儀器分析熒光一

儀器分析課件熒光一第一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)概述

某些物質(zhì)受到光照射時，吸收某種波長的光之后，會發(fā)射出比原來吸收波長更長的光，當(dāng)激發(fā)光停止照射，這種光線也隨之消失，此種光稱為熒光(fluorescence)。第二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五含有少量Cr3+的釔鋁石榴石綠色晶體用蘭色激光照射石榴石綠色晶體時,Cr3+吸收蘭光并輻射出能量較低的紅色熒光.晶體的熒光現(xiàn)象第三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五熒光分析法x?射線熒光分析法紫外?可見熒光分析法

紅外熒光分析法根據(jù)激發(fā)光的波長范圍

分子熒光分析法

原子熒光分析法化學(xué)發(fā)光光致發(fā)光

根據(jù)激發(fā)所用能源

根據(jù)待測物質(zhì)的存在形式

第四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五優(yōu)點：A.靈敏度高，檢出限10-10~10-12g/ml（紫外：10-7g/ml)B.選擇性好。

C.試樣量少和方法簡便

D.提供比較多的物理參數(shù)缺點：應(yīng)用范圍較窄干擾因素多第五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五二、基本原理

在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；自旋量子數(shù)：1/2;-1/2;單重態(tài)：2S+1=1三重態(tài)：2S+1=3第六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五第七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷第八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五振動弛豫：從同一電子能級的各較高振動能級逐步返回到最低振動能級。內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換：兩個電子能級之間的能量轉(zhuǎn)換。外部能量轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其它榮指分子相互作用及能量轉(zhuǎn)移。體系間跨越：指不同多線態(tài)間的無輻射躍遷。第九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大；熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；第十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五第二激發(fā)態(tài)單線態(tài)基態(tài)第一激發(fā)態(tài)單線態(tài)第一激發(fā)態(tài)三線態(tài)S1VnT1S0S2λ′λ1(f)磷光(d)熒光(a)吸收V1V4V3V2(b)振動馳豫(b)λ2V0(e)體系間跨越V0V0V0V2V2V2V4V4V4V3V3V3V1V1V1圖13-1熒光與磷光產(chǎn)生示意圖（c）內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換第十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為2的熒光；10-7～10-9s。

由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；

第十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）；發(fā)射波長為’2的磷光電子由S0進入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1

發(fā)光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持續(xù)一段時間?！?>2>1；第十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五第十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五三、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

熒光物質(zhì)分子都具有兩個特征光譜，即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）。激發(fā)光譜：固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關(guān)系曲線。

激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大；第十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。第十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2

,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能第十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如’2

)。但是熒光強度與激發(fā)波長有關(guān)。吸收越強，發(fā)射熒光強度越大，故常選最大激發(fā)波長光作激發(fā)光

c.鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。第十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五第十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)

熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系第二十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五一、分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（一）熒光物質(zhì)的必要條件分子產(chǎn)生熒光，必須具備兩個條件：（1）物質(zhì)分子必須有強的可見-紫外吸收分子結(jié)構(gòu)應(yīng)具有共軛結(jié)構(gòu)（或含不飽和雜原子基團），產(chǎn)生躍遷或躍遷*pp*pn第二十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五（2）分子吸收輻射能后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。即熒光效率（）應(yīng)足夠大。通常：0<<1

fj吸收激發(fā)光的量子數(shù)發(fā)出熒光的量子數(shù)=fjfj第二十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五（二）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1.躍遷類型：K帶強吸收激發(fā):

發(fā)射:2.長共軛結(jié)構(gòu)物質(zhì)，易產(chǎn)生共軛程度越大，產(chǎn)生熒光強度越強，熒光效率越大，波長長移。強pp?*第二十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五例：苯萘蒽9-乙烯蒽

λex205286356λem278321404432φf0.110.290.360.76

共軛鍵越長，熒光強度越大，熒光波長長移。CH=CH2第二十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五3.分子剛性和共平面性結(jié)構(gòu)（剛性共平面結(jié)構(gòu)）大多數(shù)具有剛性共平面結(jié)構(gòu)的有機物具有強烈的熒光例：聯(lián)苯芴CH2第二十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五例

酚酞熒光極弱

熒光素?zé)晒鈴娏褻OC=OHOOHCOC=OOHOOH第二十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五

例1：哪個熒光強度強？

8-羥基喹啉8-羥基喹啉鎂NONOHMg1/2弱熒光物質(zhì)強熒光物質(zhì)第二十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五1-二甲胺基-7-磺酸鹽1-二甲胺基-8-磺酸鹽SO3NaNCH3CH3SO3NaCH3NCH3（位阻效應(yīng)）φf=0.75φf=0.03第二十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五C=CHHC=CHH反式二苯乙烯順式二苯乙烯有強熒光無強熒光第二十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五4.取代基（1）對共軛體系作用大的給電子基團，增加共軛效應(yīng)，使熒光效率增強，熒光波長長移。例：-OH，-OR，-NH2，-CN，-NR2等飽和雜原子基團。第三十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五（2）對共軛體系作用大的吸電子基團，減弱π電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。例：-COOH，-NO2，-C=O，

-NO，-SH，-NHCOCH3，

-F，-Cl，-Br,-I等。第三十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五OHNO2熒光波長270~310285~365nm熒光強度10180例：第三十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五（3）對共軛體系作用效小的基團，對熒光的影響不明顯。例：-R，-SO3H，-NH3。第三十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五三、影響熒光強度的外部因素1、溶劑一般：溶劑極性增大，熒光強度增大，波長長移。溶劑粘度減小，熒光強度減弱。第三十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五8-巰基喹啉的熒光峰位置和熒光效率與溶劑介電常數(shù)的關(guān)系溶劑介電常數(shù)熒光峰位λnm熒光效率φfCCl42.243900.002

CH3Cl5.23980.041丙酮21.54050.055乙腈38.84100.064第三十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五2、溫度溫度升高，熒光強度下降第三十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五3．溶液PH值

PH值會影響酸或堿的離解，因此，PH值不同，物質(zhì)熒光強度也不同例

pH<2不發(fā)光pH>13不發(fā)光pH7~12藍色熒光適宜酸度：pH7~12NH3+NH2NH-OH-H+OH-H+第三十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五4．氫鍵的影響5．散射光的干擾散射光：當(dāng)一束平行的光照射在液體樣品上，大部分光線透過溶液，小部分光線由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變，而向不同角度散射，這種光稱為散射光。第三十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五散射光有兩種：

瑞利光：光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞時，不發(fā)生能量交換，僅是發(fā)生運動方向改變拉曼光：光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時，光子的運動方向及能量均發(fā)生改變，這種散射光稱拉曼光。第三十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五

瑞利光波長與激發(fā)光波長相同

拉曼光波長比激發(fā)光波長長。消除拉曼光干擾的方法是：測量時選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長第四十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五ab熒光強度300400500λnm圖13-3硫酸奎寧的激發(fā)光譜及熒光光譜a、激發(fā)光譜b、熒光光譜320nm350nm第四十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五圖12一-6硫酸奎寧與空白溶劑在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜320nm360nm448nm激發(fā)光320nm硫酸奎寧350nm400nm350nm320nm360nm448nm激發(fā)光350nm硫酸奎寧激發(fā)光320nm0.01mol/LH2SO4激發(fā)光350nm0.01mol/LH2SO4第四十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五思考題如何區(qū)別熒光、磷光、瑞利光和拉曼光？第四十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五6.熒光熄滅劑

熒光熄滅：指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象

熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑第四十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五例：-X，Cu2+、Zn2+等。

O2、-NO、-COOH等1、碰撞，損失能量2、相互作用生成不發(fā)光的配合物3、引入溴或碘，發(fā)生體系間的跨越4、O2的氧化，或氧分子的順磁性促進體系間的跨越，單線態(tài)轉(zhuǎn)至三線態(tài)。5.熄滅劑分子和熒光物質(zhì)分子間的相互作用有選擇性。第四十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五7.表面活性劑的影響

表面活性劑形成的膠束溶液，有增溶、增穩(wěn)和增敏作用，可大大提高熒光分析法的靈敏度和穩(wěn)定性。第四十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)熒光分光光度計第四十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五光源激發(fā)單色器樣品池檢測器發(fā)射單色器I0狹縫表面吸光物質(zhì)狹縫狹縫放大器指示器記錄器第四十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五儀器結(jié)構(gòu)流程

測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角，樣品池四面透光。光源：強度大，高壓氙燈、汞燈、氙－汞弧燈、閃光燈和激光器，應(yīng)用最廣泛的是高壓氙燈。檢測器：光電倍增管。第四十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五二、儀器類型：1）濾光片熒光計（930）

2）濾光片——單色器熒光計

3）熒光分光光度計第五十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五

光源第一濾光片光欄樣品池第二濾光片光欄檢測器放大及記錄光電熒光計示意圖（930型）第五十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五儀

器

光

路

圖第五十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五三、熒光計的校正1、波長校正用汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線來校正2.靈敏度校正靈敏度：用檢出限表示檢出限：用某一標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)的稀溶液在一定激發(fā)波長的照射下，能發(fā)射出最低信噪比時的熒光強度的最低濃度第五十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五靈敏度影響因素：（1）光源強度（2）單色器（包括透鏡、反射鏡等)的性能（3）放大系統(tǒng)的特征（4）光電信增管的靈敏度（5）測定波長狹縫寬度溶劑的Raman散射激發(fā)光、雜質(zhì)熒光第五十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五

由于熒光光度計靈敏度的影響因素很多，因此，每次測定時先用一種穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，配成濃度一定的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行校正,（調(diào)50%或100%）（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液本身（熒光穩(wěn)定）（2）硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液（1μg/ml,0.05mol/LH2SO4溶液）第五十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五3、激發(fā)光譜和熒光光譜的校正目前多采用雙光束光路.第五十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五第五節(jié)

定性與定量第五十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五一、定性分析

一般用純品作為對照測定激發(fā)光譜和熒光光譜或光譜數(shù)據(jù)（λex和λem）進行定性。二、定量分析1.熒光強度與濃度的關(guān)系低濃度時：F=KC第五十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五

由于熒光物質(zhì)是在吸收光能而被激發(fā)之后才發(fā)射熒光的，因此，溶液的熒光強度與該溶液中熒光物質(zhì)吸收光能的程度以及熒光效率有關(guān)。溶液中熒光物質(zhì)被入射光激發(fā)后，可以在溶液的各個方向觀察熒光強度。第五十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五推導(dǎo)：在與入射光垂直的方向上測量熒光強度，為了消除入射光和散射光的影響。I0IF第六十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五1、熒光強度正比于吸收的光強度與熒光量子數(shù)：吸收的光強度2、依據(jù)Lambert-Beer定律：第六十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五式中()()+..-+-+-+=-3303.223.21)3.2(13213.2EClEClECleECl﹗﹗﹗時當(dāng)05.0￡ECl第六十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五

當(dāng)入射光強度I0一定，則

注：只有濃度極稀的條件下，上式才成立第六十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五熒光分析法：定量依據(jù)：F=KC

靈敏度取決于：儀器靈敏度1、燈源強度大：氙燈，高壓汞燈。2、高靈敏度的檢測器：改進光電倍增管和放大系統(tǒng)，放大熒光強度第六十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五紫外-可見分光光度法：定量依據(jù)：A=ECl=kCA=-lgT=-lgI/I0

檢測的是

I/I0

，即使放大光強信號，I/I0比值仍然不變，對提高檢測靈敏度不起作用，故：紫外-可見分光度法靈敏度低于熒光分析法靈敏度第六十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五（二