第七章分子生物學(xué)方法上

第七章分子生物學(xué)研究方法第一節(jié)重組DNA技術(shù)回顧第二節(jié)DNA基本操作技術(shù)第三節(jié)RNA基本操作技術(shù)第四節(jié)SNP的理論與應(yīng)用第五節(jié)基因克隆技術(shù)第六節(jié)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)5/24/20231第一節(jié)重組DNA技術(shù)回顧一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件第一，在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者：即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；

5/24/20232第二，50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制，解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；

第三，50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。5/24/20233但是：當(dāng)時(shí)由于缺乏有效的分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家無法對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。隨著DNA分子體外切割與連接技術(shù)及核苷酸序列分析技術(shù)的進(jìn)步直接推動(dòng)了重組DNA技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展。5/24/20234重組DNA技術(shù)（recombination）：

是應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代DNA分子的過程。5/24/20235工具酶：

限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）

DNA連接酶（DNAligase）工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是現(xiàn)代生物工程技術(shù)史上最重要的事件。5/24/20236（一）限制性內(nèi)切酶(RE)

1、概念：一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。

2、分類：

I型、II型、Ⅲ型5/24/20237

類型II：識(shí)別位點(diǎn)和酶切位點(diǎn)一致，具特異性。單體酶，性質(zhì)穩(wěn)定，Mg2+為輔助因子。目前已分離了數(shù)百種。

類型I：識(shí)別的DNA序列長(zhǎng)約十幾個(gè)bp；酶切位點(diǎn)在距識(shí)別位點(diǎn)1kb左右處隨機(jī)切割，非特異性；復(fù)合酶，無使用價(jià)值。

類型Ⅲ：酶切位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp處，非特異性。單體酶，如HgaI:GACGCnnnnn5/24/202383、II型限制性內(nèi)切酶的基本特性5’…GCTGAATTCGAG…3’3’

…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)(1)識(shí)別dsDNA分子中4～8bp的特定序列(2)大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)(3)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)5/24/20239EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端

5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’

EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’

POH5/24/202310（二）DNA連接酶(ligase)

將兩段DNA片段連接起來的酶稱為DNA連接酶。1、E.coliDNAligase:連接粘端,催化需要NAD+參與2、T4DNAligase:連接粘端和平端，催化需要ATP參與都不連接單鏈5/24/202311DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵nickOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’POHDNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5/24/202312二、基因克隆的載體克隆用載體：是指具備自我復(fù)制能力的DNA分子。常見的分子克隆載體有：病毒、噬菌體、質(zhì)粒。克隆用載體的選擇具備復(fù)制原點(diǎn)，能夠自我復(fù)制具備適合的酶切位點(diǎn)，且不在原點(diǎn)具有篩選指標(biāo)對(duì)抗菌素的抗性基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)5/24/202313載體的功能

運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件5/24/202314三、基因克隆的操作

1、從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段；2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子；5/24/2023153、感受尚態(tài)細(xì)扭胞的鎖制備—氯化禽鈣法第一猴次搖套菌第二耍次搖潛菌離心誘收集卸細(xì)菌0.柿1MCa籠Cl2重懸良細(xì)胞,冰浴30既m醫(yī)in離心盈、重惜懸重琴?gòu)?fù)一蠅次5/丘18撞/2音02赴3164、轉(zhuǎn)癢化（tr疤an弄sf藝or蕩ma廈ti朽on）感受逮態(tài)細(xì)眨胞與校連接捉產(chǎn)物辜輕輕糖混勻,冰浴30mi暮n，42風(fēng)℃水浴熱激60冶–9遞0s，快攻速冰浴2跌mi厘n加液緩體LB振蕩匆培養(yǎng)蠟，使細(xì)胞課復(fù)蘇城。5/購(gòu)18求/2競(jìng)02這3175、篩覆選（sc闊re箏en擺in亞g）①根據(jù)弓重組牙載體皇的表雕型襯緒抗嚼藥性嗎（Am值pr、Te便tr）著其他ma榆rk（-互補(bǔ)舉篩選尤）②根據(jù)DN太A限制濫酶的盞酶譜煉分析③PC敵R反應(yīng)5/躲18毛/2波02鼓318基因壞克隆壘流程顫示意殺圖5/線18盟/2乓02男319帶有篇負(fù)電皂荷的DN芳A或RN焦A核苷攔酸鏈濕，依厭靠無哭反應(yīng)測(cè)活性在的穩(wěn)蒙定的介質(zhì)（瓊忠脂糖滅凝膠異和聚嚇丙烯蔑酰胺筑凝膠音）和憶緩沖那液，您在電叢場(chǎng)中狼以一冊(cè)定的這遷移曬率從繁負(fù)極綠移向牽正極產(chǎn)。根腹據(jù)核糠酸分子及大小不同倉(cāng)、構(gòu)型的差虛異，寸以及水所帶電荷的不攔同，藍(lán)可以況通過擋電泳糕將其榴混合兇物中意的不延同成甲分彼盞此分看開。一、檔核酸險(xiǎn)的凝亦膠電伏泳（一卸）基本輸原理：第二匠節(jié)DN薄A基本責(zé)操作吳技術(shù)5/階18畝/2匹02鉗320電泳雞遷移慕率：電夢(mèng)泳分惱子在參電場(chǎng)便作用嗎下的樹遷移賭速度孤。與電鐮場(chǎng)強(qiáng)互度和碌電泳陣分子陽所帶凡的凈憑電荷警成正雨比。與分午子的叼摩擦爬系數(shù)脅成反坐比，趣摩擦個(gè)系數(shù)偉是分姓子大辣小、勞極性五及介蓋質(zhì)粘機(jī)度的罷函數(shù)綱。支持劃介質(zhì)：穩(wěn)謹(jǐn)定，轉(zhuǎn)無反渡應(yīng)活脈性；5/燒18對(duì)/2新02裂321（二芝）種筑類1)按凝警膠材露料分:聚丙薦烯酰賞胺凝瘡膠和柱瓊脂兔糖凝崖膠電該泳2)按電落泳裝微置分:水平仍式/瓊脂遵糖凝防膠;豎式/聚丙彎烯酰蝕胺凝意膠3)兩種盟方法巖比較桃：分軍離效周果和碌分離耽范圍;操作催難易5/廈18弦/2南02搜322瓊脂器糖凝際膠電飄泳瓊脂籌糖是化從紅愿色海桃藻產(chǎn)朋物瓊斑脂中全提取具的一溫種線性渡多糖潤(rùn)聚合傍物。將臨瓊脂腰糖粉斗未加敏熱到蠶溶點(diǎn)鋸后凝軍固，卻便會(huì)顫形成特良好格的介僻質(zhì)，族其密爸度由徐瓊脂眨糖的模濃度書所決題定。特點(diǎn)睛：分辨安能力濫低，惜但應(yīng)懂用范硬圍廣蠢，適偵用于夫較大緩分子傅的分陸析。冶適于嘗分離20完0bp~逃50瞧k慰b的DN眉A片段凝。操范作簡(jiǎn)積便。5/貼18防/2眉02米3235/摘18墻/2銹02絕324聚丙腥烯酰齡胺凝機(jī)膠電處泳聚丙憂烯酰洋胺凝旬膠是電一種勸人工茄合成歉的凝雞膠，詠由丙烯纏酰胺耕單體和交聯(lián)也劑甲只叉雙昆丙烯啦酰胺在催渾化劑過硫伴酸銨和加勉速劑TE誓ME縱D逢(四甲點(diǎn)基乙屑二胺陡）的作憲用下庸聚合頭而成傳。聚合字時(shí)，桐由單灰體丙津烯酰假胺聚斤合成霜鏈狀跟物，郵由交醋聯(lián)劑孟甲叉敢雙丙怪烯酰趁胺將糧鏈與奮鏈交床聯(lián)成珍網(wǎng)狀威，形胳成立惑體的洞不溶廉于水調(diào)的凝副膠。5/晴18蝴/2階02溜325特點(diǎn)襯：分辨董能力近高，奏但應(yīng)猶用范悔圍小巾，適衛(wèi)用于暑較小贊分子大的分如析。瞞適于拘分離5bp~儉50很0bp的DN待A片段倆。操患作復(fù)淹雜。核酸償分子最的染襖料溴化乙錠（EB），因具后有扁平晌分子的空鏡間結(jié)適構(gòu)，鍵能插逼入到DN鈔A分子階或RN應(yīng)A分子紫的相和鄰堿弓基之希間，版并在30厭0n受m波長(zhǎng)徑的紫瞇外光麻照射局下發(fā)栗出熒光。5/貪18止/2沃02氣326（三）

用途

瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。（四）

凝膠電泳的一般程序制膠點(diǎn)樣電泳染色觀察5/低18揮/2學(xué)02懷3275/豬18君/2逐02畝3285/諷18遇/2壁02果329二、伍細(xì)菌林轉(zhuǎn)化細(xì)菌碑轉(zhuǎn)化綠（tr邁an劃sf分or田ma侵ti抖on）是指留一種歪細(xì)菌朗菌株在由于巾捕獲臥了來架自另轉(zhuǎn)一種繡細(xì)菌完菌株DN瘋A而導(dǎo)演致性掌狀特逃征發(fā)格生遺視傳改委變的壩生命寨過程陡。提義供轉(zhuǎn)惜化的DN鑰A菌株船叫供體最菌株，接戰(zhàn)受轉(zhuǎn)害化的DN奴A菌株津叫受體棄菌株。目前降常用躲的轉(zhuǎn)租化方詢法有Ca棄Cl2法(化學(xué)蟲轉(zhuǎn)化扭法)和電轉(zhuǎn)攜化法。5/尤18格/2阿02慚330感受脂態(tài)細(xì)掉胞的貧制備—氯化觀鈣法第一次搖菌第二次搖菌離心收集細(xì)菌0.1MCaCl2重懸細(xì)胞,冰浴30min離心、重懸重復(fù)一次5/慶18儀/2箱02四331轉(zhuǎn)化（tr任an濁sf朝or蜂ma刪ti票on）感受輸態(tài)細(xì)丙胞與滅連接婆產(chǎn)物風(fēng)輕輕果混勻,冰浴30分鐘晉，42℃水浴熱激60蹈–9搜0秒，快占速冰浴2分鐘量加液酷體LB振蕩剃培養(yǎng)稱，使細(xì)胞吃復(fù)蘇朗。5/睜18男/2慶02普332三、PC踩R基因蝦擴(kuò)增聚合濃酶鏈蛇式反獅應(yīng)（po任ly膝me化ra邪se腎c腳ha輪in忠re納ac丘ti昂on枕)，即PC帽R技術(shù)待，是將一種淹在體晴外快拉速擴(kuò)治增特莖定基院因或DN賄A序列職的方情法。1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。5/物18備/2猾02微333PC敏R特異洞性，即亂所擴(kuò)喬增片渴段是究由兩魔個(gè)人移工合也成的礎(chǔ)引物廉序列蟻決定墓的。5/猛18福/2濾02漲334PC套R(shí)反應(yīng)干原理①變誤性②退球火③延眾伸5/作18邁/2醋02咬335反應(yīng)泄體系情的成醋分耐熱咸的DN渣A聚合公酶PCR反應(yīng)的緩沖液Mg2+Tris?Cl

引物d勺NT俊P模板DN著A5/島18網(wǎng)/2斬02抬336溫度噴循環(huán)惠參數(shù)變性：雙享鏈DN蘋A分子黨加熱株分離色成兩月條單蔥鏈DN蠟A分子碰的過檢程。變性蘆溫度：是克指雙燥鏈DN嘩A分子50％發(fā)禮生變滾性時(shí)泊的溫扮度，究一般點(diǎn)為94零∽9頃5℃5/毅18膚/2蔬02糖337退火：兩滾引物墾分別跟與兩傳條DN謙A的兩策側(cè)序晚列特撒異性塑互補(bǔ)賣，形群成雙滑鏈的鐮過程瓶稱為脅退火贈(zèng)。退火類溫度一般筑在50能∽6貢5℃之間察，具賣體溫閱度與角引物歷長(zhǎng)度殼、堿安基組紋成以迷及濃翁度有裹關(guān)。5/澇18險(xiǎn)/2懇02恥338延伸：在數(shù)適宜任條件掉下，DN屯A聚合悄酶以亡單鏈DN動(dòng)A為模乞板，教以4種脫罰氧核知苷三件磷酸滋（d究NT單P棕)為底核物,在引活物的渡誘導(dǎo)鳥下，羨按5′拔→槐3′方向崗復(fù)制更互補(bǔ)DN樂A的過堵程。延伸豬溫度一般格為70非∽7殖5℃，此隊(duì)時(shí)DN梳A聚合舍酶活裙性最免高。5/滑18賤/2殺02云339時(shí)間揀參數(shù)變性驅(qū)時(shí)間：決量定于DN光A的復(fù)棵雜性桶，一何般選夢(mèng)取94℃1質(zhì)mi艙n,因過絕長(zhǎng)的月高溫閣時(shí)間廈，會(huì)市降低DN令A(yù)聚合償酶的僅活性酬；退火曠時(shí)間：一般突情況捎下取30夢(mèng)s腐~1落m淺in，因染為引辟物比范較短有；延伸既時(shí)間：根據(jù)頓擴(kuò)增午片段輔的長(zhǎng)躁度而軟定，縮慧一般鴨在1k抬b以內(nèi)慶的片冶段需您延伸1m獅in蹤蝶,更長(zhǎng)御的片王段需中相應(yīng)語延長(zhǎng)檢時(shí)間雹。5/我18仍/2覽02那340引伸物1、引顏物長(zhǎng)遭度在15∽3鎖0bp之間期，引物激的退浮火溫產(chǎn)度Tm淡=芹4側(cè)(G秩+C場(chǎng))澤+軌2(托A+欣T)2、堿裙基隨騰機(jī)分金布避免籮一連斜串相恭同堿理基，剃引物霜本身礦不應(yīng)忙存在紗互補(bǔ)袍序列址，兩聚條引狹物間配也不直應(yīng)有索互補(bǔ)用性，責(zé)尤其制是3′端；5/接18夏/2杜02蒼3413、G雖+霜C含量G癥+泰C含量乏一般購(gòu)為40％∽60％4、引傾物3′端堿搭基的溝特異略性。5/霸18約/2勸02生342PC知R技術(shù)陷的特臂點(diǎn)：第一度，特扶異性戀?gòu)?qiáng)第二亂，效岔率高第三命，靈銷敏度愉高皮克(p貝g=挽10-1宏2)量級(jí)受擴(kuò)增進(jìn)到微轟克(ug=1涉0-6)水平能從10懸0萬個(gè)膽細(xì)胞刪中檢率出一略個(gè)靶智細(xì)胞第四雞，對(duì)安標(biāo)本濾的純礎(chǔ)度要倉(cāng)求低血液上、體現(xiàn)腔液談、洗拔嗽液酷、毛放發(fā)、聚細(xì)胞刺、活維組織薦等組步織的急粗提DN棟A5/存18滾/2辮02盲3435/線18綱/2書02攏344四、盈實(shí)時(shí)呢定量PC礦R實(shí)時(shí)存定量PC偉R技術(shù)絲式：指返利用憲帶熒臘光檢做測(cè)的PC稿R儀對(duì)脅整個(gè)PC迫R過程滅中擴(kuò)痰增DN揚(yáng)A的累雜積速呼率繪哲制動(dòng)驅(qū)態(tài)變跳化圖第，利容用熒崗光信酷號(hào)積譜累實(shí)幟時(shí)監(jiān)設(shè)測(cè)整啄個(gè)PC僅R進(jìn)程劫，從明而測(cè)杏定終摧端產(chǎn)趕物的燒豐度歐。5/般18匪/2私02彼345熒光涂探針哥事先本混合保在反賄應(yīng)管歐中，青只有龜與DN逆A結(jié)合食后才泥能被蒙激發(fā)產(chǎn)出熒惠光。5/丹18努/2達(dá)02綱3465’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’Re桑pe東at非序共列特灑異性勇的DN拒A結(jié)合汪的熒粗光探平針BDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll與雙之鏈DN春A結(jié)合丹；與DN姨A結(jié)合湯后才吸發(fā)出膜熒光旅。5/竹18茄/2毫02次347特異剩性的四熒光斷探針特異飄性的完熒光掉探針綿是把行熒光目化合同物標(biāo)低記到介特異雹性的礙寡核題苷酸餡上形酬成熒市光標(biāo)彩記的DN菌A探針推。通娘過探竿針與PC丈R產(chǎn)物留特異瓦性的追結(jié)合勢(shì)，在PC池R過程幅中可胡對(duì)產(chǎn)夾物實(shí)恒現(xiàn)實(shí)建時(shí)、唱定量塔檢測(cè)罰。5/襖18索/2戀02寄348Ta梳qM史an探針鬧是一池小段年被設(shè)席計(jì)成誼可以義與靶DN走A序列朱中間刻部位冊(cè)結(jié)合兇的單料鏈DN辨A（一顛般為5~耗50bp），獵并且偷該單即鏈DN祖A的5’和3’端帶凱有短預(yù)波長(zhǎng)完和長(zhǎng)凈波長(zhǎng)尊兩個(gè)擾不同犁熒光額基團(tuán)彈。5/魔18癥/2喊02慕349當(dāng)探講針單撿獨(dú)存垂在時(shí)域，由協(xié)于熒押光共李振能聰量轉(zhuǎn)笛移的直作用鎮(zhèn)而發(fā)既生熒幣光猝斥滅。著在PC穗R過程貪中，俊由于Ta眼qD袍NA酶的5’林-3梢’外切偵酶活遲性的虧作用宅，使眉探針浪的5’端的浸基團(tuán)禍被切域斷，縫加大聾了熒椅光基艘團(tuán)間話的的箏距離聚，被餃切下扭來的翁熒光糖基團(tuán)黑恢復(fù)梢熒光天。一分購(gòu)子的牢產(chǎn)物盜生成塊就伴督隨著槽一分注子的券熒光哭信號(hào)除的產(chǎn)沿生。省隨著配擴(kuò)增泊循環(huán)扇數(shù)的派增加搬，釋腳放出諷來的奧熒光眠基團(tuán)慮不斷疏積累門。因侮此，Ta越qm拾an探針逆檢測(cè)稱的是撞積累誕熒光承。5/角18蔑/2幅02飄3505’5’3’3’d.NT船PsTh穗er慘ma同l五St芝ab益leDN兇A歪Po想ly類me搏ra白sePr基im倚er曉s5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Ad間d儉Ma條st賀er半M歡ixan皂d斬Sa泛mp謹(jǐn)leDe伯na嚴(yán)tu蓬ra斥ti余on5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’An霜ne濤al擱in月gRe貸ac懼ti嚷on擴(kuò)T睬ub娃eTaql5’3’RQProbe5’3’RQ應(yīng)用Ta梯qM夫an探針姐的實(shí)風(fēng)時(shí)定管量PC銳R技術(shù)5/鋪18肥/2遲02岸3515’3’5’3’5’3’RQ5’3’Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’5’3’QTaqR3’5’5’3’3’QTaqR5’lR5/糠18霜/2燦02擁352實(shí)時(shí)隙定量PC晨R的絕半對(duì)定域量Ct值：指PC側(cè)R擴(kuò)增漢過程多中，尤擴(kuò)增器產(chǎn)物計(jì)熒光說強(qiáng)度穿首次妨超過嶼設(shè)定跌閾值無時(shí)，PC擔(dān)R反應(yīng)昂所需殺的循爺環(huán)數(shù)泊。5/笨18霜/2蓮02翠353模板悟起始美濃度鑼越高合，Ct值越剖小Ct值與狂模板配起始銜拷貝放數(shù)的診對(duì)數(shù)化存在棋線性氣關(guān)系Ct值與念模板薪起始驕濃度縱的關(guān)煎系如果貿(mào)模板擋濃度挨增加1倍，Ct值就優(yōu)提前1個(gè)循津環(huán)到篩達(dá)如果厲模板送濃度巖減少1倍，Ct值就援滯后1個(gè)循翼環(huán)到治達(dá)5/間18抖/2忘02萍354絕對(duì)涌定量可以龍得到晉某個(gè)洗樣本信中基矮因的姐拷貝玩數(shù)和葛濃度喘。（圖5-以11）相對(duì)俯定量（兩犧個(gè)樣鄙本中講的基旁因表澇達(dá)水銳平進(jìn)執(zhí)行比禿較等）（圖5-排12）五、澡基因巴組DN侵A文庫只構(gòu)建是指貿(mào)將某族種生莫物體盡的全騎部基心因組DN扮A用限制耍性內(nèi)場(chǎng)切酶或機(jī)械矛力量切割絞成一鑒定長(zhǎng)山度范督圍的DN鞠A片段洋，再船與合木適的椒載體珍在體鞋外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)識(shí)的宿宇主細(xì)唯胞獲慌得的所有肉陽性分菌落，這瓶個(gè)群峽體就令稱為敘該生睛物基因示組文法庫。5/役18突/2芬02漸356基因奶組DN孔A文庫呼的類銳型根據(jù)諷所選蛾用的彼載體嘆可以臉分為娃：質(zhì)書粒文連庫、懂噬菌勞體文合庫、戒粘粒堪文庫拼、人享工染松色體延文庫嗚（細(xì)輛菌人劑工染蘇色體惹文庫句、酵瓜母人脫工染衡色體圈文庫胞）。5/迅18胸/2錫02宴357基因特組DN棒A文庫運(yùn)的質(zhì)崗量標(biāo)起準(zhǔn)一個(gè)脖理想蘋的基框因組DN繞A文庫握應(yīng)具歌備下丹列條韻件：重組給克隆宏的總電數(shù)不轟宜過竊大，酬以減嚷輕篩勇選工瘦作的堂壓力;載體禍的裝以載量花最好倘大于杏基因六的長(zhǎng)文度，或避免咱基因息被分跟隔克顧隆;克隆執(zhí)與克面隆之夜間必種須存駝在足逢夠長(zhǎng)古度的印重疊岡區(qū)域弓，以步利克壟隆排巖序;克隆巧片段絕易于臨從載付體分鴨子上鎮(zhèn)完整兼卸下;重組厘克隆跨能穩(wěn)會(huì)定保且存、新擴(kuò)增臭、篩太選。5/傭18磁/2針02婆358基因盈組DN膨A文庫系構(gòu)建母的程巷序①載體DN孝A的制隊(duì)備；②久基因牲組DN聽A的提柴??；③撈基因莖組DN欄A的部頃分酶?jìng)蚯?、風(fēng)分離癥與回閥收；④完載體餡與外階源片狼段的刷連接柿與轉(zhuǎn)磁化或滅侵染偽宿主賭細(xì)胞欲；⑤炎重組劑克隆惱的挑疏選和負(fù)保存回。5/慌18惰/2污02津3595/嚼18稱/2陵02窄360第三泄節(jié)RN獎(jiǎng)A基本夾操作改技術(shù)一、賀總RN軌A的提攀取液氮統(tǒng)研磨壞組織裁、勻侄漿加入Tr盼iz候ol試劑鵲（異石硫氰悼酸胍-苯酚揭）溶巨解細(xì)躬胞氯仿托抽提異丙精醇勸沉淀溶孔解在變筍性條猛件下迷采用乳電泳嚷方法鄰對(duì)其司進(jìn)行謊檢測(cè)5/歡18幼/2籍02泳361二、mR潤(rùn)NA的純監(jiān)化

大部分真核生物的mRNA有3’poly（A）尾巴

oligo(dT)能與poly(A)尾巴互補(bǔ)，由此來獲得mRNA。AAAAAAAAAAn5’cap5/怕18儀/2修02頌3625/天18傻/2遷02望363分離mR組NA的試拍劑盒可應(yīng)基用Pr釀om葡eg嫁aPo否ly患ATtr制ac純t腳mR五NA分離挑系統(tǒng)分離po世ly鳳(A聚)m博RN攜A。將用生物公素標(biāo)叢識(shí)的寡艱聚(dT)引物棍與細(xì)樹胞總RN行A共溫循育，知加入日與微糕磁球唇相連莖的抗生垮物素聾蛋白，用量磁場(chǎng)告吸附競(jìng)通過料寡聚(dT)引物耗與抗翅生物若素蛋澡白及刑強(qiáng)力提微磁濃球相棋連的mR笨NA。5/諒18條/2膠02蔽364三、cD清NA的合壞成貢可同青時(shí)在寨反轉(zhuǎn)艱錄系聚統(tǒng)中犁加入Ol羽ig王o（dT）12蠅-1修8-聾me疾r及隨機(jī)勇引物R6，以鮮保證速得到罷全長(zhǎng)cD都NA；央應(yīng)倆選用莖活性況較高心的反轉(zhuǎn)遲錄酶摩（Re型ve痛rs秀e兵tr幕an殃sc咽ri賀pt潑as趣e）；高應(yīng)枯選用甲基揚(yáng)化dC置TP(防止豈被限美制性覆內(nèi)切蒜酶切崖割)；唐應(yīng)獵保證柄所獲華得雙叨鏈cD反NA的方向些性(cD都NA兩端診加上意不同堤內(nèi)切呈酶所困識(shí)別飯的接絹頭序術(shù)列);因?yàn)樵捊^大慌多數(shù)渣大腸紛桿菌捏細(xì)胞哥都會(huì)時(shí)切除羞帶有5’酷-m紫et網(wǎng)hy斧l串C的外醫(yī)源DN頂A，所義以，愁應(yīng)選字用mc染rA-仍,mc回rB-菌株萍。5/匙18蚊/2盜02渾3655/昏18研/2犧02向366定向cD壟NA的合門成及盾分子刷修飾5/榴18艇/2創(chuàng)02呢367四、cD墨NA文庫將某梨種細(xì)迷胞的泡全部mR叫NA通過綠逆轉(zhuǎn)思錄合孟成cD絡(luò)NA，與妹載體擾連接伙，然求后轉(zhuǎn)嘉化宿呢主細(xì)羅胞，撿得到抵含全背部表斃達(dá)基鑒因的叨種群高，稱生為cD客NA文庫野。cD偉NA文庫犧具有注組織洪細(xì)胞痰特異訊性。構(gòu)建cD房誠(chéng)NA文庫缸，材腹料來漁自mR皂NAcD張NA文庫啊只含年有mR蹲NA的分亦子結(jié)誦構(gòu),不含嗚真核渣基因坊的間億隔序棒列和劇調(diào)控漆區(qū)。5/沙18窗/2債02緩368cD雁NA文庫凍的特辣點(diǎn)：①出發(fā)湖材料基是一并定時(shí)地空條肅件下展的細(xì)流胞總mR冬NA習(xí),在轉(zhuǎn)滅錄水妙平上旗反映瓶生物擁在特填定發(fā)剩育時(shí)哨期、掏特定年組織(或器呢官)在一許定環(huán)烏境條潔件下瓦的基哥因表餡達(dá)情嶺況。②不同白組織旬、細(xì)邀胞在督不同此時(shí)段副的mR棗NA種類鴿不同(即基臭因的帶表達(dá)蹤蝶譜不駝同)，同紀(jì)種生次物的cD掉NA文庫劃有組銹織細(xì)乳胞的擔(dān)界定均，如弓肝組勸織或風(fēng)胚胎告組織霸。5/伍18駝/2浩02投369分離楚純化很目的擱基因目的遮基因+新ve炒ct隱or王=重組DN若A分子5/接18選/2亂02業(yè)370噬菌東粒的班包裝含有cD恢NA插入臂片段鋪的重游組噬懇菌粒對(duì)只有刃經(jīng)過奧體外饅蛋白箱外殼扇包裝保反應(yīng)期，才凈能成馬為具第有侵扣染和返復(fù)制烈能力洪的成脖熟噬芬菌體鏈。5/分18奧/2燈02遷371與載體連接成重組DNA侵染大腸桿菌進(jìn)行克隆合成雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA從細(xì)胞中分離出mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶噬菌粒的包裝5/佳18明/2撕02形372五、批基因荒文庫撲的篩跨選1、核惕酸雜出交法平板候上的前菌落轉(zhuǎn)移硝酸瞞纖維是素膜溫育堿變芹性用蛋釀白酶K去除伶蛋白罩質(zhì)形成亭菌落DN施A印跡80政℃烘烤洲濾膜DN跳A固定與探輸針雜魔交檢測(cè)福雜交饑結(jié)果5/真18帳/2耍02素3732、PC帽R篩選賴法1）、鋸設(shè)計(jì)顆特異船性引乳物；2）、圾將文教庫保否存在今多孔繪培養(yǎng)進(jìn)板上碑，對(duì)娘每個(gè)零孔進(jìn)葉行PC絨R擴(kuò)增折；3）、豪對(duì)陽卡性孔晃進(jìn)行濟(jì)稀釋椒至次束級(jí)孔著，再錦對(duì)每蘇個(gè)孔序進(jìn)行PC濱R擴(kuò)增腿，直卵至鑒叼定出紫與目斗的基蒼因?qū)拺?yīng)的燃單克基隆。5/罩18詠/2牙02裳3743、免稍疫篩素選法適用米范圍粱：表這達(dá)文潑庫用某醋個(gè)基橫因產(chǎn)妥物的繳特異買性抗較體對(duì)回重組鼠克隆球進(jìn)行桂篩選違。文庫鋪于平板轉(zhuǎn)移至NC保存原板,λ噬菌體表達(dá)加入一抗洗去一抗,加入二抗加底物顯色從保存板中挑出陽性菌落5/潛18沃/2雜02規(guī)3755/凡18掀/2當(dāng)02看376第四鍵節(jié)SN衣P理論除及應(yīng)點(diǎn)用SN茂P，中遍文翻恒譯為鐮單核浪苷酸嚼多態(tài)羨性，胞指基感因組DN周A序列毫中由菠于單娃個(gè)核忍苷酸顛的突浴變而辨引起貨的多役態(tài)性喜。SNP轉(zhuǎn)換（2/3）：C→T，A→G顛換（1/3）：C→A，G→T，C→G，A→T位置基因編碼區(qū)（cSNP)基因周邊區(qū)（pSNP)基因間（iSNP)同義cSNP非同義cSNP5/憐18義/2妻02家377單倍賞型：位于摘染色騙體上屠某一衰區(qū)域霉的一述組相到關(guān)聯(lián)爸的SN神P等位塊位點(diǎn)們被稱把作單湊倍型(ha喉pl負(fù)ot鹿yp浮e)。5/馳18攝/2雪02惠378SN醫(yī)P的檢跨測(cè)技剪術(shù)1、基樣因芯罪片技花術(shù)概念尼：就是古將大財(cái)量探舒針分奮子固雨定于旗支持彎物上興，根鵝據(jù)堿紫基互冤補(bǔ)配然對(duì)原老理，零與標(biāo)除記的渠樣品誘分子季進(jìn)行近雜交卸，通驕過檢之測(cè)雜忍交信狼號(hào)的晴強(qiáng)度狡及分煮布進(jìn)世而獲小取樣受品中口靶分免子的忽數(shù)量拌和序稍列信餐息。5/釋18狡/2休02毀379基因令芯片位的工都作原危理：應(yīng)用眉已知攏核酸店序列屑作為醉靶基葬因與暗互補(bǔ)妄的探放針核硬苷酸光序列雜交，通黑過隨辱后的信號(hào)臂檢測(cè)進(jìn)行冶定性故與定齊量分諷析。具體驚操作:①將許協(xié)多特掩定的鄙寡核視苷酸偷片段蝕或cD席NA基因勇片段童作為爪靶基茂因，糧有規(guī)雁律地堂排列紋固定基于支瓦持物倦上；②樣品DN寬A/翠RN冠A通過PC饑R擴(kuò)增迷、體辛外轉(zhuǎn)帖錄等第技術(shù)腔摻入岡熒光副標(biāo)記婚分子器或放查射性瞞同位篇素作跨為探姓針；5/蜂18確/2能02粱380③然后泳按堿悅基配佛對(duì)原棒理將付兩者顆進(jìn)行駐雜交;④再通眼過熒開光或董同位裹素檢那測(cè)系范統(tǒng)對(duì)睛芯片賊進(jìn)行樹掃描僑，由跑計(jì)算躁機(jī)系婆統(tǒng)對(duì)玻每一刻探針夜上的檔信號(hào)闖作出男比較褲和檢參測(cè)，糞從而黃得出箏所需掛要的物信息露。5/蘋18向/2駱02核3812、Ta嘩qm呆an技術(shù)在反謝應(yīng)體耍系中那加入2種不同胳熒光葵標(biāo)記欺的探希針，寸這兩冰個(gè)探位針分液別與千兩個(gè)焦等位漢基因檢完全判配對(duì)放。探針尾設(shè)計(jì)分運(yùn)用棕了熒擔(dān)光共睜振能躲量轉(zhuǎn)軋移；Ta品q酶5'→3'外切侍酶的元活性轎；通過果不同伏熒光外值的投變化處，對(duì)顯基因嘉型進(jìn)妻行分鞠型。5/較18秋/2竿02刪3823、分獲子信垃標(biāo)（Mo通le理cu他la繳r燈Be沈ac徒on睜P般ro哄be）是一假種呈撥環(huán)狀培結(jié)構(gòu)阻的熒璃光標(biāo)飾記的毒寡核瓦苷酸仿，環(huán)跑狀區(qū)粉與靶彩序列親特異撐性結(jié)刪合，信莖干兼區(qū)由5~她8個(gè)堿俱基對(duì)繩組成剖，5'端帶柔有熒證光發(fā)才生基季團(tuán)，3'端帶慮有熒屋光猝甜滅基臭團(tuán)。5/裁18癢/2棟02薪383RQQRExcitation分子棉信標(biāo)（Mo果le廊cu盾la決r肢Be嗓ac爐on請(qǐng)P浸ro它be）5/勾18另/2爛02踐3844、焦倦磷酸次測(cè)序劈燕法是一危種短什片段救焦磷族酸測(cè)欺序技桐術(shù)，錢在測(cè)恐序引眉物的宋引導(dǎo)所下，托完成救短片潔段（牢含SN鉗P）的該測(cè)序腹，從蹈而實(shí)淘現(xiàn)基橫因分析型。缺點(diǎn)浙：不臣能檢專測(cè)長(zhǎng)俯片段圈，對(duì)薯于重推復(fù)序漂列沒詳有辦疊法。5/惡18桑/2缸02在385原理:生成1分子dNTP加入1分子PPi與APS反應(yīng)ATP硫酸化酶的作用下生成ATP使螢光素氧化螢光素生成雙磷酸酶降解5/炮18幟/2追02莖386原理1、測(cè)序寨引物斃與PC半R擴(kuò)增鄭的單瓦鏈DN倦A模板助相結(jié)馬合。然失后將涉其與DN貴A聚合園酶、AT鼠P硫酸殲化酶趣、熒噴光素最酶和農(nóng)雙磷育酸酶緩，以沿及底按物AP起S和熒堤光素?fù)u一起劉孵育面。2、4種dN太TP之一朽被加齡入反瘦應(yīng)體敲系，忍如與薦模板鮮配對(duì)紋，此dN傳TP與引征物的咸末端字形成某共價(jià)姨鍵，dN唇TP的焦道磷酸問基團(tuán)烤（PP般i）釋盯放出用來。而黨且釋持放出陡來的PP務(wù)i的量供與和堆模板墻結(jié)合得的dN足TP的量雙成正下比。5/卻18玩/2低02立3873、AT舌P硫酸薄化酶媽在5’懲-磷酰之硫酸任腺苷(ad府en嘗os紫in旱e帥5′ph擊os那ph常os枕ul酷fa雹te,約AP諷S）存在兵的情柏況下摩催化PP冤i形成AT指P，AT團(tuán)P驅(qū)動(dòng)耐螢光乒素酶喬介導(dǎo)范的螢光洲素向氧化諷螢光盆素的轉(zhuǎn)每化，閑氧化快螢光館素發(fā)拖出與AT攻P量成筐正比層的可見粘光信竿號(hào)。光是信號(hào)梢由CC添D攝像覽機(jī)檢燥測(cè)并喜由相治應(yīng)的快軟件吉反應(yīng)權(quán)為峰償。每字個(gè)光寄信號(hào)意的峰皇高與割反應(yīng)兔中摻激入的暮核苷基酸數(shù)羞目成塞正比馳。5/柱18溫/2陸02厭3884、AT矩P和未放摻入臉的dN初TP由雙辟磷酸太酶降涂解，盒淬滅腿光信多號(hào)，棒并再廊生反原應(yīng)體幟系。5、然磚后加介入下踏一種dN亦TP。最銀終待盤測(cè)序鳥列的明順序滿，即灘可從介反應(yīng)競(jìng)光強(qiáng)敢的信斃號(hào)峰僑中讀領(lǐng)出。在體航系中小使用幼的是dA熟TP超S而非dA僚TP，因怨為dA調(diào)TP脂S不是他熒光逝素酶萬的底傭物，參而且DN春A聚合透酶對(duì)dA找TP集S的催特化效邁率更飛高。5/可18怕/2汁02鎮(zhèn)389SN以P的應(yīng)扇用1、人沸類基笨因單淹倍型途圖的途繪制扎；2、SN薦P與人裁類疾站病易戚感基贈(zèng)因的頓相關(guān)符性分瞇析；3、指堅(jiān)導(dǎo)用詳藥與今藥物答設(shè)計(jì)買。5/廊18哥/2尋02詳390第五膚節(jié)苗基紋因克貫隆技算術(shù)克隆個(gè)體水平細(xì)胞水平基因水平5/族18匙/2贏02憲391一、RA雞CE(Ra夾pi鎖d烈am觀pl型if奧ic攻at示io詢n竹ofcD墊NAen州ds)主要予通過PC蜓R技術(shù)揮由已胸知的界部分cD抖NA序列州來得躲到完浙整的cD狡NA的5′和3′端，址又被疾稱為旁單邊PC遭R尸(o拜ne售s絲式id功ed盒P藍(lán)CR旦)和錨新定PC無R測(cè)(a動(dòng)nc液ho吉re絕d梨PC畢R)。5/久18攝/2壞02沫392主要母步驟儉：1、獲對(duì)得高恭質(zhì)量RN粒A;2、去磷舞酸化半作用；（丙帶帽桿子結(jié)評(píng)構(gòu)的mR靠NA不受幕影響糾）3、去掉mR罵NA的帽雞子結(jié)呆構(gòu)，纖加特異俊性RN真A接頭并用RN色A連接歇酶連斬接；4、以特異賠性寡匠聚dT為引惜物，針在反通轉(zhuǎn)錄氣酶的因作用聰下合成求第一刻條cD豆NA鏈，其敘包括前寡聚茶接頭充的互分補(bǔ)序頑列；5、分宇別以敞第一米條cD卻NA鏈為葬模板順進(jìn)行RA趁CE反應(yīng)爬。6、純量化后層的PC話R產(chǎn)物事克隆哀到載寬體進(jìn)劃行序列因分析。5/潑18吸/2叉02目393Ca秀lf遞I恒nt彩es攝ti賭na賄lPh已os援ph襖at逐as交e(CI濱P)牛小患腸磷丑酸酶To單ba檢cc胳o參Ac離idPy蠟ro旦ph椒os漢ph于at丘as岡e(TA蜘P)煙草物酸性窄焦磷壺酸化珠酶高質(zhì)托量RN樸A去磷剪酸化去掉mR姐NA的帽掛子結(jié)買構(gòu)加特餃異性RN程A接頭以特羊異性遍寡聚dT為引洽物，趙合成線第一擇條cD臉NA鏈5/澡18劣/2販02樓394二、悄應(yīng)用cD燥NA差示側(cè)分析冰法克掌隆基鴿因PCR指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈線性形式擴(kuò)增單鏈原理通過酶切，降低基因組DNA的復(fù)雜性更換cDNA兩端接頭5/同18屠/2涌02均3955/紙18凳/2測(cè)02敘396試驗(yàn)做材料(T攀es輪te僵r)探針汪材料(D寨ri部ve織r)酶切試驗(yàn)覺材料(T丘es床te肚r)探針句材料(D饞ri多ve申r)標(biāo)記加上見接頭,擴(kuò)增兩者伙混勻,變性,復(fù)性,具有愉同源六性的睬片段影雜交,是非符特異濾性基雙因沒雜獻(xiàn)交的童，可御能是烏特異趣性基格因，午經(jīng)過變這樣2-壺3次循競(jìng)環(huán)，但基本焰上可輪以把食特異測(cè)性基透因分委離出路來5/弟18捐/2介02本397第六諷節(jié)故蛋積白質(zhì)嚼組與嫂蛋白淋質(zhì)組旨學(xué)技索術(shù)雙向脫電泳躁（tw殼o節(jié)di瓦me諸ns體io何na扒l難el雖ec疏tr令op菊ho拔re毅si巖s,脾2-濃DE柴)技術(shù)魯，是份大多震數(shù)蛋歡白質(zhì)喉組研澤究中匹分離王復(fù)雜墊蛋白飄質(zhì)混肅合物臭的首流選技懷術(shù)廣。將來講自于全細(xì)躺胞、組織或生耕物體磚中所仰包含段的多辰達(dá)幾倘千種混合尼蛋白梅質(zhì)進(jìn)行分離、檢測(cè)和分析。一、然雙向購(gòu)電泳旁技術(shù)5/晨18旱/2候02評(píng)3982-球DE包括源等電鳳聚焦雁（is貿(mào)oe忠le燦ct示ri佩cfo想cu浸si殿ng費(fèi),抽IE煎F）及SD債S-豆PA噸GE兩種烤電泳禮技術(shù)桶。該尾方法笛根據(jù)線蛋白木質(zhì)的誘兩個(gè)刪性質(zhì)潑即等電妖點(diǎn)和分子尖量。以兩燙性電頌解質(zhì)潑為介針質(zhì)的鉆電泳裂體系蠶，不敢同等琴電點(diǎn)亞蛋白縣會(huì)聚鋪集在簡(jiǎn)介質(zhì)紋的不肥同區(qū)距域（雹等電犯點(diǎn)）連；SD鵲S-砌PA名GE將不者同分步子量級(jí)的蛋崖白質(zhì)繳分離餐。5/復(fù)18麥/2臉02飾399凝膠宇的圖安像處南理和跟分析典型罩流程凝膠睛圖像零的掃偉描：圖像泥加工慶：斑點(diǎn)均檢測(cè)斜和定僚量：凝膠紹配比苦：數(shù)據(jù)駕分析鞠：數(shù)據(jù)攀呈遞洞和解稍釋：2-雜DE數(shù)據(jù)騰庫的搏建立柿：5/比18鞠/2調(diào)02訊310溜0二、半蛋白寄質(zhì)免沸疫印仙跡實(shí)爹驗(yàn)原理繳：確保濕蛋白聰質(zhì)解專離為谷單個(gè)立多肽吉亞基今能與SD促S結(jié)合夢(mèng)；通過嘩分離晝膠的殃篩分章作用美，將蒼蛋白招質(zhì)多施肽按完分子惕量的蘋大小攤不同蘆得到修分離蟻；將蛋白購(gòu)質(zhì)固仔定于島膜上粘；以抗?fàn)铙w識(shí)幫別待災(zāi)檢蛋渡白（憐抗原恩）。固定物2AbE蛋白質(zhì)（抗原）1Ab5/謎18蕩/2伍02燃310垃1典型毒的印惱跡實(shí)齡驗(yàn)包笨括五企個(gè)步坑驟：①莊蛋白饒樣品衛(wèi)的制搖備；②堤經(jīng)過SD來S-輔PA凱GE分離支樣品擺；③銳將電脖泳后皺凝膠里上的柳蛋白斗質(zhì)轉(zhuǎn)番移至約固體腰膜上亦，用倚非特饞異性回，非印反應(yīng)襲活性贏分子斯封閉膝固體判膜上宮未吸副附蛋尤白質(zhì)旺區(qū)域務(wù)；④派用固召定在作膜上秋的蛋瘡白質(zhì)別作為蠶抗原晨，與缸固定暗的非違標(biāo)記敘抗體馬結(jié)合枝；⑤洗去慣未結(jié)精合的非一抗鞋，加坦入標(biāo)梅記的黨二抗厭，通挖過顯胸色或由放射簡(jiǎn)自顯票影法能檢測(cè)量凝膠倘中的股蛋白眉質(zhì)成擇分。5/墊18熊/2牌02扎310科25/勒18若