實(shí)驗(yàn)六質(zhì)粒的提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測

實(shí)驗(yàn)一

質(zhì)粒的提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測(高純質(zhì)粒小量制備試劑盒方法,百泰克)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私飧呒冑|(zhì)粒小量制備試劑盒和堿法提取質(zhì)粒的原理掌握百泰克高純質(zhì)粒小量制備試劑盒方法提取質(zhì)粒的方法二、實(shí)驗(yàn)原理

(百泰克高純質(zhì)粒小量制備試劑盒方法)

本試劑盒在室溫儲(chǔ)存18個(gè)月不影響使用效果。

一、原理簡介

本試劑盒采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低PH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

實(shí)驗(yàn)原理（堿法）質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體外的、具有自主復(fù)制能力的、共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的小型DNA分子。堿裂解法提取質(zhì)粒是實(shí)驗(yàn)室常用的方法。這種方法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在堿性條件（pH12.5）下，線性染色體DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的氫鍵雖然斷裂但兩條互補(bǔ)鏈彼此纏繞，緊密結(jié)合在一起。當(dāng)加入乙酸鉀恢復(fù)至中性時(shí)，染色體DNA分子難以復(fù)性，而質(zhì)粒DNA分子很快復(fù)性，離心時(shí)染色體DNA與細(xì)胞碎片一起被沉淀出來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到較純的質(zhì)粒DNA。載體結(jié)構(gòu)的三大要素：

多克隆位點(diǎn)選擇標(biāo)記（耐藥性，LacZ）獨(dú)立的復(fù)制單位載體種類：

質(zhì)粒噬菌體酵母人工染色體（YAC）反轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)載體等pBCSKmap三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑

（一）儀器

恒溫?fù)u床超凈工作臺(tái)高壓滅菌鍋高速臺(tái)式離心機(jī)微量取液器、1.5mLEP管LB液體和固體培養(yǎng)基卷紙、無水乙醇、雙蒸水（二）材料和試劑含pUM-T(pMD18-T或KS，pRT101)質(zhì)粒的大腸桿菌DH10B（DH5α或HB101）。含外源基因的重組pUM-T(pMD18-T或KS，pRT101)質(zhì)粒的大腸桿菌DH10B（DH5α或HB101）。氨芐青霉素（Amp）：用無菌水配制成50-100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

pMD18-TVector

LB液體培養(yǎng)基（1L）：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g。加去離子水至800ml攪拌，使溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1升，高壓蒸汽滅菌20分鐘。5.LB固體培養(yǎng)基（1L）：

在上述LB液體培養(yǎng)基（1L）中加入瓊脂粉(Agar)15g。四、實(shí)驗(yàn)步驟

百泰克高純質(zhì)粒小量制備試劑盒

第一交次使享用前沉請(qǐng)先盛在15垮ml飾(25停ml)漂洗木液WB中加浸入45徐ml參(75快ml)無水般乙醇!將RN謝as仙eA全部該加入叔溶液P1中，混勻，每魔次使叫用后書置于2-留8℃保存。取1.拔5-密4.隆5毫升過夜冷培養(yǎng)號(hào)的菌赤液，90福00這rp撲m，離危心30秒，棄上旁清，巡壽收集疾菌體，晉盡可纏能的倒干卻上清。處理逃超過1.啄5毫升緣瑞菌液蠟可以濟(jì)離心蛙去上插清后僵，在展同一貍個(gè)1.栗5m組l管內(nèi)摘加入啟更多或的菌唯液，名重復(fù)輕步驟1，直攀到收艙集到紫足夠伴的菌秋體。2.用25蛛0μl溶液P1重懸危菌體坦沉淀，渦旋神振蕩至徹系底懸麥浮。如果循有未范徹底亡混勻陰的菌鴿塊，番會(huì)影偽響裂辛解，欣導(dǎo)致葵提取旱量和年純裂度偏薦低。3.加25拐0μl的溶覆液P2，溫和昂的上下丘翻轉(zhuǎn)6-寬10次使菌嬸體充分蘋裂解，直憐到溶椅液變?nèi)们辶?。溫和穩(wěn)的混臭勻，伸不要暖劇烈變震蕩體，以免表基因絮組DN萬A剪切僅斷裂揚(yáng)！所用門時(shí)不應(yīng)憲超過5分鐘！以稍免質(zhì)芹粒受新到破兵壞。儲(chǔ)此時(shí)包菌液幅應(yīng)變艙得清亮好粘稠，如薯果菌甩體少判，很渡快清影亮粘旬稠后素就可歡以做科下一勤步。4.加40賽0μl溶液P3，立即文溫和的上熔下翻妥轉(zhuǎn)6-塌10次，室印溫放置5分鐘。室膽溫13，00藝0r粥pm離心10分鐘，小心取上拿清。5豪.竿(將吸附燦柱安置斜于收集詠管上，窯加入50砌0μl溶液P4，室然溫13唉,0魄00絞rp湊m離心1分鐘，棄習(xí)濾液島；)將上一濱步所籍得上炕清液加入墨吸附映柱AC中（青吸附強(qiáng)柱放所入收糕集管或中）嘩，13護(hù),0怠00蛋rp盆m離心1分鐘，棄夠?yàn)V液者。6.加入50噴0μl去蛋叛白液PE，13傻,0御00證rp手m離心30班-6馬0秒，棄應(yīng)濾液融。此步萬驟為辟了去除勺痕量綠核酸崗酶等雜缺質(zhì)，覆如所旅用翼菌株鑼為JM系列祝、HB裁10罰1等，身因?yàn)橐毯怂釓B酶含距量豐梁富，崗應(yīng)加衰此步缸驟；尊如所怨用菌彩株為XL堆-1紹B機(jī)lu核e和DH橫5α等，街核酸紅酶含議量低框，則冒可忽蒜略此寺步驟談。加入50好0μl漂洗釣液WB（請(qǐng)輩先檢舌查是響否已狡加入無水服乙醇！）執(zhí)，13墨,0膽00浙rp趨m離心30渣-6辜0秒，棄貌濾液拐。重復(fù)步驟7一次腦，13現(xiàn),0嗓00末rp恢m離心30穴-6驢0秒，棄位濾液廚?？罩?3滾,0臘00聾rp敢m離心2分鐘。室溫放置3-層5分鐘，除窗去殘央留乙及醇。9.取出漲吸附匹柱AC，放則入一宴個(gè)干扣凈的右離心堵管中晃，在吸附核膜的中間慕部位加60模-1暮00μl洗脫杰緩沖鄉(xiāng)豐液EB或雙蒸修水（洗鑼脫緩究沖液冠事先特在65發(fā)℃-項(xiàng)70扁℃水浴第中加或熱效呀果更好正）,室溫放置1分鐘，13志,0株00暑rp鍬m離心1分鐘洗脫料質(zhì)粒DN傅A(chǔ)，可欣立即廊用于擁下游汪分子釘生物教學(xué)實(shí)啞驗(yàn)或-2堵0℃保存極。洗脫壇體積越大藍(lán)，洗項(xiàng)脫效極率越照高，如縱果需近要質(zhì)臉粒濃欣度較朗高，蒜可以桿適當(dāng)腐減少扔洗脫毒體積固，但去是最小品不應(yīng)琴少于50μl，體積鞋過小美降低云質(zhì)粒酬洗脫圾效率，減社少質(zhì)秤粒產(chǎn)展量。五、院實(shí)驗(yàn)懇結(jié)果定與討粥論1.實(shí)驗(yàn)科結(jié)果2.討論附I：堿倚法提劑取質(zhì)勒粒的耀原理鍬和方軌法(一)試劑補(bǔ)等1.So閘lu綱ti情on冤Ⅰ50mm像ol/L葡萄癥糖25mm污ol/LTr徐is蛙.·告Cl(p雪H繪8.腳0)10mm晃ol/L寶E津DT樹A戴(p牢H息8.婦0)高壓附滅菌這后，4℃保存刻備用蜂。2.So賤lu釀ti新on短Ⅱ(現(xiàn)用惕現(xiàn)配疑制)0.蚊2配mo脹l/她LNa紛OH1%加SD陡S3.So雹lu魄ti阿on娃Ⅲ（10捧0乏ml）：5m躲ol桂/LKA葡c60概m季l冰醋撈酸11指.5增m毅l水28姿.5畝m隱l配制丸成的痕溶液Ⅲ含3鬧mo居l/猛L鉀鹽初、5霧mo盛l/浙L醋酸提（pH序4犧.8）。4.胰RN繼A酶：將回胰RN翻A酶（RN熟A酶A）溶咬于10mm味ol/LTr害is錘.C篩l(p伙H開7.富5)、15mm恩ol/LNa跪Cl中，譜配成10欠m懂g/亭ml的濃粉度，毫于10灘0℃加熱15分鐘讓，緩宴慢冷競卻至鮮室溫音，分昂裝成據(jù)小份沈保存熟于-2俘0℃。5.氯仿飲，乙悶醇換，70匹%乙醇。（二唯）實(shí)通驗(yàn)步卻驟用滅庭菌的曠牙簽作挑取座單菌講落放燭入50榨ml志L藍(lán)B液體挨培養(yǎng)胸基（嚴(yán)含Am耕p0.院1mg倍/m嗎l）中，37字℃振蕩鼓培養(yǎng)過夜鹿。將菌瞇液倒切入1.必5mlEp主pe釋nd想or跪f管中洪，10河,0衛(wèi)00腿r討pm離心1m芬in，去掉嚷上清效液，注重復(fù)兩次。沉淀奶懸于20暴0μ宴LSo煙lu銷ti往on天I中,渦旋距使充分校懸浮。加入30巖0μ由LSo撿lu授ti描on脾II，混勻（攔注意動(dòng)作怨輕），唉冰箱3婦℃放置5森mi伍n。加入30到0μ掉LSo撕lu股ti仿on計(jì)II秀I,混勻切（注綱意動(dòng)作愉輕）摘，冰混箱3搭℃放置5啟mi帥n。12揭,0沫00鹽rp傲m，離心5m桑in，將上望清移秘至1個(gè)新Ep鞋pe體nd勵(lì)or觸f管中主，注遷意所李取體掠積（憂約60拖0繪μL）著。加入等體海積氯繳仿（約60呼0怖μL），混勻（注享意動(dòng)浪作輕脊）。12鏟,0志00撲rp獎(jiǎng)m，4℃，離心10屋mi稿n，取上清液。上清染液中加利入預(yù)冷漁的等米體積艷異丙憂醇，-2亦0℃沉淀20憐~3呆0盯mi搖n。12且,0硬00鴨r啄pm離心15遵m病in。去上每清，沉淀加入50戒0μ凱L70柳%乙醇洗滌2次（12禁,0嫁00貌r箏pm離心3分鐘勢）。去掉水上清靠（注料意沉東淀勿晴丟失減），首室溫襪或真空凈干燥沉淀幅。每管志中加號(hào)入25弦μL無菌癥水1μ禁LRN泉as晴e，37白℃溶解豆質(zhì)粒DN癢A。(三)實(shí)驗(yàn)帝結(jié)果辜及討供論堿法有提取為質(zhì)粒傲是實(shí)坊驗(yàn)室鉛最常屆用的慢質(zhì)粒妹提取鉗方法圣之一劣，提取相量較眨大，蕉便于黃操作。如有蛋白迅質(zhì)殘?jiān)簦山锖蟛煌刚济?，而虜呈白脹色。附II：B型質(zhì)潔粒小底樣快刮速提亦取試容劑盒北京偽博大盟泰克訪（Bi衫oD潔ev）生百物基處因技寒術(shù)有固限責(zé)先任公鉛司(一)概述采用苗堿裂稈解--中和扒法，洋應(yīng)用責(zé)常規(guī)咱臺(tái)式丘高速奔離心還機(jī)，膊經(jīng)反杜應(yīng)條置件最揮優(yōu)化都后，俊使含栗有質(zhì)餡粒DN膨A的上軌清通此過設(shè)機(jī)計(jì)獨(dú)搶特的離心到吸附哪柱式結(jié)構(gòu)筑時(shí)，體被特殊志硅基蹦質(zhì)材墳料高效踢、專意一地販吸附青。被唐吸附澤的質(zhì)竿粒DN癢A隨后提可用洗脫艇緩沖厘液從離固心吸先附柱京上洗遲脫下千來。(二)試劑痕盒組唱成及扶包裝ST在E緩沖蚊液(溶液1)Ly養(yǎng)si謙sBu病ff奮er察(溶液2)3浩MNa巴Ac,蘆PH祥4禍.8耳(溶液3)結(jié)合泳緩沖頃液濃縮謎漂洗蘿液洗脫平緩沖默液離心掉吸附蟻柱廢液受收集牢管RN伐as關(guān)eA(1捕0m侍g/薦ml蝦)(三)實(shí)驗(yàn)別準(zhǔn)備試劑柔盒使解用前副，在5mL溶液1中加啟入30賣0μ貸lRN肅as杜eA（RN鋼as地eA終濃蜜度為0.早6m鹽g/霧mL）。慕溶液1使用指完畢社后，慚立即勿于4蹤蝶℃保存鞏。濃縮捧漂洗遼液使用毫前按1：3的比綢例加寒入無水銀乙醇，例財(cái)如15mL濃縮蜜漂洗紙液中碧加入45mL無水激乙醇乎，混峰勻后伐方可撫使用匯。實(shí)驗(yàn)盲前檢免查溶液2及結(jié)合套緩沖測液是否隱有高株鹽結(jié)艇晶。雹如有盾結(jié)晶箱，將唉蓋擰認(rèn)松后攝加熱10棋-1愁5秒，忌高鹽評(píng)結(jié)晶梨溶解迫后再府使用春。(四)實(shí)驗(yàn)潤操作爸步驟收集1.落5-特3m敘L菌液搬的沉淘淀于1.翅5mLEp腳pe羅nf咸or搭f離心向管中從，加翁入10浩0μ昏l溶液1，振隸蕩至梯徹底哪懸浮急。加入15興0μl溶液2，立嶼即輕浙柔顛擔(dān)倒離檔心管怪?jǐn)?shù)次擔(dān)，使抗菌體步充分秒裂解拴，裂汽解后毛的菌狹體變尊得清圖亮?？与S后惜將離也心管笨放置狂于冰茅上1-枕2分鐘冤（時(shí)硬間勿瞎超！踐）。加入15雅0μl溶液3，立河即溫發(fā)和顛釣倒離探心管久數(shù)次競，室礎(chǔ)溫放危置5分鐘其。12，00糾0r典pm離心12分鐘潤。將42賄0μ睬l結(jié)合瓣緩沖裕液加入輩離心抬吸附樸柱中濕，然奔后將抄步驟3中的雀上清忌加入網(wǎng)離心慮吸附家柱中罵（盡湖量去勺除雜魯質(zhì)）融，混群勻，12，00淘0r姥pm離心30秒鐘箏。倒缸掉廢歌液收徹集管片中的益廢液獵。加入75窄0μl漂洗活液于離夠心吸瘦附柱蘿中，夢靜置1分鐘右，12，00者0r薯pm離心15秒。向倒掉寧廢液仆收集康管中搞的廢什液。重復(fù)坊一次。倒京掉廢南液后輝，再次于12，00偷0r僚pm離心2分鐘禍，盡演量除您去漂澡洗緩摔沖液使。下心奴取出嗽離心遍吸附萌柱，液將其賢套入享一個(gè)賣干凈戶的1.醫(yī)5mLEp馬pe早nd乒or補(bǔ)f離心蠅管中戶，加略入洗脫貨緩沖盒液，常臟規(guī)50叢μl，室干溫放愿置2-由5分鐘個(gè)，12，00宇0r捎pm離心1分鐘燒。附II萬I：H.縣Q.巾&.醉Q.高純拾度質(zhì)謊粒微畜量試閃劑盒（HP識(shí)P石la淹sm批idMi蝦ni遵pr放epKi肥t）A．樣瘋本制黑備將帶舌有目抵的質(zhì)險(xiǎn)粒的E.咐c燒ol宏i接種掀于裝串有5m誓l伍LB佛/氨芐紀(jì)青霉債素(5割0μ交g/柏ml慶)培養(yǎng)暫基的10偷~2唉0m沉l培養(yǎng)閑管中噴，37域℃搖床魯培養(yǎng)12嘩~1辰6微hr，以擴(kuò)增換質(zhì)粒。建議份使用en槽dA敏感拳型的E.尖c兆o(hù)l答i菌株販來作略常規(guī)味質(zhì)粒則的分改離，益例如DH抖5α?和JM狹10擦9?等菌綿株。B．操現(xiàn)作方鳥案1.取1.竹5~朱5m熊l的菌錦液，猶于室端溫下10獻(xiàn),0臟00部×g離心1m釣in以沉至淀菌恒種。2.倒出或吸慢出培日養(yǎng)基億，棄家去。白往沉臂淀中妄加入25塊0μ懇l的ZL啦-I／RN畏as跡eA混和任液，漩渦廣振蕩使細(xì)鳥胞完全微重新伴懸浮。細(xì)胞改沉淀叨的完全擋重懸對(duì)于乘獲得高的鹽產(chǎn)量是十達(dá)分重經(jīng)要的愉。3.往重通懸混否和液配中加曾入25調(diào)0μ努lZL近-I蔑I，輕輕加翻轉(zhuǎn)試管4~課6次混和能溶液報(bào)，以籃獲得阻一澄清齊的裂死解液。如有揚(yáng)必要哥，可需把裂洋解液愧置于額室溫周靜置2m泡in。避免暗劇烈掃混和展裂解廣液，否滴則會(huì)閃使染拉色體DN但A斷裂飄而使賭得到扎的質(zhì)恰粒純銀度降不低。瞞當(dāng)鑰使用撐完ZL墳-I臨I以后拼，須梨蓋緊設(shè)其瓶鎖蓋?；蚀婧萌?.往上顯述混晉和液架中加揮入35糕0μ圣lZL英-I羞II，并溫和地上螞下顛倒置離心蝕管數(shù)惰次，直爸至形裝成白色覆絮狀她沉淀。于助室溫刃下10份,0膝00榴×g離心10率mi理n。5.仔細(xì)取一聲干凈滑的Mu手-P歲u質(zhì)粒熟微量少分離欄柱裝在滅一個(gè)2m慕l收集幼試管上(已備)。小心吸出奶上清擔(dān)，并杠將其點(diǎn)轉(zhuǎn)置土于柱拜子內(nèi)籃，確板保轉(zhuǎn)別至柱芹內(nèi)的挑上清征中沒有訴細(xì)胞傅雜質(zhì)且沉淀。于匹室溫匹下10隊(duì),0具00只×g離心1m釣in，使敵