實(shí)驗(yàn)室常用菌株及特性

一、試驗(yàn)室常見(jiàn)菌株簡(jiǎn)介Xl1-Blue菌株基因型：endA1gyrA96(nalR)thi-1recA1relA1lacglnV44F‘[Tn10proAB+lacIqΔ(lacZ)M15hsdR17(rK-mK+)。用途：分子克隆和質(zhì)粒提取。BL21(DE3)BL21(DE3)菌株基因型：F–ompTgaldcmlonhsdSB(rB-mB-)λ(DE3[lacIlacUV5-T7gene1ind1sam7nin5])。T7RNAλDE3lacUV5區(qū)BL21的染色體上。該菌適合于非毒性蛋白的表達(dá)。用途：蛋白質(zhì)表達(dá)。BL21(DE3)plyBL21(DE3)ply菌株基因型：F-ompTgaldcmlonhsdSB(rB-mBλ(DE3pLysS(cmR)。T7IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)。適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達(dá)。用途：蛋白質(zhì)表達(dá)DH5αDH5α菌株基因型：F-endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hsdR17(rK-,λ–Φ80dlacZΔM15pUC載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)αrecA1和endA1DNADNA的提取。用途：分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達(dá)。JM109JM109菌株基因型：endA1glnV44thi-1relA1gyrA96recA1mcrBΔ(lac-proAB)e14-[F‘traD36proAB+lacIqlacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。,M13克隆序列測(cè)定和藍(lán)白斑篩選。用途：分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達(dá)。DH10BDH10B菌株基因型：F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74endA1recA1deoRΔ(ara,leu)7697araD139galUgalKnupGrpsLλ-ThemostwidelyusedE.colistrainforBACcloningisDH10B。hostforpUCandotherα-complementationvectors;pBR322usefulforgeneratinggenomiclibrariescontainingmethylatedcytosineoradenineusefulforgeneratinggenomiclibrariescontainingmethylatedcytosineoradenineresidues，usefulforplasmidrescueprocedures。ELECTROMAXDH10BT1CELLSELECTROMAXDH10BT1CELLS說(shuō)明：DH10B基因型具有以下特點(diǎn)：lacZΔM15用于重組克隆的藍(lán)/白斑篩選、mrrhsdRMS限制系統(tǒng)，允許構(gòu)建更多具有代表性的基因組文庫(kù)(1,2)endA1突變，可以增加質(zhì)粒產(chǎn)量和數(shù)量高效率轉(zhuǎn)化大小為150kb的質(zhì)粒，用于產(chǎn)生cDNA或基因組文庫(kù)的基因型，tonAT1T5噬菌體感染的抗性(DH10B?T1R)。DH10B的基因型：F·mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBCφ80lacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(araleu)7697galUgalKλ·rpsL(StrR)nupGDH10BT1R的基因型：F·mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(araleu)7697galUgalKλ·rpsL(StrR)nupGtonARosetta(DE3)菌株株，假設(shè)是特別的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，假設(shè)是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測(cè)等的純化方法等等。主要?dú)w結(jié)在表達(dá)載體的選擇上。表達(dá)載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)，終止密碼，融合Tag〔假設(shè)有的話〕，復(fù)制子，篩選標(biāo)記/報(bào)告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過(guò)試驗(yàn)室之間交來(lái)的遺傳背景？MCS是否還是原來(lái)那個(gè)MCS？是我們要特別留意的。復(fù)制子：通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類(lèi)質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)500以上，是表達(dá)載體常用的。通常狀況2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問(wèn)題。篩選標(biāo)記和報(bào)告基因：氨芐青霉素抗性是最常見(jiàn)的篩選標(biāo)記，卡那霉素或者是霉素次之，擇要留意是否會(huì)對(duì)爭(zhēng)論對(duì)象產(chǎn)生干擾物相互作用。在表達(dá)篩選中要留意的問(wèn)題應(yīng)當(dāng)就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過(guò)高簡(jiǎn)潔家“任憑倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒(méi)有經(jīng)過(guò)煮沸或者消毒等處理呢？從以50100多萬(wàn)個(gè)單位，青霉素劑量似乎越來(lái)越大了。綠色熒光蛋白是最常用的報(bào)告基因了〔留意選擇適用原核表達(dá)版本的GFP〕，其他還有半乳糖苷酶啊，熒光素酶啊等等。一些融合表達(dá)Tag也有報(bào)告基因的功能。啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動(dòng)子，生物通在下面和后繼的文章中會(huì)逐一介紹組成型表達(dá)子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高，本錢(qián)低，但是不適合表達(dá)一些對(duì)宿主的積存。誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)依靠的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。融合表達(dá)〔Tag〕〔有分N端或者C端融合表達(dá)〕，便利后繼的純化步驟或者檢測(cè)。對(duì)于特別小的分子建議用較大的Ta〔如GSTagHis-Tag是最廣泛承受的Tag。分泌表達(dá)狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間?？扇苄员磉_(dá)融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比方Thio，pMAL系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)有重要作用——把握轉(zhuǎn)錄的RNA長(zhǎng)度提高穩(wěn)定性避開(kāi)質(zhì)粒上特別表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降放在啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動(dòng)子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類(lèi)，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和依據(jù)模版上的對(duì)稱序列形成發(fā)夾構(gòu)造而終止mRNA常見(jiàn)的是rrnB rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。核糖體結(jié)合位點(diǎn)rRNA16S亞基3”端互補(bǔ)的SD序列對(duì)形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動(dòng)子下游都有SD序列，也有些載體沒(méi)有，適合自帶SD序列的基因表達(dá)，要留意。表達(dá)菌株的免費(fèi)菌株，要留神其遺傳背景是否已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)變？留神。注：以上各種特性是可以相互組合的，不是排他的！幾個(gè)常用的啟動(dòng)子和誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)最早應(yīng)用于的表達(dá)系統(tǒng)是Lac乳糖操縱子，由啟動(dòng)子Plac+操縱基因lacO+構(gòu)造基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控。lacUV5突變能夠在沒(méi)有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacIlacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因lacO上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類(lèi)似物IPTG可lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象轉(zhuǎn)變離開(kāi)lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為tac啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lacUV5的拼接雜合啟動(dòng)子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞自身的lac操縱子，無(wú)法應(yīng)付多拷貝的量表達(dá)lacIlacIq突變菌株常被選為L(zhǎng)ac/Tac/trc表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株?，F(xiàn)在的Lac/Tac/trclacIq基因，以表達(dá)更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是IPTG有確定毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不適宜，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)物的爭(zhēng)論。另外一種爭(zhēng)論方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開(kāi)發(fā)。熱誘導(dǎo)不用添加外來(lái)的誘導(dǎo)物，本錢(qián)低，但是由于發(fā)酵過(guò)程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果休克蛋白激活，一些蛋白酶會(huì)影響產(chǎn)物穩(wěn)定。λP、PL R

構(gòu)建的載體也為大家所生疏。這兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子受控于λcI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控P、PL R

啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的，P、PL R

表達(dá)載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達(dá)載體，現(xiàn)在更常見(jiàn)的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍另外一種思路是通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控cI產(chǎn)物來(lái)間接調(diào)控PP 啟L RInvitrogen的PL

trp啟動(dòng)子嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的cI基因溶源化trpcI基因的表達(dá)，從而解除強(qiáng)大的PL

啟動(dòng)子的抑制。T7啟動(dòng)子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流，這個(gè)功能強(qiáng)大兼專(zhuān)一性高的啟動(dòng)子經(jīng)過(guò)奇異的設(shè)計(jì)而成為原核表達(dá)的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為精彩代表。強(qiáng)大的T7啟動(dòng)子完全專(zhuān)一受控于T7RNAT7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA5倍——當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)T7表50%以上。由于大腸桿菌本身不含T7RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA聚合酶的調(diào)控模式就打算了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式——宿主細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過(guò)把握誘導(dǎo)條件把握T7RNA聚合酶的量，就可以把握來(lái)：有幾種方案可用于調(diào)控T7RNA聚合酶的合成，從而調(diào)控T7表達(dá)系統(tǒng)。噬菌體DE3lambda噬菌體的衍生株，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動(dòng)子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac一樣都是IPTG誘導(dǎo)。另一種策略是用不含T7RNA宿主細(xì)胞的潛在毒性而造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。然后用λCE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞——CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)pL/pR啟動(dòng)子把握T7RNA聚合酶的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7RNA聚合酶的合成。此了噬菌體之外，還可以通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒供給T7RNA聚合酶。比方有人用受溶氧濃度把握的啟動(dòng)子調(diào)控T7RNA聚合酶合成，據(jù)說(shuō)這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件把握。由于T7RNA聚合酶的調(diào)控方式仍有可能有痕量的本底表達(dá)，把握根底表達(dá)的手段之一2.T7lac啟動(dòng)子的載體——在緊鄰T7啟動(dòng)子的下游有一段lacI操縱子序列編碼表達(dá)lac阻遏蛋白(lacI)，lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色體上T7RNA聚合酶前的lacUV5啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)，也作用于載體T7lac啟動(dòng)子，以阻斷任何T7RNA聚合酶導(dǎo)致的目的基