生物制藥工藝學整理

生物制藥：以生物材料為原料或用生物技術、方法制造的藥物。雜交育種：將兩個基因型不同的菌株經過吻合或接合，使遺傳物質重新組合，從中分離和篩選出具有新性狀的過程。葡萄糖效應：培養(yǎng)基中的葡糖糖的濃度過高，會加快菌體的代謝，使培養(yǎng)基中的溶解的氧不能滿足有氧呼吸的需要，使葡萄糖的代謝進入不完全氧化途徑，產生酸性代謝產物，使pH降低，遏止某些產物的生物合成酶，這種現(xiàn)象叫做葡萄糖效應。濃差極化：當溶劑透過膜而溶質留在膜上時，它使得膜面上的溶質濃度增大高于主體中溶質濃度，這種現(xiàn)象稱為濃差極化。親和色譜：利用生物大分子于某些對應的專一分子特意識別和可逆結合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的色譜方法。次級代謝產物：與微生物的生長繁殖無關的代謝產物，包括：抗生素、色素、生物堿等。7初級代謝產物主要包括氨基酸，蛋白質，核酸核苷酸，維生素脂肪酸等特點：（1）他們是生物生長繁殖的必須物質（2）是各微生物所共有的產物（3）菌體對初級代謝活動有嚴格的調控系統(tǒng)一般不能累積多余的初級代謝產物。8次級代產物的特點：1特定菌種產生的代謝產物2菌體特定生長階段的產物3多組分的混合物。9初級代謝產物與次級代謝產物的關系（1）初級代謝產物是次級代謝產物的前體或起始物。（2初級代謝產物的調控影響次級代謝產物的生物合成10菌種選育的目的：提高發(fā)酵的產量。改進菌種的性能。產生新的發(fā)酵物。去除多余的組分。11.誘變育種：利用物理或化學誘變劑，處理均勻分散的微生物細胞群體，促進其突變率大幅度提高，然后采用簡便高效的方法，從中選出具有優(yōu)良性狀的突變菌株。12誘變劑分類物理誘變劑（紫外線UV），化學誘變劑（NTG），生物誘變劑。13自然選育的一般過程：生產菌種斜面，制備單抱子懸浮液，涂布分離平板，單菌落接種，斜面種子培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵，高產菌珠初選，菌種保藏，接種，斜面種子培養(yǎng)，搖瓶種子培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵，高產菌珠復選，高產菌種珠驗證，放大實驗，進一步選育或保障。14菌種分離的一般過程：樣品采取，增值培養(yǎng)，純種分離，生產性能測試。15原生質體融合的過程：遺傳標記的選擇，兩親本原生質體的制備體的融合，原生質體的再生和融合子的選擇。16培養(yǎng)基（medium）是人工配置的供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需多種營養(yǎng)物質的混合物。17培養(yǎng)基按狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基農業(yè)生產菌種和抱子的培養(yǎng)和保存廣泛應用于實體的真菌類，半固體培養(yǎng)基、加入少量瓊脂0.5%一0.8%微生物鑒定，液體培養(yǎng)基，80%-90%是水，有營養(yǎng)成分，工業(yè)大規(guī)模使用。18培養(yǎng)基的組成成分：碳源，氮源，硫源，無機離子，前體，誘導物，促進劑和抑制劑，水。19滅菌方法1高溫滅菌（干熱滅菌，濕熱滅菌是最基本的滅菌方法）2過濾除菌，3化學物質消毒和滅菌，4其他滅菌（輻射滅菌臭氧靜電除菌）20濕熱滅菌優(yōu)點：利用飽和蒸汽直接作用于需要滅菌的物品足以殺死微生物，蒸汽具有強大的穿透力，冷凝時釋放大量潛熱。濕熱滅菌比干熱效果好，經濟快速，蒸汽價格低廉來源方便，滅菌效果可靠。21影響培養(yǎng)基滅菌的因素：濕熱滅菌的原理溫度和時間，培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)基的PH培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，泡沫，培養(yǎng)基的微生物數(shù)量★t=-1/klnNt/No=-2.303/klgNt/No注意k的單位換算。N0滅菌開始的活菌數(shù)，Nt殘留的活菌數(shù)。滅菌常數(shù)k與滅菌溫度T的關系k=A*e-AE/RT.A-X菌反應的阿雷尼烏斯常數(shù)，E一一滅菌產生的活化能，R--氣體常數(shù)為8.314/（mol*k）22無菌檢查的方法1顯微鏡檢查2平板劃線法3肉湯培養(yǎng)法4斜面培養(yǎng)法23染菌的原因分析：種子帶菌，空氣帶菌，設備滲漏，滅菌不徹底，操作失誤和管理不善等是造成污染雜菌的普遍原因24影響種子的因素：1培養(yǎng)基2培養(yǎng)條件3種齡4接種量25發(fā)酵過程：當具備了發(fā)酵生產所需的條件首先在一定的發(fā)酵條件下發(fā)酵的直接產物是發(fā)酵液對發(fā)酵液樣品及其他發(fā)酵的參數(shù)進行抽樣檢測，可以得到與發(fā)酵液相關的各種信息，然后經過對這些信息進行歸納分析，給出相應的調控指令調整發(fā)酵條件，并有相應的執(zhí)行機構執(zhí)行調控指令。26菌種保藏的目的：是盡可能保持菌種的存活率和優(yōu)良性能，保證菌種經過較長時間的保藏后存活和生產能力。菌種保藏對于基礎研究和實際應用具有重要意義，在基礎研究中，菌種保藏可以保證研究結果具有良好的重復性，對于經濟價值的生產菌種，好的保藏條件保證菌種的高產穩(wěn)產，有利于生產的連續(xù)和穩(wěn)定。27菌種保藏的原理：根據(jù)微生物的生理特性人為的創(chuàng)作條件，使微生物處于代謝不活躍生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)以減少菌種的變異退化死亡污染，有利于微生物的休眠條件是低溫，干燥，缺氧和缺乏營養(yǎng)物質。28菌種的保藏方法：斜面保藏法，液體石蠟保藏法，沙土管保藏法，麩皮保藏法，冷凍干燥保藏法，液氮低溫保藏法，甘油保藏法，抱子濾紙保藏法。29斜面保藏法：對科研教學工作中與教學工作不需要長期保存的菌種更是方便，特別是不宜用冷凍干燥保藏的菌種斜面保藏較好。相對濕度為50%—70%的環(huán)境中且斜面菌種應保藏相繼三代的培養(yǎng)物以便對照防止發(fā)生污染和意外。30斜面保藏的優(yōu)點：簡便易行成本低，隨時能觀察菌株是否死亡變異或染菌。缺點是由于斜面含有營養(yǎng)和水分菌種的生長和繁殖還沒有完全代謝活動能微弱進行，因此存在突變的可能性，短期內多次傳代易引起菌種變異和退變污染雜菌的機會也隨之增加。31發(fā)酵方法類型按投料方式分類（1分批發(fā)酵2補料分批發(fā)酵3連續(xù)發(fā)酵）按與氧的關系分類（1需氧發(fā)酵2厭氧發(fā)酵）按照發(fā)酵動力學參數(shù)的關系分類（1生長偶聯(lián)型2部分生長偶聯(lián)型3非生長偶聯(lián)型）32、 鹽析法：在生化物質的提取和純化過程中，目的生物物質常以溶質形式存在于溶液中，通過向這些溶質中加入不同濃度的中性鹽，使不同性質的目的物分別從溶液中沉淀出來的分離技術叫做鹽析法。33、 等電點沉淀法：利用大分子兩性電解質在等電點時溶解度最低的原理而建立的分離法34、 凝膠色譜分離法：指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質量（Mr）不同而達到物質分離的一種技術。35、 生物制藥工藝學：生物制藥工藝學是一門新興的現(xiàn)代制藥工藝學，是從事各種生物的研究、生產和制劑的綜合應用科學。36、 鹽析：當所含鹽濃度增大時，蛋白質或酶則可能從溶液中沉淀析出，此現(xiàn)象稱鹽析。37、 脂質類藥物：有些脂質具有特定的生理、藥理效應，并巳用于疾病的防治，稱為脂質類藥物。38、 現(xiàn)代生物技術藥物：將生物體內生理活性物質的基因分離或者人工合成，利用重組DNA技術加以改造，然后時其在細菌、酵母、動物細胞或轉基因動物中大量表達，通過這種生產的新型藥物稱為生物技術藥物。39、 生長因子：細胞生長調節(jié)因子又稱生長因子，是由細胞產生的蛋白質和多肽類物質，在體內和體外，能夠通過與靶細胞的特異性質膜受體相結合，調節(jié)細胞的生長、增值和分化。40前體（precursor）在微生物藥物的生物合成中，有些化合物能直接被微生物利用構成產物分子結構的一部分，而化合物本身的結構沒有太大的變化。41膜分離法:是依靠膜的選擇性將液體中的組分進行分離的方法，它包括微濾、超濾、反滲透、透析、電滲析。其中超濾是利用膜阻滯大分子透過，通過篩分把各種分子量的溶質分開。它可分離的分子量范圍從3000-1000000道爾頓，膜的孔徑為1-20nm。主要在蛋白質分離、濃縮、去熱原等方面起作用。42沉淀法（precipitation）是通過改變溶液的物理變化參數(shù)，降低溶液中的某些成分法溶解度，從而使其從固體凝聚物從溶液中沉淀出來并與其它成分分開的技術。43色譜法:又稱層析法主要是指多種組分的混合物在固定相和流動相中有不同的分配，在流動過程中經過多次分配后而獲得分離。44凝膠色譜（gelchromatographyGFC）是指各種多空凝膠為固定相，利用流動相中所含的各分子組分大小的不同而使其分離的一種技術。45親和色譜（affinitychromatographyAC）是利用生物大分子與某些對應的專一分子特異性識別和可逆結合的特性而建立的一種分離生物大分子的分離方法46疏水相色譜（HIC）是利用蛋白質表面存有的疏水性部位，與帶有疏水性配基的載體在高鹽濃度結合，洗脫時將鹽濃度逐漸降低，蛋白質因疏水性不同而逐個先后被洗脫。47基因工程藥物是指利用基因工程技術研制和生產的藥物，主要包括重組蛋白質藥物、多肽藥物、反義核酸藥物、DNA藥物和基因工程抗體等。48溶劑萃取法（solventextraction）是指經典的液-液萃取，即用有機溶劑對非極性或弱極性的物質，物質進行萃取，這是一種利用物質在兩種互不相容的液相中分配特性不同而進行的分離過程。49雙水相萃取法（two-aqueousphaseextraction））又稱水溶液兩相分配技術（partitionoftwoaqueousphasesystem）它是不同的高分子溶液相互混合產生的兩相或多相系統(tǒng)利用物質在相互不容法兩相間分配系數(shù)的不同來進行萃取的方法簡述生物制藥的一般工藝過程。菌種一斜面培養(yǎng)…種子制備…發(fā)酵…發(fā)酵液預處理…提取精制…成品檢驗…包裝離子交換層析的原理是什么？離子交換層析是根據(jù)溶液中各種電點顆粒與離子交換劑之間結合力的差異而進行的分離的技術。由于待分離的溶質分子帶有不同性質的電荷和不同電荷量，因而在作為固定相的離子交換劑和流動相的洗脫液之間發(fā)生可逆交換作用，并通過調節(jié)洗脫液的PH值，或改變同性離子濃度等方法，使溶質分子移動的速度發(fā)生變化，從而達到分離的目的。凝膠色譜分離法的優(yōu)點：（1）操作條件溫和，簡便易行；（2）分離Mr范圍廣；（3）分離效果一般不受緩沖液組成的影響；（4）操作一次后無需再生即可進行下一次的分離工業(yè)生產中制備過飽和溶液的方法：蒸發(fā)法，冷卻法，化學反應結晶法，鹽析結晶法，等電點法，復合法，共沸蒸餾結晶法。細胞破碎的方法有哪些？（1）機械法：高壓勻漿法、高速珠磨機、高速組織搗碎機、研磨法、超聲波振蕩器（2） 非機械法：化學法、酶解法（3） 物理法：滲透壓沖擊法、凍融法、干燥法生物技術下游加工過程的特點是什么？（1） 發(fā)酵液中所含的欲分離的生物物質的濃度低（2） 欲分離的生物物質的生物穩(wěn)定性差（3） 各批發(fā)酵液之間的差異大（4） 要求處理除去熱原和具有免疫原性的物質7..結晶的過程及影響結晶體大小的因素：結晶是指溶質自動從過飽和溶液中析出形成新相的過程。影響因素：（1）過飽和度（2）溫度（3）攪拌速度（4）晶種影響鹽析沉淀效果的因素：（1）鹽的性質（2）pH（3）鹽的飽和度（4）蛋白質濃度（5）溫度維生素C的二步發(fā)酵法制備工藝路線葡萄糖f（H2）d-山梨醇f（O2醋酸桿菌）L-山梨糖…（假單胞菌）2-酮-L-古洛糖酸…（內酯化，稀醇化）L-抗壞血酸10胰島素的制備工藝路線注：（）中內容為條件豬胰f（刨碎）f胰片f（乙醇，草酸，提?。ゝ酸醇提取液f（氨水堿化）f堿化液f（硫酸酸化）f酸性液f（減壓濃縮）f濃縮液^（脫脂）f溶液f（氯化鈉鹽析）f鹽析物粗品f（除酸性蛋白）f濾液f（鋅沉淀）f沉淀f（除堿性蛋白，結晶）f結晶f（洗滌）f成品天冬氨酸的制備工藝路線。注：（）中內容為條件延胡索酸+NH3f（固定化天冬氨酸酶，轉化）f轉化液f（分離）fL-天冬氨酸粗品f（純化）fL-天冬氨酸精品ATP-Na2的制備工藝路線兔肌f（攪碎-冰浴，降溫）f兔肉糜f（原料處理-乙醇，30min）f變性兔肉糜f（熱醇處理-乙醇沸5min）f兔肉餅一（脫水-乙醇10度以下）f兔肉松f（提取-蒸餾水）f提取液f（樹脂吸附）f吸附物f（洗脫-氯化鈉）一洗脫液一（除熱原與雜質）f濾液f（結晶與干燥）fATP-Na2胱氨酸：豬毛f（HCl）f水解液f（NaOH）fL-胱氨酸粗品f（HCl活性炭）f濾液f（NaOH）fL-胱氨酸粗品f（HCl活性炭）f濾液f（氨水）fL-胱氨酸10Vb2：培養(yǎng)基f斜面f抱子懸浮液f一級種子液f二級f發(fā)酵液f3-羥基-2-奈甲酸鈉核黃素f3-羥基-2-奈甲酸核黃素f核黃素溶液f氧化物f核黃素粗品f粗結晶f濾液f結晶f成品異亮氨酸：培養(yǎng)液f滅菌培養(yǎng)液f發(fā)酵液f長層液f濾液f洗脫液…濃縮液f濾液f濃縮液f沉淀f結晶fL-異亮氨酸13論述液氮超低溫保藏法保藏菌種的操作過程和該方法的特點（1）操作過程：將菌種加入10%的甘油或5%的二甲基亞砜作為防凍保護劑；每個安甑管或液氮包藏管分裝1ml的菌懸液，立即封口，封口后嚴格檢查不能有裂紋。合格的管以每分鐘1°C的速度冷凍到-25°C后再放入液氮罐，在-150°C—-196°C的溫度下保存。細胞復蘇時應快速解凍（2）特點：①適合不能采用冷凍干燥法保藏的菌種②保藏對象廣泛，幾乎所有的微生物及動植物細胞均可保藏③對各種培養(yǎng)形式的微生物均能進行保藏④保藏期限長，可達15年以上⑤有效、可靠14論述鹽析分離法的操作及影響鹽析效果的因素。（1）操作過程：中性鹽的選擇，pH的選擇，溫度、時間的控制，鹽飽和度的控制影響因素：①鹽的性質②pH值③鹽的飽和度④蛋白質的濃度⑤溫度15.論述親和色譜分離法的機理及操作過程：（1）機理：利用生物大分子于某些對應的專一分子特意識別和可逆結合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的色譜方法。（2）操作過程：①吸附②沖洗③洗脫④平衡18微生物發(fā)酵類型：（1）投料方式：分批，補料分批，連續(xù)（2）與氧的關系：需氧，厭氧（3）發(fā)酵動力學參數(shù)的關系：生長偶連型，部分生長偶連型，非生長偶連型19超臨界流體萃取法影響因素，應用：（1）影響：壓力，溫度，夾帶劑，不同溶質在SC-CO2流體中的溶解度（2）應用：超臨界干燥和制粒，除雜，滅菌，重結晶。氨基酸、甾醇小分子萃取，蛋白質、酶大分子萃取，去除殘留溶劑20雙水相萃取法原理，影響，應用：（1）原理：物質在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異（2）影響：成相高聚物濃度-界面張力，分子量，電化學分配-鹽類，生物親和的分配，疏水效應，溫度及其它（3）應用：粒子濃縮，萃取胞內酶，雙水相酶法，萃取干擾素21離子交換法原理，影響，應用：（1）應用合成的離子交換樹脂作為吸著劑，將溶液中的物質依靠庫倫力吸附在樹脂上，用合適的洗脫劑將吸著物從樹脂上洗脫下來，達到分離濃縮提純目的（2）影響：水合離子半徑，離子化合價，溶液PH，交聯(lián)度、膨脹度、分子篩，樹脂和交換離子之間的輔助力，有機溶劑的影響（3）應用：提取鏈霉素，大青霉素，四環(huán)素類抗生素，青霉素；血清蛋白DEAE纖維素柱色譜，從大腸桿菌周質中提取重組hGH22吸附分離法：在一定pH條件下吸附生物樣品中的生物藥物，以適當洗脫劑洗脫，達到濃縮提純目的。23常用吸附劑：活性炭，漂白土，硅膠，氧化鋁，纖維素，大孔網狀聚合物吸附劑24大孔網狀吸附劑原理，應用：（1）一種非離子型共聚物，借助范德華力從溶液中吸附各種有機物質（2）應用：大環(huán)內酯類抗生素分離純化，頭抱菌素類抗生素，林可霉素類及其他抗生素，核酸類25有機溶劑沉淀法影響，應用：（1）影響：溫度，pH值，蛋白質濃度，無機鹽離子濃度，金屬離子（2）應用：乙醇沉淀法26膜分離法原理，應用，影響因素：（1）具有特定性質的半透膜，選擇性透過一種物質阻礙另一種物質（2）影響：膜的化學性質，蛋白質種類和溶液pH值，無機鹽，溫度，料液濃度、流速與壓力（3）應用：發(fā)酵液的過濾和細胞收集，蛋白質物質的濃縮和精制，多糖類物質的精制27四環(huán)素：金色鏈霉素生產菌種（母瓶斜面）母瓶斜面抱子（子瓶斜面）子瓶斜面抱子（種子罐）種子培養(yǎng)液（發(fā)酵罐）發(fā)酵液（酸化過濾）濾液（氨水）四環(huán)素粗堿（15倍丁醇，鹽酸）丁醇液（氨水）結晶液（分離洗滌）濕四環(huán)素（氣流干燥）四環(huán)素堿（尿素復鹽結晶，過濾）四環(huán)素-尿素復鹽（溶解復鹽，過濾）丁醇液（結晶）結晶液（過濾洗滌）濕結晶（固定床氣流干燥，過篩）四環(huán)素鹽酸鹽成品28肌昔:變異芽胞桿菌（菌種斜面）菌種斜面（搖瓶）一級種子培養(yǎng)液（50升發(fā)酵罐）二級種子培養(yǎng)液（發(fā)酵）發(fā)酵液（500升發(fā)酵罐擴大發(fā)酵）發(fā)酵液（20000升罐）發(fā)酵液（提取）吸附物（水洗脫）洗脫液（吸附）吸附物（蒸餾水洗滌）（氫氧化鈉洗滌）洗脫液（濃縮結晶）肌昔粗品（精制）肌昔成品29產氨短桿菌（斜面培養(yǎng)）活化種子（斜面培養(yǎng)）茄瓶種子（種子培養(yǎng)基）一級種子（發(fā)酵培養(yǎng)）發(fā)酵液（補前體，酶反應）CoA合成液（大孔樹脂吸附）CoA洗脫液（真空濃縮）CoA濃縮液（水提純）CoA-Cu沉淀（離心）CoA-Cu（還原）CoA還原液（離心）上清液（真空濃縮）濃縮液（凝膠色譜）CoA液（濃縮）濃縮液（還原）CoA還原液（丙酮）CoA沉淀（真空干燥）CoA沉淀（真空干燥）CoA干燥品（檢驗）成品分裝30簡述發(fā)酵工藝過程工藝參數(shù)的控制物理參數(shù)（溫度，壓力，攪拌速度，攪拌功率，空氣流量，表觀粘度）化學參數(shù)（PH2基質濃度）生物參數(shù)菌體濃度：菌體干重，菌體濕重，菌體濕體積。菌絲形態(tài)：形狀粗細染色的深淺，脂肪顆粒，空泡。31溫度對發(fā)酵的影響：1溫度影響酶的活性2溫度影響發(fā)酵液的物理性質3溫度影響代謝產物合成的方向32ph對發(fā)酵的影響:發(fā)酵培養(yǎng)基的ph對微生物菌體的生長及產物的合成具有嚴重的影響，也是影響發(fā)酵過程中各種酶活的重要因素。1ph影響酶的活性2ph影響基質或中間產物的解離狀態(tài)3ph影響發(fā)酵的穩(wěn)定性33發(fā)酵ph的確定和控制：一確定：1根據(jù)不同的發(fā)酵階段微生物的發(fā)酵ph范圍一般是在5——82根據(jù)發(fā)酵試驗的結果來確定最適的ph二控制：1調整發(fā)酵培養(yǎng)基的組成2通過補料控制ph。3在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入ph緩沖劑4通過改變發(fā)酵條件控制ph。5直接加酸或堿34什么是一級種子？抱子接入體積較小的種子罐中，經培養(yǎng)后形成大量的菌絲把一級種子接入到發(fā)酵罐內發(fā)酵稱為二級發(fā)酵。將抱子直接接入發(fā)酵罐內進行發(fā)酵稱為一級發(fā)酵。35基因工程的基本步驟：目的dna制備載體DNA選擇DNA體外重塑技術重組DNA的轉化試驗重組克隆的篩選和鑒定，目的基因表達產物的篩選和鑒定。36生物分離純化方法的選擇依據(jù):1目標物的理化性質和穩(wěn)定性2各種分離純化方法的適用領域3分離純化技術的分離效率4生產成本5分離純化的依據(jù)6各種分離純化的組合順序。37深層過濾深層過濾中物料的性質及介質的性能對過濾效率的影響表現(xiàn)在1過濾效率與物料的密度形狀有關2過濾介質的空隙越不規(guī)則，比表面積越大，彎道越多，過濾效果越好3流速越高，過濾效越低，4料漿溫度升高，粘度降低，濾液質量隨之升高5對于遷徙過程中重力起主導作用的過濾上流式與下流式過濾的效率無差異。38助濾劑的使用方法有兩種1用助濾劑配成的懸浮液2將助濾劑混在泥漿中一起過濾。39超濾和微濾是簡單的篩分過程，溶質或懸浮物料按照大小不同而分離，比膜孔小的物質和溶劑（水）一起通過膜。而較大的物質則被截留。40超濾技術的優(yōu)越性可以簡單的歸納為1操作過程不需要熱處理故對熱敏感的物質是安全的，2沒有相的變化能耗低3濃縮和純化可以同時完成4分離過程不需要加入化學試劑5設備和工藝較其他分離純化的方法簡