非小細胞肺癌文獻一篇

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LiquidChromatography/MassSpectrometryMethodsforMeasuringDipeptideAbundanceinNon-SmallCellLungCancer褚曉芳使用液相色譜-質譜技術分析非小細胞肺癌患者組織中二肽豐度的變化主要內容肺癌簡介實驗流程樣品處理LC/MS分析MS/MS分析MS數(shù)據(jù)分析質量控制統(tǒng)計分析主要內容實驗結果肺癌相關二肽數(shù)據(jù)庫產生肺癌組織中二肽的識別MS/MS二肽譜圖不同分析條件下二肽的識別肺癌組織中二肽的靶標分析結論驗證研究意義及不足肺癌簡介在美國，肺癌死亡率在所有癌癥中最高，2012年共有165000死于肺癌。在全世界范圍內，估計肺癌影響超過100萬人。肺癌中80%是非小細胞肺癌目前，肺癌早期及進展階段仍沒有靈敏度高的診斷手段肺癌相關的代謝組學研究較少肺癌相關研究肺癌早期的代謝組學研究表明在腫瘤樣本中有許多代謝物發(fā)生表達的改變在不同化療耐藥性的肺癌細胞系中，膽堿、脂肪、乳酸、甘氨酸水平有明顯的改變在埃羅替尼治療或進行切除手術的患者中，同側細支氣管肺泡癌發(fā)生病變在肺癌患者血清和組織樣本的混合物中，有48種代謝物在組織和肺癌不同進展階段有明顯改變二肽對真核生物的作用二肽在蛋白質營養(yǎng)、增長及發(fā)展中其重要作用二肽水平通過肽轉運體中的膜蛋白調節(jié)肽轉運體廣泛存在于大腦、胰腺、腸、腎臟等器官中主要內容實驗流程樣品處理LC/MS分析MS/MS分析MS數(shù)據(jù)分析質量控制統(tǒng)計分析樣品處理Testingset:9名確診為肺癌惡性腺瘤的男性樣本:

①有代表性的肺癌組織切片

②與腫瘤組織相鄰的正常組織切片

③距原發(fā)腫瘤＞3cm處的正常組織切片樣品處理Validationset10名確診為肺癌惡性腺瘤的男性樣本:

①有代表性的肺癌組織切片②距原發(fā)腫瘤＞3cm處的正常組織切片樣品處理Validationset6名確診為肝癌的患者目的:

證明在非小細胞肺癌患者中找到的代謝物標

志物具有特異性所有樣品在分離后快速冷凍30-60min，處理前在-80℃保存樣品處理組織提?、賹⒎蛛x的組織稱重后用不銹鋼珠同質化，頻率為20次/s，持續(xù)30s②加入標準溶劑混合物重復4次同質化過程③用蒸汽離心蒸發(fā)濃縮器干燥氯仿-甲醇-水層中的極性代謝物④將干燥后的樣品復溶于水樣品處理⑤衍生化：50μL極性代謝提取物+25μL0.1M的四硼酸鈉緩沖液+50μL20mM丹磺酰氯(乙腈為溶劑)，渦旋混勻丹酰衍生化目的:提高代謝物檢測敏感性10-1000倍提高極性代謝物在液相色譜柱上的保留和分離⑥室溫孵育30min，加入50μL0.5%甲酸停止反應⑦將反應混合液上層清液轉移至自動采樣瓶主要內容實驗流程樣品處理LC/MS分析MS/MS分析MS數(shù)據(jù)分析質量控制統(tǒng)計分析LS/MS工作原理：通過液相色譜分離化合物(主要是沸點高、極性強、熱穩(wěn)定性差的化合物)，再通過電噴霧電離產生樣品離子，進入質譜儀后按質荷比分離，然后測定各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的。梯度匆洗脫穩(wěn)裝置:利用祖兩種掏或兩擁種以趙上溶態(tài)劑，俯按照尊一定洽的時裳間順狠序連挺續(xù)或求階段啊改變寄溶劑肢比例狡，從衡而改尸變流攔動相液的極銜性、辟離子換強度第和PH值，櫻使樣捧品的旱各組肚分在抗最佳阿容量療因子姜值范銜圍內調流出縣色譜狡柱，隱改善展分離壘效果質譜解析味一般淘步驟:核對基獲得闖的譜輛圖，各扣除速本底掘等因圓素引供起的禮失真盡可屋能判岸斷分侄子離踐子，稍即確揭定分販子質洲量;譜圖順中往券往有圓很多貴碎片愿離子俯，這蹦些碎邁片離圍子是魔由準驅分子繭離子經裂解墻產生假設和排交列可握能的炮結構賣歸屬素，高舉質量做離子戀顯示嬌的M-路1，M-援15，M-尖18隱……即表示泳失去H、CH3、H2O…蛛…推出開可能超的分遮子結難構，衫以標穴準譜蛇圖對償比，左確定仍分子竄結構LC大/M如S分析儀器綁：安蹤蝶捷倫65估20系列競四極悉桿飛價行時念間串餐聯(lián)質恥譜儀(帶有安捷鋸倫12添90超高宅效液討相色飾譜系群統(tǒng))方法A：Zo超rb姜ax疼C18液相擁分析做柱流動薄相流失動速肚率5μL/m園in洗脫葡液B:濟5%呈-9袖5%濃度狗梯度洗脫翁時間:3匙0m程in，95撓%B時維塑持5m粱inLC濤/M象S分析溶劑A:蠻HP次LC水+0共.1旗%水溶劑B:顛LC藥/M似S級乙之腈+0匠.1烘%甲酸毛細各管溫霞度:3飽25℃m/歇z1不0-浴10棵00之間騙進行訊全譜歇掃描常用花固定說相:硅膠誼、氨津基、霧二醇巴基等常用嗎流動往相:水、詳乙腈很、異共丙醇LC物/M隔S分析方法B:Ph抱en杠om野en淺ex孟K謹in兵et諒ex能C18液相寧分析劍柱流動要速率0.此5m淡l/其mi暢n進行蠟洗脫洗脫方液B:薯5%孔-9或5%濃度綿梯度T(min)B(%)0.5520.5602595309555LC辜/M坑S分析方法C:Ki墾ne爭te否x液相巖分析古柱流動蘿速率0.鮮5m融l/徑mi誼n進行碧洗脫洗脫疏液B:墾10剃%-線95務%濃度燦梯度T(min)B(%)0.5102.52017.560189555主要搭內容實驗邀流程樣品異處理LC宰/M燒S分析MS歲/M揮S分析MS數(shù)據(jù)軋分析質量消控制統(tǒng)計板分析MS版/M主S分析儀器蕉：安快捷倫65趟20系列慰四極膝桿飛注行時中間串膨聯(lián)質識譜儀靶向MS側/M少S分析:保留健時間:0級.6逼mi答n離子鈔碰撞代能量:2京6V勢(質量趨大的懼分子:3摩2V籌)分離啊寬度:4流m/虎z為何浴在用LS值/M鋼S分析命后，現(xiàn)還要農采用MS趟/M謹S分析徹？LS撿/M瘦S譜圖督中樣械品的灑準分溝子離溝子峰煉豐度謠較高塔，碎繁片峰桿則少兇而弱膚，因縱此主掃要給險出與用樣品烏的分夠子質預量相午關的祥信息矛，而摟很少殺給出形與樣爽品結粗構有短關的窩信息遇，采嘴用多讓級質唯譜MS表/M遼S可以拔彌補脂這一綠缺陷涼。主要味內容實驗薦流程樣品潤處理LC溫/M券S分析MS刊/M我S分析MS數(shù)據(jù)銳分析質量吳控制統(tǒng)計蹤蝶分析MS數(shù)據(jù)瘋分析非靶耐向數(shù)城據(jù)分余析:使用乎代謝晶組學烈分析盈軟件軋?zhí)崛』瓯Ａ羰r間覺一致陶的峰榨，用遵最小沾二乘錢法檢雕測非賽靶向鍬代謝去物的巷特征尊，比夢對特系征分偽析數(shù)腔據(jù)庫轎識別銀評估話的結蠻果。靶向榜二肽主數(shù)據(jù)撿分析:使用卻二肽分數(shù)據(jù)姿庫和般特征煉分析孔數(shù)據(jù)鄰庫進啄行比堵對MS數(shù)據(jù)魂分析為什戚么要李進行亞峰對敗齊？為了艙利用鍵色譜累圖中比所有響可以皇識別療的峰淘的信駛息，槳必須木對譜欲圖進五行峰剝匹配脂，不尖同樣秋本中儀同一辛代謝刷產物蓋在生趴成的汪數(shù)據(jù)踢矩陣聰中必司須由勿同一械變量寇來表榮示，鐮這樣嚴各個練樣本駐間的替數(shù)據(jù)掉才可想以比擦較。對數(shù)域據(jù)的全要求師：①瓜有相惰同數(shù)嗽目的賽變量孩描述飽②每參個變失量在重樣本僅中均誰出現(xiàn)過③所早有樣兔本中曲的變小量代季表的娘意義柱相同主要余內容實驗謝流程樣品糊處理LC擔/M統(tǒng)S分析MS搞/M湊S分析MS數(shù)據(jù)笛分析質量旗控制統(tǒng)計訂分析質量子控制進樣秧前后吃分析恥經過膽衍生寄化的26種氨果基酸沉標準酸混合脈物目的:保證故衍生惡化作鍋用有挺效進搬行檢驗甲儀器融性能痰狀態(tài)綱的良刺好保證豎能夠朽獲得言連續(xù)例的保況留時努間主要容內容實驗梅流程樣品緩處理LC超/M痛S分析MS刷/M圖S分析MS數(shù)據(jù)滲分析質量酬控制統(tǒng)計斧分析統(tǒng)計筍分析非參數(shù)哭秩和理檢驗:評估團腫瘤俱組織期與兩吹種正抬常組才織中世檢測攝的二莖肽水嘆平有獲無明幟顯變詳化結果:沒有幸相關鍬的二衡肽有貴顯著刻性差虧別二項肺分布:在檢己測的33兼4種二艘肽中階有10送5種有介統(tǒng)計浴學意詳義因3個樣晶本來說自同陵一個般體，丈故需夕分析辰樣本孟大小驚對代冰謝物姓檢測絲式結果戶的影衰響主要煮內容實驗汗結果肺癌尸相關溫二肽稻數(shù)據(jù)圣庫產爆生肺癌縫組織臉中二究肽的賭識別MS暢/M惡S二肽度譜圖不同券分析姜條件曲下二只肽的姥識別肺癌愛組織榴中二含肽的蔑靶標津分析結論捆驗證研究例意義傷及不斜足肺癌洲相關廚二肽商數(shù)據(jù)繼庫標準榨品二兔肽合峰成:基于醋組合源合成羽法的菊陣列企及包許含組飛氨酸體的二拐肽，掘不能抵合成合的二廉肽通摧過Aa宏ns叔pe燭c驚In淘t公司謎獲得混合互物配脈置:將7-默30毫微隨升具帝有相刷同C羧基與端的18種二埋肽混浙合并坐用50疾%乙腈箭和水非稀釋幻玉成10μM，丹罪酰衍堪生化禽后，駝采用LC方法B及MS全譜雪掃描肺癌激相關夾二肽功數(shù)據(jù)設庫氨基焦酸是腰生物餐樣本蘇中唯剖一分阻析物比，故君用氨汗基酸作為標準介品氨基寫酸保超留時山間的止多項劍對齊過是對危齊二狗肽保壞留時兄間最廚好的而方法肺癌印組織茶中二票肽的擊識別36盤1種二舊肽中花只有16污1種有業(yè)獨特斜的化椅學分哥子式嚼，只田有17種是右單一愿的異化構體(A仍A)同分宰異構挽體二危肽的濃識別影需要帖仔細輔比較筆其滯蠟留特索性合并膀腫瘤捐樣本鳴再分崇析得注到27毛9種二懶肽，治其中23蛾4種二柱肽的愚質量攜精度仆＜5p燒pm，45種＜10塌pp溝m，將27晨9種二鄙肽保竭留時死間與激數(shù)據(jù)煌庫比六對，預大部趁分二嚇肽保消留時渾間在0.固1m洽in內，軌但有咳精氨森酸的杯二肽盯標準領品和辜樣品應有明分顯不癢同MS士/M含S二肽工譜圖丹酰劍化二標肽的MS諷/M就S譜圖歲通常補不提聲供信叮息，線而主鐵要以倚丹酰怎離子籌為主由丹銳酰分扁離出狐來的C12H12N陽離生子在遵大部五分丹暫?；叨膬S譜圖兇中產般生基艙峰，m/頂z為17限0.板09造6495煮%測量皆值與舒真實夸值相虛比降婚低(精度樂誤差竿小于13敘pp字m)根據(jù)盜測量惠值得大到的及化學按分子租式精閑度誤稍差都輔在13鹽pp癥m以內MS默/M憤S二肽失譜圖MS耳/M見S二肽堂譜圖其他時丹酰閥特征術的離豬子還撫包括:m/右z參23明4.鏟05酬9否(C12H12NS借O2)在單君一帶釀電離鍛子中柜普遍譜存在傭且變伙異較智大；m/邀z惜25鼻2.蒜06算9郊(C12H14NS季O3)在含種氧二染肽中輩普遍疏存在戰(zhàn)；m/木z洪18鉛6.搬09駁2隊(C12H12NO援)離子鑰也很臟普遍MS漲/M迅S二肽啊譜圖丹?？然[肽分柜裂處(經典梨離子)MS峽/M雙S二肽峽譜圖丹?？鼗浑姆终f裂特眠征碎棟片MS爹/M鼓S二肽裙譜圖MS基/M財S二肽植譜圖動其他燙明顯譽特征尸：由氨辛基酸I/狹L/挺V/嫩A組成劫的二疊肽在排位1或位2有經思典的I離子色氨脹酸的I離子民會發(fā)嚇生中修性分智子的我喪失峽，產績生m/果z1關44和13惡0的特堅征性寧碎片二肽宴通過搭中性悄丟失(焦谷篇氨酸嗚鹽)使c離子女增加帶有朱氨基萌酸R、K、H的二紡肽有財復雜諒的特煙征二肽XR、RX使m/興z為15免6/幫15巴7碎片籌增多MS惹/M社S二肽袖譜圖賴氨構酸二畫肽經目常帶祖雙電憐荷，m/例z3款17碎片緊顯著迎，還謊有m/票z8惜4經典丹碎片組氨捏酸二象肽也嘩經常猶帶雙悄電荷屆，I1和I2碎片殼離子出較多HX雙電展荷二督肽與NX、MX有相糟同的m/鵲z2清61的碎跑片離屈子蛋氨酸二蠅肽在m/清z3獲37發(fā)生舍多次閃分裂舉，產迫生不鑰同碎躺片離畢子不同踏分析追條件炸下二誼肽的蔬識別氨基鞋酸作縫為內規(guī)標可甜以使孕來自款不同燃實驗真室的構代謝警組數(shù)滑據(jù)具溜有可西比性本地勿散點里平滑肥估計(L嶄OE蓄SS吸)是最提好的芳校準盛二肽鈔保留趨時間蘆的方菜法肺癌克組織攀中二筋肽的斤靶標考分析采用慈最小太二乘清法比拼較腫密瘤組炸織與逆正常菌組織唯中豐遮度變哨化明貫顯的臂二肽有25艱7種二師肽至蠶少在呢一種彼組織婦中被乳檢測裙到，肯其中25矮3種在某腫瘤杯組織綱中檢孫測到在腫幼瘤組福織中鞭檢測拐到90種二不肽豐肯度與麗正常獄組織認相比殊有明滿顯的腳增加(倍數(shù)蝴＞2,口P＜0.偽05住)成倍片增加處的倍窮數(shù)在2.贊1-序23漲.1不等簽，