實(shí)驗(yàn)四從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段

實(shí)驗(yàn)四從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收并純化DNA片段的方法二、實(shí)驗(yàn)原理將DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切割下含目的DNA片段的凝膠塊；在高鹽和促溶劑的作用下，瓊脂糖聚合物中糖之間的氫鍵斷裂而迅速溶解，DNA就從膠基質(zhì)中釋放出來(lái)并選擇性地吸附到球狀的硅膠顆料或特定的柱子上；然后用高鹽緩沖液洗滌除去殘余的瓊脂糖，再用含乙醇的緩沖液洗去鹽和染料。最后用TE緩沖液或水將球狀硅膠顆粒或柱子上的DNA洗脫下來(lái)。回收純化后的DNA可直接用于DNA的連接反應(yīng)、標(biāo)記反應(yīng)、測(cè)序反應(yīng)或DNA的微量注射等研究。

三、實(shí)驗(yàn)材料

水浴鍋、離心機(jī)、移液器PCR擴(kuò)增的Rv1791基因AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0（Taraka）試劑盒采用了獨(dú)特的凝膠融解系統(tǒng)，結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有高效、快速、方便之特點(diǎn)，全套操作只需30分鐘便可完成。本試劑盒回收純化的DNA片段純度高，完整性好，可直接用于連接反應(yīng)、PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）實(shí)驗(yàn)三中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。（2）在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。切膠時(shí)不要將DNA長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。（3）切碎膠塊。膠塊切碎后可以減少步驟6的膠塊融化時(shí)間，提高DNA的回收率。（4）稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí)，以1mg=1μl進(jìn)行計(jì)算。（5）向膠塊中加入3倍凝膠體積的膠塊融化液DR-IBuffer。（6）均勻混合后75℃加熱融化膠塊，此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6～10min）。（7）向上述膠塊融化液中加入DR-IBuffer量的1/2體積量的DR-IIBuffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400bp的DNA片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。（8）離心柱放入收集管中，將步驟7的溶液轉(zhuǎn)移至離心柱中，12,000rpm，1min，棄濾液。如將濾液再加入離心柱中離心一次，可以提高DNA的回收率。（9）將500μl的RinseA加入離心柱中，12,000rpm，30s，棄濾液。（10）將700μl的RinseB加入離心柱中，12,000rpm，30s，棄濾液。（11）重復(fù)操作步驟10，將離心柱放入收集管中，12,000rpm，1min。（12）將離心柱放入新的指形管中，在離心柱膜的中央處加入25μl的滅菌蒸餾水或ElutionBuffer，室溫靜置1min。注）把滅菌蒸餾水或ElutionBuffer加熱至60℃使用時(shí)有利于提高洗脫效率。（13）12,000rpm，1min，洗脫DNA。五