入一定量的抗生素，減少污染的機(jī)會。但是需要注意的是，抗生素只能抑制而不能消滅微生物，因而對于已建立的細(xì)胞系，應(yīng)盡量少用或經(jīng)常停用抗生素，以便使可能的低度微生物污染及時(shí)得到暴露。

目前一百零二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)（二）培養(yǎng)基的制備1、天然培養(yǎng)基血清水解乳蛋白胚胎浸出液（胎汁）膠原目前一百零三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)血清基本制備過程：無菌條件下取血，然后將盛血的小瓶或試管傾斜，室溫放置2-4h，待血液充分凝結(jié)后，移入4℃冰箱過夜，讓血清析出。次日，吸取析出的血清（淡黃色），4000rpm離心10min，收集上清液，過濾除菌后分裝保存于-20℃。自制血清應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢測，保證無細(xì)菌、真菌、支原體和病毒污染，且球蛋白含量不超過0.2g/L。若球蛋白含量過高，表明胎?；蛟信；加懈腥拘约膊?。因此，球蛋白含量越低的血清，其質(zhì)量越好。

目前一百零四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)水解乳蛋白LH水解乳蛋白是乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解后的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸?？捎糜谠S多細(xì)胞系和原代細(xì)胞的培養(yǎng)，是常用的天然培養(yǎng)基。使用時(shí)，用Hank’s液配制成0.5%的酸性溶液，然后與合成培養(yǎng)基以一定比例混合使用（一般為1:1的體積比）。商品化的水解乳蛋白為淡黃色粉末，易潮解結(jié)塊，但不影響使用。不同商家和不同批次的水解乳蛋白質(zhì)量有所差異。

目前一百零五頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)胚胎提取液是早期細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的天然培養(yǎng)基。主要成分是一些大分子蛋白和小分子氨基酸，能促進(jìn)細(xì)胞生長繁殖。常用雞胚浸出液和牛胚浸出液。雞胚浸出液的制備方法是：將9-10d胎齡的雞胚磨碎，加等量緩沖液，離心收集上清，保存于-20℃。目前一百零六頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)膠原（collagen）作用：為了促進(jìn)組織塊或細(xì)胞的貼壁生長能力。來源：大鼠尾腱、豚鼠和牛的真皮以及牛眼的水晶體等。實(shí)驗(yàn)室大鼠尾腱制備方法：無菌條件下，取大鼠的尾腱，剪碎，用0.1%醋酸溶液4℃浸泡48h后，4000r/min離心30min，取上清分裝保存于-20℃。使用：將膠原均勻涂布于培養(yǎng)瓶的細(xì)胞生長面上，然后用沾有氨水的消毒棉球塞住瓶口，置密閉容器中室溫作用2h，氨氣與膠原作用，使膠原凝固。然后用平衡鹽溶液洗滌膠原面，再經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡過夜，37℃干燥備用。

目前一百零七頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)2、合成培養(yǎng)基第一個(gè)合成培養(yǎng)基是由Lewis于1911年設(shè)計(jì)的，僅含有幾種鹽類和糖類。合成培養(yǎng)基一般只能短期維持細(xì)胞生存，必須補(bǔ)加血清后才能作為生長培養(yǎng)基。常用合成培養(yǎng)基：

MEM、DMEM、DMEM/F12、Ham’sF12、RPMI-1640、M199、TC199等。目前一百零八頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)培養(yǎng)基的配制商品化培養(yǎng)基，粉末狀的。方法：每袋培養(yǎng)基粉末溶入1升三蒸水中。然后加入2g左右的NaHCO3粉末，及一定量的抗生素或抗真菌藥。充分溶解后，將培養(yǎng)基用孔徑0.22m的微孔濾膜抽濾滅菌。分裝保存于4℃或-20℃。臨用前加入10%～20%的血清，即可用于動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

目前一百零九頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)3、無血清培養(yǎng)基1911年，Lewis等最早提出。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。目前一百一十頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)無血清培養(yǎng)基是否成功：a、細(xì)胞至少要在該培養(yǎng)基上經(jīng)過連續(xù)三代測試，使細(xì)胞內(nèi)原先貯存的生長因子已經(jīng)用完，此后，若細(xì)胞還能生長，則說明培養(yǎng)基是適合細(xì)胞生長的。b、原先是異源群體（heterogeneouspopulation）的細(xì)胞系，經(jīng)過在成分明確的培養(yǎng)基中適應(yīng)選擇后，細(xì)胞類型可能會變得較為單一。c、一般來說，轉(zhuǎn)化程度較高的細(xì)胞更容易在成分明確的培養(yǎng)基中生長。目前一百一十一頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)實(shí)質(zhì)上就是研制可以替代血清的成分明確的補(bǔ)充成分。補(bǔ)充成分是可以代替血清的各種因子的總稱。已有100多種此類因子。按功能可分為四類：

⑴激素和生長因子

⑵結(jié)合蛋白

⑶貼壁和擴(kuò)展因子

⑷微量元素和低分子量營養(yǎng)成分。目前一百一十二頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)補(bǔ)充因子濃度補(bǔ)充因子濃度激素和生長因子胰島素胰高血糖素促卵泡激素生長激素生長調(diào)節(jié)素C表皮生長因子神經(jīng)生長因子甲狀旁腺激素孕酮睪酮促甲狀腺激素釋放激素促黃體生長激素釋放激素前列腺素F12前列腺素E1三磺甲腺原氨酸氫化可的松成纖維生長因子雌二醇5~10g/mL0.05~5g/mL0.05~5g/mL0.05~0.5g/mL1~100ng/mL1~100ng/mL1~10ng/mL1~10ng/mL1~100nmol/L1~10nmol/L1~10ng/mL1~10ng/mL1~100ng/mL1~100ng/mL1~100pmol/L10~100nmol/L1~10ng/mL1~10nmol/L微量元素和低分子量營養(yǎng)成分

Na2SeO3CdSO4

抗壞血酸-生育酚維生素A亞麻油酸丁二胺結(jié)合蛋白無脂肪酸牛血清白蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白貼壁和鋪展因子纖粘蛋白層粘連蛋白冷析球蛋白血清擴(kuò)散因子胎球蛋白膠原和聚賴氨酸10~100nmol/L0.5mol/L100mol/L10g/L10g/L50g/L3~5g/L0.5~2mg/mL0.5~100g/mL0.1mg/mL0.1mg/mL0.5~5mg/mL0.5~5mg/mL0.1~5mg/mL包蓋基質(zhì)無血清培養(yǎng)基的補(bǔ)充成分(程寶鸞,2000)

目前一百一十三頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)4、平衡鹽溶液兩種常用的平衡鹽緩沖液：Hanks液和Earl液。二者的主要區(qū)別是緩沖能力不同。

Hanks液的NaHCO3含量為0.35g/L,緩沖能力低；

Earl液的NaHCO3含量為2.2g/L，緩沖能力強(qiáng)。目前一百一十四頁\總數(shù)一百二十三頁\編于十七點(diǎn)幾種常用平衡鹽溶液的配方(g/L)

成分RingerPBSEarlHanksDu