辛伐他汀對心衰心肌細胞肌漿網鈣泵的影響資料

一．研究背景慢性心力衰竭是臨床常見病、多發(fā)病，因致死率、致殘率高，一直是臨床研究重點。當今國內外對慢性心力衰竭病理生理的研究更多集中于興奮收縮的鈣循環(huán)環(huán)節(jié)。鈣循環(huán)過程主要包括肌漿網（SR）鈣釋放、鈣回攝、鈣儲存三個過程。第一頁，共四十二頁。第一頁，共42頁。正常情況下，心肌舒張期SERCA2a（肌漿網鈣泵）將大部分鈣離子回攝到肌漿網儲存，

SERCA2a的調節(jié)包括直接調節(jié)和間接調節(jié)。CaMKⅡ（鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ)發(fā)揮直接調節(jié)作用，PLB（受磷蛋白）發(fā)揮間接調節(jié)作用；PLB去磷酸化時與SERCA2a結合，抑制了SERCA2a對鈣離子的親和力，而PLB磷酸化后與SERCA2a解離，SERCA2a對鈣離子的親和力增加,對鈣離子的回攝能力提高。PLB有3個磷酸化位點，即絲氨酸-16、蘇氨酸-17、絲氨酸-10位點；但主要發(fā)揮作用的是絲氨酸-16位點。絲氨酸-16位點由PKA(蛋白激酶A)磷酸化、PP1α（磷酸酶1α）去磷酸化。心衰時心肌細胞SERCA2a表達及活性有無變化，其變化的機制是什么?他汀類藥物用于慢性心力衰竭治療，可改善心功能，減輕心力衰竭癥狀。對肌漿網鈣泵有何影響?目前國內外文章鮮見報道。第二頁，共四十二頁。第二頁，共42頁。

通過觀察辛伐他汀對心衰心肌細胞PLB、SERCA2a、CaMKⅡ、PKA、PP1α的表達以及SERCA2a功能、PKA、CaMKⅡ活性的影響，探討心力衰竭的分子生物學機制以及辛伐他汀改善心力衰竭的分子生物學機制。二．研究目的第三頁，共四十二頁。第三頁，共42頁。三．研究方法第四頁，共四十二頁。第四頁，共42頁。

1研究對象：18只家兔，雌雄不拘，分為3組：假手術組6只，心力衰竭組

6只，辛伐他汀干預組6只(術后即予辛伐他汀10mg/kg/d，至實驗結束)。第五頁，共四十二頁。第五頁，共42頁。2.實驗方法：2.1：心衰模型的建立（主動脈瓣損傷+腹主動脈縮窄法）：①用戊巴比妥麻醉家兔，從右側頸總動脈用4F導管破壞主動脈瓣。②2周后，進行腹主動脈縮窄。用戊巴比妥麻醉，打開腹腔，在腎動脈上方，將腹主動脈縮窄50%左右。③觀察指標：包括呼吸、活動、進食、紫紺情況。第六頁，共四十二頁。第六頁，共42頁。藥物對左室重構的影響

①心臟超聲觀察心臟變化，觀察指標：左房內徑、左室舒張末徑、左室收縮末徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、射血分數、左室縮短率。

②解剖學觀察藥物對心室重構的影響：觀察心臟重量、左心室重量、心臟重量指數、左室重量指數。

③血液動力學觀察：觀察左室舒張末壓、左室收縮末壓。第七頁，共四十二頁。第七頁，共42頁。2.2RT-PCR檢測心肌組織PLB、SERCA2amRNA表達:

①抽提mRNA②逆轉錄③擴增

SERCA2a正義引物：F-TGAATAAACCGCCTCGG；反義引物：R-CAGCACCATCAGCCACT；

PLB

正義引物：F-ACTTCCCAGCTACAAGCCCA；反義引物：R-CTGATGTGGGAAATGACGGA；β-actin

正義引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT；反義引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG；

第八頁，共四十二頁。第八頁，共42頁。

擴增條件為94℃預變性4min，然后進入PCR循環(huán),94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)35次再延伸7min。SERCA2a、PLB與β-actin擴增片段長度分別為464、368、231bp。④電泳⑤圖像分析第九頁，共四十二頁。第九頁，共42頁。2.3

Westernblot檢測心肌細胞膜SERCA2a、細胞漿CaMKⅡ、PKA、PP1α蛋白表達:①提取心肌細胞膜、細胞漿蛋白；②用BCA法測定蛋白濃度；③Westernblot分別檢測心肌細胞膜SERCA2a蛋白、細胞漿CaM、CaMKⅡ、PKA、PP1α蛋白表達。第十頁，共四十二頁。第十頁，共42頁。2.4γ-32P底物摻入法測定CaMKⅡ、PKA的活性:

①提取細胞漿蛋白；

②用BCA法測定蛋白濃度；

③按CaMKⅡ、PKA檢測試劑盒說明測定二者的活性。第十一頁，共四十二頁。第十一頁，共42頁。2.5

無機磷酸根法測定SERCA2a活性:

①制備肌漿網；

②用BCA法測定蛋白濃度；

③按試劑盒說明測定SERCA2a的活性。第十二頁，共四十二頁。第十二頁，共42頁。2.6

利用光譜熒光檢測技術測定肌漿網的攝鈣能力:

①制備肌漿網；

②用BCA法測定蛋白濃度；

③測定肌漿網的攝鈣能力。

計算公式

[Ca2+]=Kd×（Rt﹣Rmin）/（Rmax﹣Rt）×Sf2/Sb2第十三頁，共四十二頁。第十三頁，共42頁。

3統(tǒng)計分析各組測得數值均以X±s表示，組間均數比較采用ANOVA檢驗

（SAS6.12版本），P<0.05為統(tǒng)計學有顯著差異。第十四頁，共四十二頁。第十四頁，共42頁。4.結果4.13組觀察開始時LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd、FS、EF比較：

3組家兔手術前LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVIDs、FS及EF無明顯差別（p＞0.05）第十五頁，共四十二頁。第十五頁，共42頁。4.23組觀察終止時LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd、FS、EF比較：觀察終止時心衰組LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVIDs較假手術組明顯增加（P<0.05），而他汀組以上參數較心衰組明顯降低（P<0.05）；心衰組FS及EF較假手術組明顯降低（P<0.05），而他汀組FS及EF較心衰組明顯增加（P<0.05）第十六頁，共四十二頁。第十六頁，共42頁。4.33組血流動力學結果比較：

3組家兔手術前血流動力學無明顯差別；觀察終止時，心衰組HR、LVESP和LVEDP較假手術組明顯增加（P<0.05）；而他汀組以上參數較心衰組明顯降低（P<0.05）第十七頁，共四十二頁。第十七頁，共42頁。4.43組心臟、左心室、心臟重量指數、左室重量指數比較：心衰組家兔心臟外觀較假手術組明顯增大，且心臟重量、左室重量及心臟重量指數、左室重量指數明顯增加（P<0.05）；而他汀組以上參數明顯低于心衰組（P<0.05）第十八頁，共四十二頁。第十八頁，共42頁。

4.5

三組心肌組織SERCA2amRNA表達比較：表1-6：三組心肌組織SERCA2amRNA表達比較注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。心衰組的SERCA2amRNA水平顯著低于假手術組，而辛伐他汀組的SERCA2amRNA水平明顯高于心衰組。心衰組辛伐他汀組假手術組灰度比

0.70±0.04*0.86±0.02▲1.06±0.16第十九頁，共四十二頁。第十九頁，共42頁。家兔7周后SERCA2amRNA的表達比較圖1-1圖1-2第二十頁，共四十二頁。第二十頁，共42頁。

4.6

三組心肌組織PLB

mRNA表達比較：表1-7：三組心肌組織PLBmRNA表達比較注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。心衰組的PLBmRNA水平顯著低于假手術組，而辛伐他汀組的PLBmRNA水平明顯高于心衰組。心衰組辛伐他汀組假手術組灰度比

0.81±0.04*0.96±0.06▲1.12±0.07第二十一頁，共四十二頁。第二十一頁，共42頁。家兔7周后PLBmRNA的水平表達比較圖1-3圖1-4第二十二頁，共四十二頁。第二十二頁，共42頁。

4.7

三組心肌組織SERCA2a蛋白表達比較：表1-8：三組心肌組織SERCA2a蛋白表達比較注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。心衰組的SERCA2a蛋白水平顯著低于假手術組，而辛伐他汀組的SERCA2a蛋白水平明顯高于心衰組。

心衰組辛伐他汀組假手術組灰度比

0.69±0.04*0.87±0.03▲1.02±0.02第二十三頁，共四十二頁。第二十三頁，共42頁。家兔7周后SERCA2a蛋白的表達比較

圖1-5

圖1-6第二十四頁，共四十二頁。第二十四頁，共42頁。

4.8三組心肌組織CaMKⅡ蛋白表達比較：表1-9：三組心肌組織CaMKⅡ蛋白表達比較注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05?？梢娦乃ソM心肌細胞CaMKⅡ表達顯著高于假手術組，辛伐他汀組顯著低于心衰組。

心衰組辛伐他汀組假手術組灰度比

1.45±0.13*1.16±0.06▲0.89±0.05

第二十五頁，共四十二頁。第二十五頁，共42頁。家兔7周后CaMKⅡ蛋白的表達比較

圖1-7

圖1-8第二十六頁，共四十二頁。第二十六頁，共42頁。

4.9三組心肌組織PKA蛋白表達比較：表1-10：三組心肌組織PKA蛋白表達比較注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。可見心衰組心肌細胞PKA表達顯著低于假手術組，辛伐他汀組顯著高于心衰組。心衰組辛伐他汀組假手術組灰度比

0.61±0.03*0.78±0.07▲1.05±0.08第二十七頁，共四十二頁。第二十七頁，共42頁。家兔7周后PKA蛋白的表達比較圖1-9圖1-10第二十八頁，共四十二頁。第二十八頁，共42頁。

4.10三組心肌組織PP1α蛋白表達比較：表1-11：三組心肌組織PP1α蛋白表達比較注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。可見心衰組心肌細胞PP1α表達顯著高于假手術組，辛伐他汀組顯著低于心衰組。心衰組辛伐他汀組假手術組灰度比

1.25±0.06*0.81±0.09▲0.39±0.07第二十九頁，共四十二頁。第二十九頁，共42頁。家兔7周后PP1α蛋白的表達比較

圖1-11圖1-12第三十頁，共四十二頁。第三十頁，共42頁。

4.11三組心肌組織CaMKⅡ活性比較：表1-12：三組心肌組織CaMKⅡ活性比較可見心衰組CaMKⅡ活性明顯高于假手術組，辛伐他汀組CaMKⅡ活性顯著低于心衰組。心衰組辛伐他汀組假手術組CaMKⅡ活性(pmol/min/μg)

3.54±0.17*2.83±0.14▲2.18±0.13圖1-13注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。第三十一頁，共四十二頁。第三十一頁，共42頁。

4.12三組心肌組織PKA活性比較：表1-13：三組心肌組織PKA活性比較可見心衰組PKA活性明顯低于假手術組，辛伐他汀組PKA活性顯著高于心衰組。心衰組辛伐他汀組假手術組PKA活性(pmol/min/μg)

1.09±0.09*1.44±0.04▲1.85±0.05圖1-14注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。第三十二頁，共四十二頁。第三十二頁，共42頁。4.13肌漿網囊泡的電鏡圖像：圖1－15

第三十三頁，共四十二頁。第三十三頁，共42頁。

4.14三組心肌組織SERCA2a活性比較：表1-14：三組心肌組織SERCA2a活性比較可見心衰組SERCA2a活性明顯低于假手術組，辛伐他汀組SERCA2a活性顯著高于心衰組。心衰組辛伐他汀組假手術組SERCA2a活性(μmolPi/mgp/h)

8.32±0.15*11.81±0.63▲15.01±1.00圖1-16注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。第三十四頁，共四十二頁。第三十四頁，共42頁。

4.15三組心肌細胞肌漿網攝鈣能力比較：表1-15：三組心肌細胞肌漿網攝鈣能力比較可見心衰組肌漿網攝鈣能力明顯低于假手術組，辛伐他汀組肌漿網攝鈣能力顯著高于心衰組。心衰組辛伐他汀組假手術組肌漿網外液Ca2+濃度下降的百分比

54.39±7.87*76.95±3.76▲95.52±2.12圖1-17注：與假手術組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。第三十五頁，共四十二頁。第三十五頁，共42頁。圖1-18家兔心肌肌漿網外反應液R值變化曲線假手術組辛伐他汀組心衰組第三十六頁，共四十二頁。第三十六頁，共42頁。5．討論大多數研究表明SERCA2a在心衰時基因和蛋白表達下降、活性降低；PLB表達減少。心衰時交感腎上腺素能神經系統(tǒng)興奮，高濃度兒茶酚胺長期慢性刺激引起心肌β-腎上腺能受體密度下調,cAMP水平降低，PKA活性下降，也有研究表明心衰時PKA的表達下降。另外，心衰時β-腎上腺能受體密度下調可以引起PP1抑制劑活性降低從而導致PP1α的表達和活性的增高。PKA表達減小、活性降低，PP1α表達增加、活性提高，引起PLB絲氨酸-16位點的磷酸化程度下降，對SERCA2a的抑制加強，進而導致SERCA2a活性降低，回攝鈣離子的能力下降，細胞漿內鈣離子增加，心肌的舒張功能降低。在SERCA2a活性降低的情況下，NCX(鈉鈣交換體)起到代償作用，NCX將細胞漿內鈣離子轉運出細胞增多，肌漿網回攝和儲存鈣減少，影響心肌的收縮功能。

第三十七頁，共四十二頁。第三十七頁，共42頁。心衰時PLB對SERCA2a間接調節(jié)作用下降的同時，CaMKⅡ的直接調節(jié)作用增加。其表現(xiàn)為CaMKⅡ表達和活性增加。但是CaMKⅡ的過表達又可引起心肌肥厚，進一步加重心力衰竭，形成惡性循環(huán)。本實驗結果顯示心衰組SERCA2a、PLBmRNA水平顯著下降，SERCA2a、PKA蛋白表達和活性降低，CaMKⅡ和PP1α蛋白表達增加，CaMKⅡ活性增加，肌漿網的攝鈣能力降低。肌漿網的攝鈣能力降低的原因一方面是因為SERCA2a蛋白表達下降；另一方面是因為PKA蛋白表達和活性下降以及PP1α蛋白表達增加可以引起PLB的去磷酸化程度增加，進一步引起SERCA2a活性下降。所以SERCA2a活性（下降了44.5﹪）和肌漿網的攝鈣能力（下降了43.1﹪）降低的程度較SERCA2a蛋白表達（下降了32.4﹪）下降的程度大，并不是與SERCA2a蛋白表達下降的程度平行。第三十八頁，共四十二頁。第三十八頁，共42頁。

研究表明血管緊張素Ⅱ可以引起心衰大鼠的SERCA2a表達和功能降低，氯沙坦可以提高心衰大鼠的SERCA2a表達和功能，群多普利可以提高心衰大鼠的PLB水平，奧美沙坦能增加心衰大鼠的SERCA2a、PLB和絲氨酸-16位點磷酸化的PLB的表達，都提示心衰時RAS系統(tǒng)參與引起了