分子生物學技術分子克隆

分子生物學技術分子克隆第一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五生物醫(yī)學研究常用基本技術分子克隆技術（DNA重組技術）免疫印跡技術（Westernblot）免疫組織化學技術（免疫組化）細胞培養(yǎng)技術局限性聯(lián)合應用第二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五分子克隆技術DNA體外重組技術：是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法將感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將重組子轉(zhuǎn)入受體細胞，并篩選出表達重組DNA的活細胞，加以純化、擴增、成為克隆，這一過程稱為DNA體外重組技術?；具^程分、切、連、轉(zhuǎn)、篩第三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五1.分：分離出要克隆的目的基因及載體。①目的基因的來源：直接分離適于遺傳背景了解比較清楚的細菌染色體、質(zhì)粒及病毒DNA的提取分離。首先通過組建幾種限制性內(nèi)切酶的物理圖譜進行基因定位，然后用DNA的酶切片段電泳分離DNA，應用相應DNA探針確定目的DNA后，從膠中回收DNA。(適合原核)人工合成序列明確的短DNA片段，可用DNA合成儀合成（適合較短的）。第四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五由mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA細胞總RNA分離mRNA分離目的基因mRNA的純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成cDNA的克隆從基因組文庫中篩選目的基因首先構(gòu)建基因組文庫（G文庫）或cDNA文庫（C文庫），需要時利用探針技術將所需目的基因“釣”出來。第五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五②載體：可容忍外源性DNA片段插入，可在細胞間轉(zhuǎn)移并能在細胞內(nèi)自主復制的DNA分子。理想的質(zhì)?？寺≥d體應具有的特性：能在宿主細胞中獨立復制，并能攜帶DNA片段一同擴增具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點,即多克隆位點(MCS,multiplecloningsites)，便于進行克隆分子量小，可插入較大的外源DNA而不影響復制易于導入受體細胞具有容易操作的檢測表型。如抗生素抗性、α-互補顯色反應（藍白斑篩選）表達型載體應配備與宿主細胞相適應的啟動子，前導序列，增強子等調(diào)控元件生物安全性好目前常用的載體有質(zhì)粒、噬箘體、病毒等。第六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五載體第七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五2.切：用限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體，使其產(chǎn)生便于連接的末端。3.連：將切割后的目的基因和載體用T4DNA連接酶連接。4.轉(zhuǎn)：把連接好的重組載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞的過程（細菌：E.coli，真菌：Yeast，昆蟲細胞或哺乳動物細胞）。5.篩：在不同層次上、不同水平上進行篩選，鑒定所需的特異性重組子。使用各種方法，將帶有重組載體的宿主菌從培養(yǎng)基中篩選出來。例如：載體大小，酶切結(jié)果，篩選標記等。第八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測序技術

DNA體外重組技術第九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五總RNA制備

Trizol法:主要用途：總RNA提?。―NA、蛋白質(zhì)提?。┲饕煞郑罕椒?、異硫氰酸胍等適用組織：人類、動物、植物、微生物的組織，細菌或真菌樣品量：從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。InvitrogenTRIzol?產(chǎn)品RNA提取試劑盒：國產(chǎn)、進口

常用總RNA提取試劑盒盡量選用含DNA酶的試劑盒第十頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五Trizol法提取總RNA步驟以50-100mg組織加入1mlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。

研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒，靜置3分鐘。

取上層水相于一新的離心管，按每1mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。

棄去上清液，按每1mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。

第十一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五Tips：樣品收集后迅速放入液氮；樣品在Trizol溶液中相對穩(wěn)定；注意避免RNase，尤其是內(nèi)源的；

豐度低的mRNA：實驗所需的耗材需要0.1%DEPC水處理，高壓滅菌豐度中等以上的mRNA：耗材高壓滅菌即可。獲得高純度RNA，要懂得取舍；上清取適量即可（500ul）。

完全干燥的RNA溶解度極低；完全干燥的RNA呈透明狀；趁RNA沉淀仍然呈白色的時加水溶解RNA樣品相關實驗要盡快進行，如需保存RNA，需存于-80度超低溫冰箱；

第十二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五避免RNA酶污染由于RNA分子容易受RNA酶的攻擊反應而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄過程中都要避免RNA酶污染。第十三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性。實驗用品用0.1%DEPC水處理（2h），高壓蒸汽滅菌后烤干備用或購買經(jīng)過處理的無RNA酶實驗用品。操作過程中帶手套、口罩。避免RNA酶污染第十四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五逆轉(zhuǎn)錄反應（cDNA合成）逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）：是指在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過程。第十五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五逆轉(zhuǎn)錄反應體系的基本成分模板:組織或培養(yǎng)細胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶：AMV:禽類成髓細胞性白血病病毒

M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒引物:oligodT,randomprimer，GSP等。RNA酶抑制劑底物：等濃度的四種dNTP反應環(huán)境:緩沖液（RTbuffer）可單獨購買或逆轉(zhuǎn)錄試劑盒第十六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五Tips：RNA質(zhì)量要好；無降解RNA樣品應加熱變性處理；

RNA65oC處理5min，隨后迅速置于冰上，打開二級結(jié)構(gòu)這一步不加任何反應組分反應中RNA模板量要合適；太多？太少？第十七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五PCR技術PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。一種選擇性體外擴增DNA的方法.一種將微量的目的DNA片段在體外快速、大量擴增的技術。半保留復制KaryMullis1993年諾貝爾化學獎第十八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五三個基本步驟:(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈;(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴增達數(shù)百倍。

第十九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五第二十頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五PCR反應體系的基本成分模板:雙鏈或單鏈DNA引物:與模板DNA特異互補的單鏈寡聚核苷酸片段，一般18-30bp,上下游引物DNA聚合酶:如Taq酶（Thermus

aquaticus）底物:等濃度的四種核苷酸（dNTP）反應環(huán)境:含有Mg2+的Tris-Cl緩沖液。含DNA聚合酶的2×反應混合物第二十一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五模板：PCR反應必須以DNA為模板進行擴增,模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.PCR反應體系的基本成分第二十二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五引物：PCR反應產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。與模板DNA特異互補的單鏈寡聚核苷酸片段，一般18-30bp,上下游引物PCR反應體系的基本成分濃度:

0.1umol～１umol/L

6×1012～3×1013[Primer]↑錯配率↑

非特異性產(chǎn)物↑

引物二聚體↑第二十三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五引物設計原則引物長度約為16-30bp，太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。引物中G+C含量通常為40%-60%四種堿基應隨機分布，在3'端不存在連續(xù)3個G或C,因這樣易導致錯誤引發(fā)。引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應,以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。在引物內(nèi),尤其在3'端應不存在二級結(jié)構(gòu)兩引物之間尤其在3'端不能互補,以防出現(xiàn)引物二聚體,減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。引物5'端對擴增特異性影響不大,可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等.通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基第二十四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五引物的選擇與設計從文獻中查找利用引物設計軟件獲得：如Primer在線軟件Blast分析

NCBIBLASTNucleotideblast

直接找

第二十五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五TaqDNA聚合酶：TaqpolymeraseThermus

aquaticus5‘→3’DNA聚合酶活性以及5‘→3’核酸外切酶活性

無3'→5'核酸外切酶活性

致命弱點：出錯率高LATaqpolymerase,PrimeStarDNApolymerase,PfuDNApolymerase，F(xiàn)astPfuDNApolymerasedNTP

：dATPdUTPdCTPdGTP一般反應中每種dNTP的終濃度為200~250μmol/L。4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。PCR反應體系的基本成分第二十六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五含Mg2+的反應緩沖液：Mg2+濃度對TaqDNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,影響引物退火和解鏈溫度,影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。PCR反應體系的基本成分濃度:1.０～４.5mmol/L[Mg2+]↑——

Product特異性↓[Mg2+]↓——

Product特異性↑Vary[Mg2+]instepsof0.5mM.第二十七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五PCR體系的建立

25or50lsinamicroEppendorf(0.2ml)tube第二十八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五PCR反應的條件預變性：94℃，5min變性：94℃,30s,模板DNA變性成為單鏈退火：Tm-5℃,30s，引物與模板DNA結(jié)合延伸：72℃，與擴增片段長度有關，

<1Kb,1min；>1Kb,延長時間循環(huán)數(shù)：25-35，平臺期之前。最終延伸：72℃，10min。第二十九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五3-4hoursUVvisualisationThefinalproduct第三十頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五Tips：反應體系混勻；正負對照必須有；反應條件可以嘗試梯度，且只改變一個變量；根據(jù)實驗需求選擇相應品牌的DNA聚合酶MasterMix;帶Loading的Mix；快速的；保真的；第三十一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RT-PCR定義：將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應（ReverseTranscription）和cDNA的聚合酶鏈擴增（PolymeraseChainReaction）聯(lián)合應用的一種技術。目前對目的基因的mRNA表達進行定性和半定量分析的最常用方法。第三十二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RT-PCR步驟提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，從而獲得目的基因或檢測基因表達。RNA提取逆轉(zhuǎn)錄反應：經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNAPCR：以cDNA為模板，PCR擴增合成目的片段。瓊脂糖凝膠電泳第三十三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RT-PCR應用用途:

1.獲得目的基因全長編碼序列，用于基因克隆2.檢測目的基因mRNA表達水平（定性、半定量）優(yōu)點：簡單、敏感、便宜局限性：不能準確反應基因表達狀況RT-PCR/Q-PCR（Real-timeQuantitativePCR）第三十四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RT-PCR檢測mRNA表達水平結(jié)果分析保證內(nèi)參照均一的情況下，比較目的條帶常用的內(nèi)參有GAPDH、β-Actin等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。獲得目的基因全長編碼序列，可用于進一步基因克隆第三十五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五Tips：所用PCR循環(huán)數(shù)需要調(diào)整,以減少平臺效應，非特異性擴增產(chǎn)物的干擾。；對于克隆的片段來說：

盡量選擇保真性好的酶（pfu）進行反應；

普通的Taq酶擴增效率會更好一些；

（末端帶A方便TA克?。?/p>

長片段可以分段進行擴增，最后拼接起來

（Double-jointPCR；SLIC）第三十六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測序技術

DNA體外重組技術第三十七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒(Plasmid)：是一種獨立于染色體外的，能自主復制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子，大小從1-200kb不等；是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子?？少x予宿主細胞一定生物學性狀，如：抗生素抗性Ampr等。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。第三十八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五現(xiàn)在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定第三十九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒載體（vector）是在天然質(zhì)粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。第四十頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定一個理想的克隆載體大致應有下列一些特性：分子量小、多拷貝、松馳控制型具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點能插入較大的外源DNA片段具有容易操作的檢測表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。

第四十一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定從細菌中分離質(zhì)粒DNA包括3個基本步驟:培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增收集和裂解細胞分離和純化質(zhì)粒DNA第四十二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五

常用質(zhì)粒提取方法：煮沸法

堿裂解法

一般質(zhì)粒提取試劑盒三種形式(見后)：共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA)超螺旋DNA開環(huán)DNA(OpencircularDNA,簡稱ocDNA)線狀DNA(LinearDNA)

質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定第四十三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒鑒定方法：酶切電泳PCR鑒定測序序列比對質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定第四十四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測序技術

DNA體外重組技術第四十五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

酶切：用限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體，使其產(chǎn)生便于連接的末端。限制性內(nèi)切酶：限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。來源：細菌和真菌功能：以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5′端為P，3′端為OH。WernerArber、DanienNathans、HamiltonSmith1978年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎第四十六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

限制性內(nèi)切酶命名：根據(jù)其來源命名。如：屬名菌株名

EcoRI

種名編號EcoRI來源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個限制酶。酶來源的生物名稱縮寫屬名-種名-株名-發(fā)現(xiàn)次序第四十七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

分類：限制性核酸內(nèi)切酶根據(jù)識別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性分為三大類。

特性I型II型III型限制和修飾活性限制作用所需輔助因子特異性識別位點切割位點序列特異的切割在基因工程的應用雙功能酶ATP、Mg2+非對稱序列距識別位點1000bp處隨機切割不是用處不大核酸內(nèi)切酶和甲基化酶分開Mg2+回文對稱結(jié)構(gòu)位于識別位點上是廣泛使用

雙功能酶

ATP、Mg2+

非對稱序列

距識別位點下游24-26bp處

是

用處不大第四十八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的特點及作用特性Ⅱ型酶限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和修飾酶兩種不同的酶組成。它的分子量小，僅需Mg2＋做輔助因子，它們能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個順序內(nèi)進行切割。識別順序一般為4－6個堿基對，識別順序具有180度的旋轉(zhuǎn)對稱性，具有回文結(jié)構(gòu)。5’-CTGCAG-3’5’-GTTAAC-3’3’-GACGTC-5’3’-CAATTG-5第四十九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五Ⅱ型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生2種不同切口平末端：在識別順序的對稱軸上，對DNA同時切割形成平末端，如：SmaI5’－CCCGGG－3’3’－GGGCCC－5’5’－CCC3’－GGGGGG－3’CCC－5’質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

粘末端：5′突出粘末端：在識別序列的兩側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對稱軸的5′末端切割產(chǎn)生5′端突出的粘性末端，如：HindIII5’－AAGCTT－3’3’－TTCGAA－5’5’－A3’－TTCGA－5’5’－AGCTT－3’A－5’3′突出粘末端:與5′突出粘末端作用相反，產(chǎn)生3′端突出粘末端，如：PstI5’－CTGCAG－3’3’－GACGTC－5’5’－CTGCA－3’3’－GG－3’3’－ACGTC－5’第五十一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶的單位

在適當?shù)臈l件下（T，pH，離子強度等）一小時內(nèi)完全酶解1μg特定DNA底物所需要的限制性核酸內(nèi)切酶的量，定義為1個活性單位。目前常用的酶單位的定義是：37℃，1小時內(nèi)50ul反應體系完全酶解1μgλDNA所需的酶量。

在建立酶切體系時，酶的用量一般為1－5U/μgDNA質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

影響酶切的因素DNA限制性內(nèi)切酶酶作用底物（DNA純度）反應緩沖液鹽離子濃度（Mg2+）酶解溫度與時間第五十三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五

DNA限制性內(nèi)切酶1.內(nèi)切酶的識別位點及形成的粘性末端；2.內(nèi)切酶體積不能超過反應體系10%，因內(nèi)切酶中含50%甘油作為保護劑，甘油濃度過高會影響酶切反應；3.操作應在低溫下進行（冰上）。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五

酶作用底物DNA應該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、乙醇等，這些因素的存在均不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活力。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五反應緩沖液酶切緩沖液成分及作用：①Tris-HCl，維持pH在7.4－8.0；②Mg2+，內(nèi)切酶活性所必需；③NaCl/KCl，增加離子濃度，利于酶活性；④二硫蘇糖醇(DTT)，保護酶，防止二硫鍵的形成不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應緩沖液。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五鹽離子濃度不同的限制性內(nèi)切酶對鹽離子強度（Na+）有不同的要求.一般按離子強度不同分為低（10mmol/L）、中（50mmol/L）、高鹽（100mmol/L）三類。Mg2+是酶切反應必需的。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五酶解溫度與時間溫度：大多數(shù)限制酶反應溫度為37℃，也有的酶需在50℃或其他溫度下進行反應。時間：一般1-2小時即可，進行大量DNA酶解反應時，可酶解過夜。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五星號活力(Staractivity)限制性核酸內(nèi)切酶在非標準反應條件下，能夠切割一些與其特異識別順序類似的序列，這種現(xiàn)象稱為星號活力。星號活力出現(xiàn)的原因：酶用量太大>100U/ugDNA酶切體系中離子強度太低，<25mM正常為100－150mM質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五甘油濃度過高>10％（V/V）EcoRI反應體系pH值過高>8PstI一般反應體系的pH為7.0左右反應體系中存在有機溶劑，如乙醇，DMSO等有與Mg競爭的其它二價陽離子，如Mn離子質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第六十頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五應用：構(gòu)建載體酶切片段及載體本身基因克隆時轉(zhuǎn)化子鑒定線性化載體質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第六十一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五Tip

雙酶切Vs分步酶切

FermentasFastDigestNEB質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

不完全酶切第六十二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測序技術

DNA體外重組技術第六十三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應策略有以下幾種：帶有相同的粘性末端：用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。帶有平末端：是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補平所致。重組DNA的連接

連接：是在一定條件下，由DNA連接酶（DNAligase）酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5′端磷酸與3′端羥基之間形成磷酸二酯鍵的過程。

第六十四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五第六十五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五重組DNA的連接

DNA連接酶主要分為兩種：T4DNA連接酶催化dsDNA粘末端連接及平端連接大腸桿菌連接酶不能催化平末端連接,其底物只能是帶缺口的雙鏈DNA分子和具有同源互補粘末端的不同DNA分子第六十六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五重組DNA的連接

T4DNA連接酶的特性

T4DNA連接酶是T4噬菌體基因30編碼的產(chǎn)物。最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的。分子量為68KD，需要ATP作為輔助因子并由ATP提供能量。第六十七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五重組DNA的連接

T4DNA連接酶緩沖液的成分及作用常用的反應液為pH7.6的Tris－Hcl，連接最佳pH7.2-7.8需要ATP作為輔助因子并由ATP提供能量DTT等巰基化合物可促進連接酶的連接作用高濃度的Na+,K+等抑制酶的活性第六十八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五重組DNA的連接

T4DNA連接酶的作用條件

對于粘性末端一般在12－15℃之間進行反應，比較通用的條件是16℃過夜連接。第六十九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五Tips：一般來說粘性末端連接效率比平端高；連接反應可提高溫度，縮短反應時間；粘性末端鏈接保證方向性，平端盡量少用第七十頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測序技術

DNA體外重組技術第七十一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞（細菌：E.coli，真菌：Yeast，昆蟲細胞或哺乳動物細胞）,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。

轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化第七十二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五感受態(tài)細胞：最常用E.coliDH5a菌株受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2

等化學試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenentcells)。進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細胞)。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

第七十三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：細胞生長狀態(tài)和密度質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％

重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

第七十四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五試劑的質(zhì)量防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿,如離心管,tip等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

第七十五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五初步篩選：抗性篩選、藍白斑篩選重組子鑒定：菌落PCR，酶切電泳檢測，測序技術重組質(zhì)粒的篩選

重組子篩選：在不同層次上、不同水平上進行篩選，鑒定所需的特異性重組子。使用各種方法，將帶有重組載體的宿主菌從培養(yǎng)基中篩選出來。例如：載體大小，酶切結(jié)果，篩選標記等。第七十六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五初步篩選：進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀?？剐院Y選：Amp+，Kan+,Neo+等α-互補現(xiàn)象篩選：藍白斑篩選重組質(zhì)粒的篩選

藍白斑篩選第七十七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五重組質(zhì)粒的篩選

ColonyPCR（菌落PCR）菌落PCR可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，省時少力。通常利用此方法進行重組體的篩選或者DNA測序分析。第七十八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五菌落PCR的實驗方法PCR混合物的制備（25μl）2×MasterMix12.5μlPrimer1（sense，10μM）

1μlPrimer2（antisense，10μM）1μlddH2O10.5μl重組質(zhì)粒的篩選

第七十九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五常溫下隨機挑選轉(zhuǎn)化板上的白色轉(zhuǎn)化子，用滅菌的槍頭挑取少量菌體，將沾有菌體的槍頭置于相應的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數(shù)下（管子做好記號，將記號標于側(cè)壁），蓋緊管子。+-第八十頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按以下條件擴增。預變性：94℃5min變性：94℃30s復性+延伸：60℃1min補齊：72℃7min35個循環(huán)電泳檢測是否得到目的片段第八十一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五酶切電泳檢測，測序技術重組質(zhì)粒的篩選

+-第八十二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測序技術

DNA體外重組技術第八十三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五凝膠電泳

瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。

注意：EB為強誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應戴手套,

注意操作，污染區(qū)域隔離

第八十四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。

凝膠電泳

第八十五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

凝膠電泳

第八十六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五2、瓊脂糖濃度

給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。小于0.5kb膠濃度是1.2-1.5%,大于10kb膠濃度為0.3-0.7%,于兩者之間

膠濃度為0.8-1.0%。

凝膠電泳

第八十七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五3、DNA分子的構(gòu)象

當DNA分子處于不同構(gòu)象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構(gòu)象有關。

超螺旋DNA>線狀雙鏈DNA>開環(huán)(相同分子量)

凝膠電泳

第八十八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五4、電源電壓

在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。

隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大(即分子量大的片段越跑越快)因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大,所加電壓不得超過5v/cm。

凝膠電泳

第八十九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15％。

6、離子強度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高并明顯產(chǎn)熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

凝膠電泳

第九十頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五常用電泳緩沖液：TAE[含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸]TBE(Tris-硼酸和EDTA)TPE(Tris-磷酸和EDTA)一般配制成濃縮母液,儲于室溫。

凝膠電泳

第九十一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五

瓊脂糖凝膠電泳用途：分離、鑒定、純化

DNA片段的主要方法，目前主要用于重組基因的分離、鑒定、限制性酶切圖譜分析、Southern、Northern雜交分析，以及PCR產(chǎn)物的分離鑒定等。PCR產(chǎn)物鑒定，分離純化基因克隆操作中重組質(zhì)粒鑒定酶切產(chǎn)物鑒定凝膠電泳

第九十二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五第九十三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五第九十四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五經(jīng)典的分子克隆方法第九十五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五具體操作過程中遇見過的問題：目的基因中包含想用的酶切位點——不完全酶切載體上沒有合適的酶切位點——加上個位點？多個目的基因需要往同一個載體上連接——挨個查序列找酶切位點？第九十六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五更簡單、快捷、高效的方法？第九十七頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五SLIC：sequenceandligation–independentcloningSLIC：是一種不依賴于基因序列和連接反應的高效基因克隆新方法.T4DNAPolymerase：在dNTP和引物鏈存在的情況下，具有模板依賴的5’-3’DNA聚合酶活性；在無dNTP存在的情況下，具有3’-5’核酸外切酶活性第九十八頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建重組質(zhì)粒流程第九十九頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建重組質(zhì)粒效率30bp長度的互補序列重組效率最高；RecA可以提高重組效率RecA的作用隨著DNA濃度加大減弱第一百頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建多片段重組質(zhì)粒3片段連接5片段連接10片段連接第一百零一頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建重組質(zhì)粒具體操作第一百零二頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建重組質(zhì)粒具體操作引物設計PCR獲得PTP1B序列（帶有一段與載體序列）T4DNAPolymerase處理混合第一百零三頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五實驗目的：構(gòu)建N末端攜帶Histag的PTP1B的表達載體。實驗材料：pET-15b-EGFP(表達載體，N端攜帶Histag,洪梅構(gòu)建，已測序)pGEX-6p-2-PTP1B(fulllength)（PTP1BN端攜帶GSTtag）PCR反應體系(TransStartFastPfuDNAPolymerase,EasyTaqDNAPolymerase)限制性內(nèi)切酶（XhoI、NdeI）實驗方法（簡易）：以pGEX-6p-2-PTP1B(fulllength)為模板，設計引物擴增得到PTP1B片段。雙酶切處理pET-15b-EGFP載體，得到pET-15b載體。將PTP1B片段插入pET-15b載體，構(gòu)建得到N末端攜帶Histag的PTP1B表達載體。詳細實驗方法見下文。第一百零四頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒提取:使用TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒，提取方法見說明說。提取獲得pET-15b-EGFP質(zhì)粒，體積約為40ml，濃度未測。質(zhì)粒酶切處理:37oC孵育6h（此時如需暫停，可80oC加熱5min使限制性內(nèi)切酶失活，并置于-20oC保存）。瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果（圖1）。配置1%的瓊脂糖凝膠(使用大孔梳子，用于膠回收)，上樣并電泳(使用新配的TAE緩沖液，電壓使用80~90V)，結(jié)果如圖3。使用OmegaGelExtractionKit回收目的片段，方法見說明書?；厥蘸蟮钠坞娪緳z測（圖4），隨后置于-20oC保存。pET-15b-EGFP雙酶切(ml)單酶切(ml)ddH2O46.510xFDbuffer(green)51NdeI1.50XhoI1.50.5Vector382Total5010

質(zhì)粒雙酶切處理用于后續(xù)SLIC，同時取出少部分質(zhì)粒單酶切處理做對照，反應體系如下：M12M,Marker1,pET-15b-EGFP/XhoI2,pET-15b-EGFP/NdeI+XhoI圖1

pET-15b-EGFP酶切驗證結(jié)果接種:一、待插入載體（pET-15b）的準備接種50mlpET-15b-EGFP甘油菌至40mlLB(50mg/ml氨芐青霉素)，37oC,200rpm過夜培養(yǎng)。第一百零五頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五二、目的片段準備PCR擴增目的片段:PTP1B1-450(ml)120-450(ml)ddH2O31.531.55xTransStartFastPfubuffer10102.5mMdNTPs55oPX38610oPX38711oPX38801Template(PTP1Bfulllength)0.50.5TransStartFastPfuDNApolymerase11PCR反應體系如下：引物設計:根據(jù)SLIC原理，引物前15bp與載體互補(橙色標記)，設計引物如下：oPX-386(PTP1B1-450ForwardprimerforSLIC):CGCGGCAGCCATATGGCTTTGGTCACGGTCCAGCoPX-387(PTP1B1-450ReverseprimerforSLIC):AGCCGGATCCTCGAGTCATTTGCTTGCCAGCAAGAToPX-388(PTP1B120-450ForwardprimerforSLIC):CGCGGCAGCCATATGGAAAGCATCGTCCTAGGAATGPCR循環(huán)如下：95oC2min95oC20s56oC20s72oC1min72oC5min30XPCR結(jié)束后電泳檢測結(jié)果（圖2）。配置1%的瓊脂糖凝膠(使用大孔梳子，用于膠回收)，上樣并電泳(使用新配的TAE緩沖液，電壓使用80~90V)，結(jié)果如圖3。使用OmegaGelExtractionKit回收目的片段，方法見說明書。回收后的片段電泳檢測（圖4），隨后置于-20oC保存。M12M,Marker1,PTP1B1-4502,PTP1B120-450圖2

PTP1BPCR結(jié)果第一百零六頁，共一百一十五頁，編輯于2023年，星期五圖3

載體和PCR產(chǎn)物在1%凝膠中的電泳結(jié)果PTP1B1-450PTP1B120-450pET-15b-EGFP/NdeI+XhoIM圖4載體和PCR凝膠回收后的電泳結(jié)果M123M,Marker1,PTP1B1-4502,PTP1B120-4503,pET-15b

凝膠回收后的載體和PCR產(chǎn)物體積約為40ml，片段電泳檢測顯示大小正常。使用K5600spectrophotometer檢測產(chǎn)物濃度（1ml即可），操作方法見使用說明。載體及PCR產(chǎn)物定量濃度（ng/ul）PTP1B1-45019PTP1B120-450146pET