生物制品無菌試驗規(guī)程及厭氧菌的培養(yǎng)方法

厭氧菌的培育方法厭氧菌在有氧的狀況下不能生長。要培育厭氧菌，必需制造一個無氧的環(huán)境。通常用培育基中參加復原劑，或用物常用的厭氧培育方法有很多，可依據(jù)實際狀況選用。的方法使缸內(nèi)造成厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培育出來?！灿信饸浠c的碳酸氫鈉固體以及5%檸檬酸安瓿、美蘭指示劑管、鈀催化劑管、枯燥劑。放入已接種好的平板后，盡量突變表示袋內(nèi)已達厭氧狀態(tài)，可以孵育。厭氧手套箱〔Anaerobieglovebox〕是迄今為止國際上公認的培育厭氧菌最正確儀器之一。它是一個密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個有機玻璃做的透亮面板，板上裝有兩個手套，可通過手套在箱內(nèi)進展操作，故名。箱側(cè)有一〔H和厭氧性無菌試驗。金屬硬壁型厭氧箱的抽氣、充氣、厭氧環(huán)境和溫度等均系自動調(diào)整。厭氧盒：原理同厭氧袋，有成品銷售。生物耗氧法：在一密閉的容器內(nèi)放以生物〔多是植物過。焦性末食子酸法：在一干凈的玻片上鋪上紗布或濾紙，均勻撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3NaOH溶液，快速將已接種細菌的平板倒扣在上面，用溶化的白蠟封邊，造成一個封閉空間。焦性末食子酸與堿反響后耗氧。該法用于厭氧不嚴格的厭氧菌的培育，簡潔。如有梭狀芽孢桿菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌〔魏氏梭菌〕取自氣性壞疽病人膿液的革蘭染色，顯示粗的磚形革蘭陽性桿菌。〔革1000倍〕破傷風梭菌，革蘭染色破傷風梭菌是細的末端有芽胞的革蘭陽性桿菌。芽胞中心不染氏?！哺锾m染1000倍〕生物制品無菌試驗規(guī)程生物制品不得含有雜菌〔有特地規(guī)定者除外〕，滅活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在制造過程中應由制造部門按各制品制造及檢定規(guī)程規(guī)定進展無菌試驗，分裝后的制品須經(jīng)質(zhì)量檢定部門做最終檢定。各種生物制品的無菌試驗除有特地規(guī)定者外，均應依據(jù)本規(guī)程的規(guī)定進展。抽樣原液及半成品原液及半成品應每瓶分別進展無菌試驗，其抽樣量應至少為0.1%1.0ml大罐稀釋的制品抽樣數(shù)量不得少于10ml原液及半成品每開瓶一次，應如上法抽驗。成品每亞批均應進展無菌試驗，樣品應隨機抽取，應具有代表性〔包括分裝過程的前、中、后樣品〕。1.2.1分裝量在100支〔瓶〕5101～500支〔瓶〕10支〔瓶〕，501～10000支〔瓶〕20〔10001支〔瓶〕40〔瓶〕。1.2.2每瓶裝量20ml以上的凍干血液制品，每柜凍干200瓶以下者抽檢2，200瓶及以上者抽檢46～20ml抽檢量加倍。5ml5ml1.2.1凡規(guī)定需作支原體檢查的制品，均應在半成品時按亞批進展檢查，成品可不再做。無菌試驗用培育基〔培育基處方可附錄1〕檢查制品中本菌是否存活應承受適于本菌發(fā)育生長的培育基〔在半成品時檢查，有特地規(guī)定者除外〕。檢查需氧性和厭氧性雜菌應承受硫乙醇酸鹽培育基。檢查不含汞類防腐劑制品中的需氧性和厭氧性雜菌時，該培育基中可不加硫乙醇酸鹽。檢查霉菌和腐生菌應承受改進馬丁培育基。檢查混濁制品可承受不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培育基。檢查活菌苗時可加大瓊脂含量，做成斜面。檢查支原體應承受豬胃消化液半固體或牛心消化液半固體培育基。生物制品無菌試驗用培育基亦可用經(jīng)檢定合格的枯燥培育基配制。無菌試驗培育基的靈敏度，乙型溶血性鏈球菌〔32210株〕10-8〔7316株〕和生孢子梭狀芽胞桿菌〔64941株〕10-7〔ATCc10231〕和臘葉芽枝霉應到達10-6生物制品無菌試驗培育基由質(zhì)量檢定部門與培育基制造部門會同進展靈敏度試驗。每當更換主要原材料時，應進展靈敏度試驗，合格前方可應用〔靈敏度試驗法見附錄2、3〕。各生產(chǎn)單位的質(zhì)量檢定部門應定期抽檢無菌試驗培育基的靈敏度，檢定所應定期抽檢各所的無菌試驗培育基。無菌試驗方法無菌試驗取樣、移種等全部操作，應在無菌操作室內(nèi)或無菌條件下進展，無菌操作室應常常保持清潔，在每次操作前，應徹底消毒。菌苗、疫苗、類毒素、抗毒素類制品及粘稠不易過濾的血液制品應用直接接種法進展無菌試驗。人白蛋白及人丙種球蛋白〔包括各種劑型及應用途徑的制品〕應用薄膜過濾法進展無菌試驗，其他血液制品亦可用薄膜過濾法或直接接種法進展。直接接種法菌苗、疫苗、類毒素、抗毒素類制品5.0ml以上者〔5.0ml〕取樣不應少于1.0ml5.0ml以下者〔5.0ml〕取樣不0.5ml0.5ml含防腐劑的制品，接種量與培育基的比例：用苯酚或氯仿作防腐劑者至少為1:20品內(nèi)含有甲醛、抗生素者至少為1:5020～25℃培育3～4天后移種至硫乙醇酸鹽培育基、適宜的瓊脂斜面、改進馬丁培育基各2管，每管0.5ml130～35℃培育，其余各管置20～25℃培育，培育時間除有特地規(guī)定者外共為8不含防腐劑制品，裝量在5.0ml以下者〔5.0ml〕10支安瓿混合，裝量在5.0ml以上者每7瓿混合，將混合后的樣品直接接種一組培育基，分別置20～25℃、30～35℃培育，培育時間共為8支原體培育基臨用時將半固體煮沸10～15分鐘后，冷卻到56℃左右，參加未滅能馬血清或滅能小牛血清和酵母浸液〔培育基、血清、酵母浸液之比為7:2:1〕，并可酌情參加適量青霉素或醋酸鉈，充分搖勻，等冷至35～37℃0.5～1.0ml235～37℃14混濁和接種后不能判定結(jié)果的制品，可取規(guī)定量的樣品接種于不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培育基〔200ml〕內(nèi)3～43.3.1.2項，共培育8血液制品取規(guī)定抽樣數(shù)，按以下規(guī)定，從每瓶抽取樣品，并全部接種完。樣品每瓶裝量缺乏1.0ml1～20ml以下者〔20ml〕，1.0ml以上，每支裝量為15ml的培育1.0ml樣品每瓶裝量以下者〔不含〕抽取5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽樣每支裝量為40ml的培育基，接種5.0ml。應接種的培育基支數(shù)依取樣的總量而定。接種硫乙醇酸鹽培育基與改進馬丁培育基支數(shù)之比為 2:1。接種后將硫乙醇酸鹽培育基總支數(shù)的1/2置30～35℃培育，其余置20～25℃培育，改進馬丁培育基置20～25℃培14薄膜過濾法濾膜孔徑為0.22～0.3μm。取規(guī)定抽檢樣品數(shù)，每瓶裝量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上者取半量參加滅菌薄膜過濾器內(nèi)，加壓或減壓過濾。如為含汞防腐劑者，在樣品過濾后，應用滅菌生理鹽水或其他適宜溶劑沖洗濾膜3100ml菌取出濾膜，分別放入硫乙醇酸鹽培育基2支及改進馬丁培育基1〔每支裝量不少于40ml7cm〕。假設使用一個過濾裝置，則將該膜剪成三等分，分別放入規(guī)定培育基中。將濾膜放入培育基后，一支硫乙醇酸鹽培育基30～35℃培育，其余各支培育基置20～25℃培育。培育時間不少于7最好承受全封閉式一次性微孔過濾集菌器，要求每支培育器培育裝量為 100ml。檢查厭氧性雜菌用培育基需加熱驅(qū)氧者，必需冷卻到45℃以下再行接種。凍干制品按使用說明書或瓶簽規(guī)定的稀釋量稀釋后進展無菌試驗。判定無雜菌生長判為合格〔