分子生物學(xué)基礎(chǔ)第二章

分子生物學(xué)基礎(chǔ)第二章第一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)

染色體一、染色體概述染色體在不同的細(xì)胞周期有不同的形態(tài)表現(xiàn)。在細(xì)胞大部分時(shí)間的分裂間期表現(xiàn)為染色質(zhì)(chromatin)。染色質(zhì)是細(xì)胞核內(nèi)可以被堿性染料著色的一類非定形物質(zhì)。它以雙鏈DNA為骨架，與組蛋白(hilston)、非組蛋白(non-histon)以及少量的各種RNA等共同組成絲狀結(jié)構(gòu)。在染色質(zhì)中，DNA和組蛋白的組成非常穩(wěn)定，非組蛋白和RNA隨細(xì)胞生理狀態(tài)不同而有變化。在細(xì)胞分裂期，染色質(zhì)纖絲經(jīng)多級螺旋化形成一種有固定形態(tài)的復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)的染色體。染色體只在細(xì)胞分裂期，人們才能在光學(xué)顯微鏡下觀察到這些結(jié)構(gòu)。它們存在于細(xì)胞核，呈棒狀的可染色結(jié)構(gòu)，故稱為染色體。細(xì)胞分裂時(shí)，每條染色體都復(fù)制生成一條與母鏈完全一樣的鏈，形成同源染色體對。作為遺傳物質(zhì)，染色體具有以下特征：①分子結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定；②能夠自我復(fù)制，使親代、子代之間保持連續(xù)性；③能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成；

④能夠產(chǎn)生可遺傳的變異。

第二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)

染色體二、原核生物的染色體1．細(xì)菌染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)大腸桿菌染色體長為1333μm，而要裝入長約2μm寬1μm的細(xì)胞中，為此DNA必定以折疊或螺旋狀態(tài)存在。有實(shí)驗(yàn)證明：在DNA分子進(jìn)行折疊或螺旋過程中還依賴于RNA分子的作用。如300μm的環(huán)狀DNA（圖2-1A），通過RNA分子的連接作用將DNA片段結(jié)合起來形成環(huán)（loop），從而導(dǎo)致DNA長度縮小成為25μm（圖2-1B），在活體大腸桿菌染色體上約有50多個(gè)這樣的環(huán)。接著每個(gè)環(huán)內(nèi)DNA進(jìn)一步螺旋，使DNA長度進(jìn)一步縮短為1.5μm，而形成更高級結(jié)構(gòu)的染色體（圖2-1C）。因此，細(xì)菌的染色體不是一條裸露的DNA鏈，而是以高度的組裝形式存在，同時(shí)這種組裝不僅為了適應(yīng)細(xì)菌細(xì)胞的狹小空間，而且還要有利于染色體功能的實(shí)現(xiàn)，便于染色體復(fù)制和基因表達(dá)。第三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)

染色體

圖2-1大腸桿菌（E.coli）染色體的基本結(jié)構(gòu)

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染色體2．原核生物DNA基因組的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

（1）結(jié)構(gòu)簡練

原核DNA分子的絕大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的，只有非常小的一部分不轉(zhuǎn)錄，這與真核DNA的冗余現(xiàn)象不同。（2）基因種類和數(shù)量較少

原核細(xì)胞中染色體一般只有一條雙鏈DNA分子，且大都帶有單拷貝基因，且多以重疊基因的形式存在，只有很少數(shù)基因（如rRNA基因）是以多拷貝形式存在的；整個(gè)染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成；幾乎每個(gè)基因序列都與它所編碼的蛋白質(zhì)序列呈線性對應(yīng)狀態(tài)。（3）以操縱子為轉(zhuǎn)錄單元

原核生物DNA序列中功能相關(guān)的RNA和蛋白質(zhì)基因，往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定部位，形成功能單位或轉(zhuǎn)錄單元，它們可被一起轉(zhuǎn)錄為含多個(gè)mRNA的分子，叫多順反子mRNA。ΦX174及G4基因組中就含有數(shù)個(gè)多順反子。功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條多順反子mRNA鏈，然后再翻譯成各種蛋白質(zhì)。第五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)

染色體三、真核生物染色體的組成1．染色體蛋白質(zhì)（1）組蛋白

組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，富含帶正電荷的Arg和Lys等堿性氨基酸，等電點(diǎn)一般在pHl0.0以上，屬堿性蛋白質(zhì)，可以和酸性的DNA非特異性緊密結(jié)合，而且一般不要求特殊的核苷酸序列，通常用0.25mol/LHCL或H2SO4從染色質(zhì)中分離得到。真核生物染色體的組蛋白有5種，即H1、H3、H2A

、H2B和

H4。組蛋白中，H3，H4，H2A，H2B，其N端氨基酸都是堿性氨基酸，堿性N端借靜電引力與DNA起作用，組蛋白之間借此相互聚合，C端是疏水端；而H1則相反，C端是堿性氨基酸，N端是疏水端，而且H1具有4—5種分子類型，所以在遺傳上H1保守性最少。

組蛋白可進(jìn)行各種修飾。由于組蛋白N端賴氨酸的乙酰化，改變了賴氨酸所負(fù)載的電荷，從而影響了與DNA的結(jié)合，有利于轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，而組蛋白的磷酸化主要在組蛋白N端絲氨酸殘基上進(jìn)行?，F(xiàn)一般認(rèn)為組蛋白磷酸化可減弱組蛋白與核酸的結(jié)合，從而降低組蛋白對DNA模板活力的抑制，從而利于轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。而甲基化組蛋白。第六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)

染色體（2）非組蛋白

與染色體組蛋白不同與染色體組蛋白不同，非組蛋白是指染色體上與特異DNA序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)，所以又稱序列特異性DNA結(jié)合蛋白(sequence—specificDNA—bindingproteins)。一般來說，非組蛋白所含酸性氨基酸的量超過堿性氨基酸的量，所以帶負(fù)電荷。非組蛋白和組蛋白不同，它具有種屬和組織特異性，而且在活動的染色質(zhì)中比不活動的染色質(zhì)中含量要高。非組蛋白在整個(gè)細(xì)胞周期中都進(jìn)行合成，而不像組蛋白僅在S期和DNA復(fù)制同步進(jìn)行。非組蛋白的功能：①能幫助DNA分子折疊，以形成不同的結(jié)構(gòu)域，從而有利于DNA的復(fù)制和基因的轉(zhuǎn)錄；②協(xié)助啟動DNA復(fù)制；③特異性地控制基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。非組蛋白和組蛋白一樣可以被磷酸化，這被認(rèn)為是基因表達(dá)和調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。

第七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)

染色體2．染色質(zhì)和核小體

（1）核小體結(jié)構(gòu)的主要實(shí)驗(yàn)證據(jù)

用溫和的方法破壞細(xì)胞核，將染色質(zhì)鋪展在電鏡銅網(wǎng)上，通過電鏡觀察，未經(jīng)處理的染色質(zhì)自然結(jié)構(gòu)為30nm的纖絲，經(jīng)鹽溶液處理后解聚的染色質(zhì)呈現(xiàn)一系列核小體相互連接的串珠狀結(jié)構(gòu)，念珠的直徑為10nm；用微球菌核酸酶(micrococcalnuclease)消化染色質(zhì)，經(jīng)過蔗糖梯度離心及瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，如果完全酶解，切下的片段都是200bp的單體；如果部分酶解，則得到的片段是以200bp為單位的單體、二體(400bp)、三體(600bp)等等。蔗糖梯度離心得到的不同組分，在波長260nm的吸收峰的大小和電鏡下所見到的單體、二體、三體的核小體完全一致；應(yīng)用X射線衍射、中子散射及電鏡三維重建技術(shù)，研究染色質(zhì)結(jié)晶顆粒，發(fā)現(xiàn)顆粒是直徑為11nm、高6.0nm的扁圓柱體，具有二分對稱性(dyadsymmetry)，核心組蛋白的構(gòu)成是兩個(gè)H3分子和兩個(gè)H4分子先形成四聚體，然后再與兩個(gè)由H2A和H2B構(gòu)成的異二聚體(heterodimer)結(jié)合成八聚體。第八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)

染色體（2）核小體結(jié)構(gòu)要點(diǎn)

每個(gè)核小體單位包括200bp左右的DNA、一個(gè)組蛋白八聚體以及一個(gè)分子的組蛋白H1；組蛋白八聚體構(gòu)成核小體的核心結(jié)構(gòu)，分子量100kD，由H2A、H2B、H3和H4各兩個(gè)分子所組成；DNA分子以左手方向盤繞八聚體兩圈，每圈83bp，共166bp。用微球菌核酸酶水解，可得到不含組蛋白H1的146bp的DNA片段(1.75圈)。一個(gè)分子的組蛋白H1與DNA結(jié)合，鎖住核小體DNA的進(jìn)出口，從而穩(wěn)定了核小體的結(jié)構(gòu)；兩個(gè)相鄰核小體之間以連接DNA(1inkerDNA)相連，長度為0～80bp不等（圖2-2）。

第九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)

染色體AB圖2-2核小體單體的存在及核心顆粒的形成A：為核小體結(jié)構(gòu)示意圖；B：為核小體單元的產(chǎn)生第十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)一、DNA的組成

1．堿基核酸中的堿基分兩類：嘧啶堿和嘌呤堿。嘧啶堿是母體化合物嘧啶的衍生物。核酸中常見的嘧啶堿有三類：胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。其中胞嘧啶為DNA和RNA兩類核酸所共有。胸腺嘧啶只存在于DNA中，但是tRNA中也有少量存在；尿嘧啶只存在于RNA中。植物DNA中含有一定量的5–甲基胞嘧啶。在一些大腸桿菌噬菌體DNA中，5–羥甲基胞嘧啶代替了胞嘧啶。嘌呤堿有兩類：腺嘌呤及鳥嘌呤。嘌呤堿是由母體化合物嘌呤衍生而來的。除了5種基本的堿基外，核酸中還有一些含量甚少的稀有堿基。稀有堿基種類極多，大多數(shù)都是甲基化的堿基。tRNA中含有較多的稀有堿基，可高達(dá)10％。目前已知稀有堿基和核苷達(dá)近百種。圖2-3A是存在于DNA和RNA分子中的5種含氮堿基的結(jié)構(gòu)式。

第十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)2．核苷核苷是一種糖苷，由戊糖和堿基縮合而成。糖與堿基之間以糖苷鍵相連接。糖的第一位碳原于（C1）與嘧啶堿的第一位氮原子(N1)或與嘌呤堿的第九位氮原子（N9）相連接。所以，糖與堿基間的連鍵是N—C鍵，一般稱之為N—糖苷鍵；核苷中的D–核糖及D–2′–脫氧核糖均為呋喃型環(huán)狀結(jié)構(gòu)。糖環(huán)中的C1是不對稱碳原子，所以有а–及β–兩種構(gòu)型。但核酸分子中的糖苷鍵均為β–糖苷鍵。應(yīng)用X射線衍射法已證明，核苷中的堿基與糖環(huán)平面互相垂直。根據(jù)核苷中所含戊糖（圖2-3B）的不同，將核苷分成兩大類：核糖核苷和脫氧核糖核苷。對核苷進(jìn)行命名時(shí)，必須先冠以堿基的名稱，例如腺嘌呤核苷、腺嘌呤脫氧核苷等。RNA中含有某些修飾和異構(gòu)化的核苷。核糖也能被修飾，主要是甲基化修飾。tRNA和rRNA中還含少量假尿嘧啶核苷ψ，在它的結(jié)構(gòu)中，核糖不是與尿嘧啶的第一位氮（N1），而是與第五位碳（C5）相連接。細(xì)胞內(nèi)有特異的異構(gòu)化酶催化尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)變?yōu)榧倌蜞奏ず塑铡５谑?，共四十八頁，編輯?023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)3．核苷酸

核苷的磷酸酯叫做核苷酸，分為(核糖)核苷酸[(ribo)nucleotide]和脫氧(核糖)核苷酸[deoxy(ribo)nucleotide]兩大類，分別構(gòu)成DNA和RNA的基本結(jié)構(gòu)單位。所有的核苷酸都可在其5′位置連接一個(gè)以上的磷酸基團(tuán)；從戊糖開始的第一、二、三個(gè)磷酸殘基依次稱為а、β、γ。а和β及β和γ之間的鍵是高能鍵，為許多細(xì)胞活動提供能量來源。核苷三磷酸縮寫為NTP，核苷二磷酸縮寫為NDP。5′核苷三磷酸是核酸合成的前體。

細(xì)胞內(nèi)還有各種游離的核苷酸和核苷酸衍生物，它們都具有重要的生理功能。因此，對于核酸和蛋白質(zhì)系統(tǒng)，核苷酸相當(dāng)于氨基酸，堿基相當(dāng)于氨基酸的功能基。下面列舉幾種核苷酸的結(jié)構(gòu)式（圖2-3C）。核糖核苷的糖環(huán)上有3個(gè)自由羥基，能形成3種不同的核苷酸。(圖2-3C)脫氧核苷的糖環(huán)上只有2個(gè)自由羥基，所以只能形成兩種核苷酸。生物體內(nèi)游離存在核苷酸多是5′-核苷酸。用堿水解RNA時(shí)，可得到2′-與3′-核糖核苷酸的混合物。第十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)

圖2-3堿基、戊糖和核苷酸的結(jié)構(gòu)A：堿基；B：戊糖；C：核苷酸第十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)二、DNA的一級結(jié)構(gòu)DNA由數(shù)量龐大的4種脫氧核苷酸通過3′，5′–磷酸二酯鍵連接而成，DNA的一級結(jié)構(gòu)就是這些脫氧核苷酸在分子中的排列順序（序列）。就是DNA分子內(nèi)堿基的排列順序。它以密碼子的方式蘊(yùn)藏著遺傳信息，以堿基序列的方式蘊(yùn)藏著對遺傳信息的調(diào)控。DNA分子中堿基序列似乎是不規(guī)則的，實(shí)際上是高度有序的。任何一段DNA序列都可以反映出功能特異性和它的個(gè)體的、種族的特征。一級結(jié)構(gòu)決定了DNA的二級結(jié)構(gòu)、折疊成的空間結(jié)構(gòu)。這些高級結(jié)構(gòu)又決定和影響著一級結(jié)構(gòu)的信息功能，即基因的啟動和關(guān)閉。因此，研究DNA的一級結(jié)構(gòu)對闡明遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能以及它的表達(dá)、調(diào)控都是極其重要的。DNA幾乎是所有生物遺傳信息的攜帶者。它是信息分子，攜帶以下兩類不同的遺傳信息。一類是負(fù)責(zé)編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的信息。在這一類信息中，DNA的一級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)之間基本上存在共線性關(guān)系。第十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)另一類一級結(jié)構(gòu)信息與基因的表達(dá)有關(guān)，負(fù)責(zé)基因活性的選擇性表達(dá)和調(diào)控。這一部分DNA的一級結(jié)構(gòu)參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、DNA的復(fù)制、細(xì)胞的分化等功能，決定細(xì)胞周期的不同時(shí)期和個(gè)體發(fā)育的不同階段、不同器官、不同組織以及不同外界環(huán)境下，基因是開啟還是關(guān)閉，開啟量是多少等等。這一類DNA一級結(jié)構(gòu)有兩種情況：①它本身負(fù)責(zé)編碼某些調(diào)控蛋白，這些蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)調(diào)控相應(yīng)的基因；②一些DNA一級結(jié)構(gòu)區(qū)段負(fù)責(zé)基因表達(dá)的調(diào)控位點(diǎn)，即決定基因開啟或關(guān)閉的元件。一般由調(diào)控蛋白與調(diào)控元件相互作用來有效地控制基因。后者成為調(diào)控蛋白作用的靶位點(diǎn)。DNA分子中有各種特異性元件，如與復(fù)制有關(guān)的各種位點(diǎn)都有它們特異性的一級結(jié)構(gòu)。DNA分子總的A+T與G+C含量相等，但在某些區(qū)域A+T的含量大大增高。由于A–T堿基對有2個(gè)氫鍵，而G–C之間有3個(gè)氫鍵，在很多有重要調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)域都富含有A–T，如啟動子區(qū)域等，有利于雙鏈的解開，某些蛋白質(zhì)與解鏈部位的相互結(jié)合。第十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)三、DNA的二級結(jié)構(gòu)

DNA的二級結(jié)構(gòu)指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。1．雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的依據(jù)X射線衍射數(shù)據(jù)說明DNA含有兩條或兩條以上具有螺旋結(jié)構(gòu)的多核苷酸鏈，而且沿纖維長軸有0.34nm和3.4nm兩個(gè)重要的周期性變化。choqoe等應(yīng)用層柝法對多種生物。DNA的堿基組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)中的腺嘌呤數(shù)目與胸腺嘧啶的數(shù)目相等，胞嘧啶(包括5–甲基胞嘧啶)的數(shù)目和鳥嘌呤的數(shù)目相等。后來又有人證明腺嘌呤和胸腺嘧啶間可以生成兩個(gè)氫鍵；而胞嘧啶和鳥嘌呤之間可以允許生成3個(gè)氫鍵。用電位漓定法證明DNA的磷酸基可以滴定，而嘌呤和嘧啶的可解離基團(tuán)則不能漓定，說明它們是由氫鍵連接起來的。第十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)由此得出DNA雙螺旋模型的要點(diǎn)：主鏈：DNA主鏈由脫氧核糖和磷酸相互間隔連接而成，從3′，5′–磷酸二酯鍵的方向來看，雙螺旋中2條多聚脫氧核苷酸鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械摹?條主鏈處于螺旋的外側(cè)，堿基處于螺旋的內(nèi)側(cè)，且主鏈?zhǔn)怯H水性的。2條主鏈形成右手螺旋，有共同的螺旋軸，螺旋的直徑是2nm。堿基配對特征：由于受幾何形狀限制，只有A和T配對，G和C配對，其形狀才能正適合雙螺旋的大小，安置在雙螺旋內(nèi)，不會使螺旋有任何畸變或喪失對稱性。這兩種堿基對還有另一個(gè)特征，就是處于一個(gè)平面具有二次旋轉(zhuǎn)對稱性，即一個(gè)堿基對旋轉(zhuǎn)180°并不影響雙螺旋對稱性。這意味著A—T、T—A、G—C和C—G四種堿基對形式都允許處在這種幾何形狀中，即雙螺旋結(jié)構(gòu)只限定配對方式，并不限定堿基的排列順序。第十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)堿基：堿基環(huán)是一個(gè)共軛環(huán)，堿基對構(gòu)成的平面與螺旋軸近似垂直，螺旋軸穿過堿基平面，相鄰堿基對沿螺旋轉(zhuǎn)36°角，上升0.34nm。因此，每10對堿基繞軸旋轉(zhuǎn)一圈組成一節(jié)螺旋，螺距3.4nm。大溝和小溝：沿螺旋軸方向觀察，可以看到配對的堿基并沒有充滿螺旋的空間。由于堿基對與糖環(huán)的連接都是在堿基對的同側(cè)，故這種不對稱的連接導(dǎo)致雙螺旋表面形成2個(gè)凹下去的溝，一個(gè)寬一個(gè)窄，分別稱為大溝和小溝。糖一磷酸骨架構(gòu)成大溝和小溝的兩壁，堿基對邊就是溝底，而螺旋軸通過堿基對中央。因此，大、小兩溝的深度差不多，亦即從螺旋圓柱面至堿基對邊之間的橫向距離大致相等。雙螺旋表面的溝對DNA與蛋白質(zhì)的相互識別和結(jié)合都是很重要的。因?yàn)橹挥性跍蟽?nèi)才能接觸到堿基的順序，而在雙螺旋的表面則是脫氧核糖和磷酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)，似乎并無信息可言。當(dāng)然，大溝和小溝之間存在著明顯的差別。大溝的空間可容納其它分子“閱讀”溝內(nèi)的堿基順序信息，并可使其氮、氧原子與蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈形成氫鍵而結(jié)合。而小溝沒有足夠大的空間與蛋白質(zhì)分子識別和結(jié)合，但是在B-DNA的小溝內(nèi)可觀察到水合結(jié)構(gòu)。（圖2-4）是DNA雙螺旋模型第十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)

圖2-4DNA雙螺旋模型

第二十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)2．DNA雙螺旋的種類（1）右手螺旋的多重構(gòu)象表2-1不同螺旋形式DNA分子主要參數(shù)比較

第二十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)（2）左手螺旋在DNA單鏈中存在嘌呤與嘧啶交替排列的順序CGCGCG或CACACA時(shí)，則會出現(xiàn)左手雙螺旋結(jié)構(gòu)。在主鏈中各個(gè)磷酸根呈鋸齒狀排列，猶如“之”字形一樣，因此叫做Z型構(gòu)象(采用Zigzag第一個(gè)字母)。Z型結(jié)構(gòu)是所有DNA結(jié)構(gòu)每圈螺旋堿基對最多的，因而有最少扭曲結(jié)構(gòu)。比如，真核細(xì)胞中常出現(xiàn)胞嘧啶第5位碳原于的甲基化，形成局部疏水區(qū)，這一區(qū)域伸入B–DNA的大溝中，使B–DNA不穩(wěn)定而轉(zhuǎn)變?yōu)閆–DNA?？贵w可以區(qū)分Z型DNA和B型DNA。這些抗體與果蠅染色體的特殊區(qū)域以及其它生物體的細(xì)胞核結(jié)合。在果蠅中，結(jié)合的區(qū)域比染色體有更為展開的結(jié)構(gòu),說明Z–DNA的存在是一種自然現(xiàn)象?？梢钥闯?，DNA構(gòu)象的多變性，或者說DNA二級結(jié)構(gòu)的多態(tài)性，是在不同條件和具有特殊序列結(jié)構(gòu)時(shí)才呈現(xiàn)出來的，說明DNA是一個(gè)可變的動態(tài)分子，以多變的構(gòu)象實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵豐富的生物學(xué)功能。第二十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)

四、DNA的高級結(jié)構(gòu)DNA的高級結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA高級結(jié)構(gòu)的主要形式，可分為正超螺旋與負(fù)超螺旋兩大類，它們在特殊情況下可以相互轉(zhuǎn)變，如：DNA分子的這種變化可以用一個(gè)數(shù)學(xué)公式來表示：L=T+W其中，其中為連接數(shù)，是指環(huán)形DNA分子兩條鏈間交叉的次數(shù)。只要不發(fā)生鏈的斷裂，L是個(gè)常量。T為雙螺旋的盤繞數(shù)(twistingnumber)，W為超螺旋數(shù)(writhingnumber)，它們是變量。第二十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA的復(fù)制

一、DNA的半保留復(fù)制機(jī)理二、DNA復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度DNA在復(fù)制時(shí)，首先在一定位置解開雙鏈，這個(gè)復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，稱為復(fù)制叉。一般把生物體能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱為復(fù)制子。實(shí)驗(yàn)證明，復(fù)制在起始階段進(jìn)行控制，一旦復(fù)制開始，就連續(xù)進(jìn)行下去，直到整個(gè)復(fù)制子完成復(fù)制。每個(gè)復(fù)制子由一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)控制。原核生物的復(fù)制起始點(diǎn)通常在它染色體的一個(gè)特定位點(diǎn)，并且只有一個(gè)起始點(diǎn)，因此，原核生物的染色體只有一個(gè)復(fù)制子。真核生物染色體的多個(gè)位點(diǎn)可以起始復(fù)制，有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，因此是多復(fù)制子（表2-2）。且多個(gè)復(fù)制子不是同時(shí)起作用，而是在特定時(shí)間，只有一部分復(fù)制子（不超過15%）在進(jìn)行復(fù)制過程。關(guān)于DNA復(fù)制的方向和速度，最為普遍的就是雙向等速進(jìn)行（圖2-5）。某些環(huán)狀DNA偶爾從一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)形成一個(gè)復(fù)制叉，單向復(fù)制。而腺病毒則從兩個(gè)起始點(diǎn)相向進(jìn)行復(fù)制。

第二十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA的復(fù)制

表2-2部分生物復(fù)制子的比較第二十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA的復(fù)制

圖2-5放射性實(shí)驗(yàn)證明DNA的復(fù)制是從固定的起始點(diǎn)雙向等速進(jìn)行的第二十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA的復(fù)制

三、DNA復(fù)制的幾種主要方式

1．線性DNA雙鏈的復(fù)制復(fù)制叉生長方向有單一起點(diǎn)的單向(如腺病毒)及雙向(如噬菌體)，和多個(gè)起始點(diǎn)的雙向幾種，DNA雙向復(fù)制時(shí)復(fù)制叉處呈“眼”型。線性DNA復(fù)制中RNA引物被切除后，留下5′端部分單鏈DNA，不能為DNA聚合酶所作用，使子鏈短于母鏈。T4和T7噬菌體DNA通過其末端的簡并性,使不同鏈的3′端因互補(bǔ)而結(jié)合，其缺口被聚合酶作用填滿，再經(jīng)DNA連接酶作用生成二聯(lián)體。這個(gè)過程可重復(fù)進(jìn)行直到生成原長20多倍的多聯(lián)體，并由噬菌體DNA編碼的核酸酶特異切割形成單位長度的DNA分子。Φ290噬菌體和腺病毒基因組的末端含反向重復(fù)序列，復(fù)制時(shí)，5′端首先與末端蛋白共價(jià)結(jié)合，開始互補(bǔ)鏈的合成。當(dāng)另一條鏈完全被置換后，兩端通過發(fā)卡結(jié)構(gòu)相連，形成一個(gè)大部分序列互補(bǔ)的單鏈環(huán)形DNA分子，復(fù)制從其內(nèi)部的起始位點(diǎn)開始按前導(dǎo)鏈方式雙向進(jìn)行，經(jīng)過環(huán)形結(jié)構(gòu)到達(dá)分子的另一部分，經(jīng)雙鏈結(jié)構(gòu)交錯(cuò)切割后生成完整的子鏈病毒。除了環(huán)形部分發(fā)生重排之外，所生成的新DNA分子帶有母鏈的全部遺傳信息。第二十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA的復(fù)制

2．環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制（1）θ型復(fù)制θ型（圖2-6）復(fù)制可以是雙向或單向的，大多為等速雙向，少數(shù)為不等速雙向復(fù)制。兩個(gè)共價(jià)封閉的互相盤繞的DNA雙鏈在拓?fù)洚悩?gòu)酶作用下從起始點(diǎn)（ori）開始形成DNA切口和封閉，DNA的一條或兩條主鏈骨架有暫時(shí)的切斷，是DNA超旋或解旋，有利于復(fù)制叉向前移動。前導(dǎo)鏈DNA開始復(fù)制前，復(fù)制原點(diǎn)的核酸序列被轉(zhuǎn)錄生成短RNA鏈，作為起始DNA復(fù)制的引物。（2）滾動環(huán)復(fù)制它是很多病毒、細(xì)菌因子以及真核生物中基因放大的基礎(chǔ)。如：ΦX174，T4噬菌體等的DNA都以如圖2-7所示第二十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA的復(fù)制

圖2-6DNA復(fù)制的θ型結(jié)構(gòu)第二十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA的復(fù)制

（3）D型復(fù)制線粒體和葉綠體具有雙鏈環(huán)狀DNA，在電鏡中觀察到，線粒體DNA的復(fù)制叉曾呈現(xiàn)出D形。在復(fù)制開始時(shí)，雙鏈環(huán)狀DNA在特定ori位點(diǎn)出現(xiàn)一個(gè)復(fù)制泡(replicativebubble)，雙鏈解鏈。復(fù)制泡的親代分子中以（–）鏈作為模板，合成一條新鏈，并且將親代分子的（+）鏈置換出來，新鏈與它的模板形成部分雙鏈。這樣，在線粒體DNA的復(fù)制過程中，出現(xiàn)一條單鏈和一條雙鏈組成的三元泡結(jié)構(gòu)，稱為置換環(huán)(displacementloop)或D環(huán)。（圖2-8）。第三十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA的復(fù)制

圖2-7環(huán)狀DNA可以通過滾環(huán)式復(fù)制產(chǎn)生多單元DNA第三十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA的復(fù)制

圖2-8D型復(fù)制的模型第三十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

一、原核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)1．DNA雙螺旋的解旋DNA雙螺旋分子具有緊密纏繞的結(jié)構(gòu)，編碼堿基位于分子的內(nèi)部，因此在復(fù)制時(shí)，母本DNA的兩條鏈應(yīng)至少分開一部分，才能使DNA復(fù)制酶系統(tǒng)“閱讀”模板鏈的堿基順序。使DNA雙螺旋解旋并使兩條鏈保持分開的狀態(tài)是個(gè)極其復(fù)雜的過程，現(xiàn)在已找到一些酶和蛋白質(zhì)，它們或者能使DNA雙鏈變得易于解開，或者可以使超螺旋分子松弛。2．岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制按照Watson-Crick假說，DNA的兩條鏈的方向相反，所以復(fù)制時(shí)，如新生DNA的一條鏈從5′向3′端合成，則另一條鏈必須從3′端向5′端延伸?？墒牵癜l(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶都只能催化DNA鏈從5′端向3′端延長。第三十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

圖2-9DNA的半不連續(xù)復(fù)制

第三十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

3．DNA復(fù)制的引發(fā)與終止在細(xì)胞提取物中合成岡崎片段時(shí)，不僅需要dATP、dGTP、dCTP和dTTP四種前體，還需要一個(gè)與模板DNA的堿基順序互補(bǔ)的RNA短片段當(dāng)作引物。有許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果能證明RNA引物的存在。在多瘤病毒的體外系統(tǒng)中合成的岡崎片段是一個(gè)5′端約10核苷酸長的，以3′–三磷酸為結(jié)尾的RNA。這是一個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)。第三十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

圖2-10大腸桿菌染色體DNA雙向復(fù)制示意圖

第三十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

4．DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ不是復(fù)制大腸桿菌染色體的主要聚合酶，它有3′→5′核酸外切酶活性，這種活性和聚合酶活性緊密結(jié)合在一起，既可合成DNA鏈，又能降解DNA，保證了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。另外，它還有5′→3′核酸外切酶的功能，可作用于雙鏈DNA，又可水解5′末端或距5′末端幾個(gè)核苷酸處的磷酸二酯鍵，因而該酶被認(rèn)為在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起著重要的作用。它也可用以除去岡崎片段5′端RNA引物，使岡崎片段間缺口消失，保證連接酶將片段連接起來。DNA聚合酶Ⅱ具有5′→3′方向聚合酶活性，但酶活性很低。若以每分鐘酶促核苷酸摻入DNA的效率計(jì)算，只有DNA聚合酶Ⅰ的5％，故也不是復(fù)制中主要的酶。其3′→5′核酸外切酶活性可起校正作用。目前認(rèn)為DNA聚合酶Ⅱ的生理功能主要是起修復(fù)DNA的作用。DNA聚合酶Ⅲ包含有7種不同的亞單位和9個(gè)亞基，其生物活性形式為二聚體。它有5′→3′方向聚合酶活性，也有3′→5′核酸外切酶活性。它的活力較強(qiáng)，為DNA聚合酶Ⅰ的15倍，DNA聚合酶Ⅱ的300倍。它能在引物的3′－OH上以每分鐘約5萬個(gè)核苷酸的速率延長新生的DNA鏈，是大腸桿菌DNA復(fù)制中鏈延長反應(yīng)的主導(dǎo)聚合酶。表2-3介紹了上述DNA聚合酶的性質(zhì)。第三十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

第三十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

二、真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)1．真核細(xì)胞的每條染色體含有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。復(fù)制子的大小變化很大，約5-300kbp。復(fù)制可以在幾個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)上同時(shí)進(jìn)行，復(fù)制起始點(diǎn)不是一成不變的。在發(fā)育過程中，活化的細(xì)胞有更多的復(fù)制起始點(diǎn)。例如，果蠅在胚胎發(fā)育早期，其最大染色體上有6000個(gè)復(fù)制叉，大約每10kbp就有一個(gè)。2．真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前，各個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)不能開始新一輪的復(fù)制。而原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)上可以連續(xù)開始新的復(fù)制事件，表現(xiàn)為一個(gè)復(fù)制子內(nèi)套疊有多個(gè)復(fù)制叉。3．真核生物DNA的復(fù)制子被稱為自主復(fù)制序列（ARS），長約150bp左右，含有幾個(gè)復(fù)制起始必須的保守區(qū)。并且其復(fù)制起始需起點(diǎn)識別復(fù)合物（ORC）參與，并需ATP。真核生物復(fù)制叉的移動速度大約只有50bp/s，還不到大腸桿菌的1/20。因此，人類DNA中每隔3x104~3x105就有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。第三十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

4．真核生物有多種DNA聚合酶，分別為在真核細(xì)胞中主要有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε，真核細(xì)胞的DNA聚合酶和細(xì)菌DNA聚合酶基本性質(zhì)相同，均以dNTP為底物，需Mg2+激活，聚合時(shí)必須有模板鏈和具有3′–OH末端的引物鏈，鏈的延伸方向?yàn)?′→3′。但真核細(xì)胞的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性，推測一定有另外的酶在DNA復(fù)制中起校對作用。DNA聚合酶α的功能主要是引物合成。DNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，可能主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。DNA聚合酶δ是主要負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的酶，參與先導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。而DNA聚合酶ε的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口補(bǔ)全。5．端粒的復(fù)制線性染色體的末端DNA稱為端粒，端粒的功能主要是穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，防止染色體之間的末端連接。復(fù)制由一種特殊的酶-端粒酶所催化。真核生物線性染色體在復(fù)制后，不能原核生物那樣填補(bǔ)5′末端的空缺，從而會使5′末端序列因此縮短。而端粒酶可以外加重復(fù)單位到5′末端上，維持端粒一定的長度。第四十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

三、DNA復(fù)制的調(diào)控1．大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制調(diào)控染色體的復(fù)制與細(xì)胞分裂一般是同步的，但復(fù)制與細(xì)胞分裂不直接偶聯(lián)。復(fù)制起始不依賴于細(xì)胞分裂，而復(fù)制的終止則能引發(fā)細(xì)胞分裂。在一定生長速度范圍內(nèi)，細(xì)胞與染色體的質(zhì)量之比相對恒定，這是由活化物、阻遏物和去阻遏物及它們的相互作用所制約的。復(fù)制的功能單位，即復(fù)制子，由起始物位點(diǎn)和復(fù)制起點(diǎn)兩部分組成。起始物位點(diǎn)編碼復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，復(fù)制起點(diǎn)與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用并啟動復(fù)制。起始物位點(diǎn)突變使復(fù)制停止并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。2．ColE1質(zhì)粒DNA的復(fù)制調(diào)控ColE1是一個(gè)6646bp的小質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)為20~30。ColE1DNA復(fù)制不依賴于其本身編碼的蛋白質(zhì)，而完全依靠宿主DNA聚合酶。質(zhì)粒DNA編碼兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子Rop蛋白和反義RNA(RNA1)，它們控制了起始DNA復(fù)制所必需的引物合成。第四十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

3．真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控真核細(xì)胞的生活周期可分為4個(gè)時(shí)期：G1、S、G2和M期。G1是復(fù)制預(yù)備期，S為復(fù)制期，G2為有絲分裂準(zhǔn)備期，M為有絲分裂期。DNA復(fù)制只發(fā)生在S期。真核細(xì)胞中DNA復(fù)制有3個(gè)水平的調(diào)控：（1）細(xì)胞生活周期水平調(diào)控也稱為限制點(diǎn)調(diào)控，即決定細(xì)胞停留在G1期還是進(jìn)入S期。許多外部因素和細(xì)胞因子參與限制點(diǎn)調(diào)控。促細(xì)胞分裂劑、致癌劑、外科切除等都可誘發(fā)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。一些細(xì)胞質(zhì)因子如四磷酸二腺苷和聚ADP–核糖也可誘導(dǎo)DNA的復(fù)制。（2）染色體水平調(diào)控決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序在S期起始復(fù)制，這種有序復(fù)制的機(jī)理還不清楚.（3）復(fù)制子水平調(diào)控決定復(fù)制的起始與否。這種調(diào)控從單細(xì)胞生物到高等生物是高度保守的。此外，真核生物復(fù)制起始還包括轉(zhuǎn)錄話化、復(fù)制起始復(fù)合物的合成和引物合成等階段，許多參與復(fù)制起始蛋白的功能與原核生物中相類似。酵母染色體復(fù)制只發(fā)生于S期,各個(gè)復(fù)制子按專一的時(shí)間順序活化，在S期的不同階段起始復(fù)制。第四十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第五節(jié)DNA的損傷與修復(fù)一、DNA的損傷來源1．DNA分子的自發(fā)性損傷

（1）互變異構(gòu)

DNA分子中的4種堿基自發(fā)地使氫原子改變位置，產(chǎn)生互變異構(gòu)體，進(jìn)一步使堿基配對的方式發(fā)生改變，這樣在復(fù)制后的子鏈上就可能出現(xiàn)錯(cuò)誤。例如：腺嘌呤的互變異構(gòu)體A′可以與C配對，胸腺嘧啶的互變異構(gòu)體T′與G配對，當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，如果模板鏈上存在這些互變異構(gòu)體，在子鏈上就可能發(fā)生錯(cuò)誤，形成損傷。（2）脫氨試劑及自發(fā)脫嘌呤和脫嘧啶

包括羥胺，是一種體外誘變劑；亞硫酸鹽，主要改變DNA分子單鏈區(qū)的C→U，亞硝酸鹽主要使C→U，也使A和G脫去氨基，但特異性較差，可引起體內(nèi)外的廣泛誘變。（3）活性氧引起的誘變

活性氧為氧分子電子數(shù)大于O2的O2。8–oxoG(GA))是一種氧化堿基(7，8、二氫–8–氧代鳥嘌呤)，可與C、A配對，而DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ的校正活性不能校正其錯(cuò)配，造成GC—TA的顛換，這種損傷可以積累。H202是細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物，非?；钴S，造成DNA氧化損傷時(shí)，產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、胸苷乙二醇和羥甲基尿嘧啶等，此類損傷一般能被修復(fù)。第四十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五第五節(jié)DNA的損傷與修復(fù)2．物理因素引起的DNA損傷紫外線（UV）照射引起的DNA損傷主要是形成嘧啶二聚體，DNA分子最易于吸收的波長在260nm左右，當(dāng)受到大劑量的UV照射后，一條鏈上相鄰的兩個(gè)嘧啶核苷酸共價(jià)結(jié)合，形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體。形成二聚體的反應(yīng)可逆較長的波長（280nm）有利于二聚體的形成，較短波長（240nm）利于其解聚。二聚體的生