分子生物學(xué)核酸的分子操作

分子生物學(xué)核酸的分子操作第一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五工具酶的種類①

核酸酶：用于切割或降解核酸分子。②

連接酶：用于把核酸分子連接到一起。③

聚合酶：用于核酸分子的擴增和拷貝。④

修飾酶：用于給核酸分子添上或減去某些化學(xué)基團或核苷酸。

第二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五工具酶的來源

這四大類酶大都是從細(xì)菌和噬菌體中純化出來的，在細(xì)胞中它們原本就參與DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、降解外來核酸分子、修復(fù)突變的DNA分子和不同DNA分子間重組等一系列重要的生命反應(yīng)過程。在重組DNA技術(shù)中，它們被用來在人工控制的條件下（體外）工作。值得一提的是，絕大多數(shù)這類酶促反應(yīng)是無法用其它方法來替代完成的，這種不可替代性使這些工具酶在重組DNA技術(shù)中占據(jù)了極其重要的地位。

第三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)50年代初有兩個實驗室在研究噬菌體的宿主范圍時相繼發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個噬菌體從其天然宿主，如E.coli的品系A(chǔ)，轉(zhuǎn)到另一個品系B時，往往不能生長。但如果進(jìn)行大量的感染，則有個別噬菌體能生存下來。研究表明，噬菌體在非天然宿主品系中不能生存，是因為噬菌體的DNA被降解了，而細(xì)菌自身的DNA卻不被降解。為了解釋這種現(xiàn)象，人們提出了限制－修飾酶假說。第四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五限制－修飾假說

限制－修飾假說認(rèn)為，細(xì)菌細(xì)胞中含有兩種酶，一種是限制性核酸內(nèi)切酶，一種是DNA甲基化酶，這兩種酶成對出現(xiàn)，二者對DNA分子有相同的識別序列。DNA甲基化酶在識別序列處特定的核苷酸上甲基化。限制性內(nèi)切酶只能切割非甲基化的DNA，而不能切割不完全甲基化和完全甲基化的DNA。因此，非甲基化的外來DNA會被限制性內(nèi)切酶降解。

第五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五完全甲基化和不完全甲基化

一條鏈上甲基化而另一條鏈上沒有甲基化的稱為不完全甲基化（如剛經(jīng)過半保留復(fù)制的DNA分子），兩條鏈都甲基化的稱為完全甲基化。DNA甲基化酶可以對非甲基化的及不完全甲基化的識別序列進(jìn)行甲基化。

1968年從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型限制性內(nèi)切酶，1970年分離出了Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，從而證實了上述假說。

第六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五各種類型限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)比較

性質(zhì)Ⅱ型Ⅲ型Ⅰ型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能獨立的內(nèi)切酶和甲基化酶由2個亞基組成的雙功能酶由3個亞基組成的復(fù)合功能酶識別部位短小序列（大多為4~6bp），常為回文結(jié)構(gòu)5~7bp的不對稱序列不對稱序列，例如（AACN6GTGC)*切割部位同于或接近于識別部位距識別位點3’端24~26bp處非特異性，距識別部位大于1000bp限制作用所需的輔助因子Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸第七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的特點

Ⅱ型酶分子量小，為單亞基多體酶（同源二聚體），以Mg2+為輔助因子，只有切割作用，沒有修飾作用（有獨立的與之相匹配的甲基化酶）。Ⅱ型酶的識別序列一般為4~6個bp,切割位點在識別序列內(nèi)或相鄰處（Ⅱs型，shiftedcleavage），見表5－2。切割位點在識別位點相鄰處的例子如HgaⅠ，其識別序列和切割位點記為GACGC（5/10），表示切割位點為

5＇GACGCNNNNN↓3＇

3＇CTGCGNNNNNNNNNN↑5＇第八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五表5－2部分Ⅱ型限制性內(nèi)切酶及其切割位點酶鹽濃度溫度識別序列及切割位點切割產(chǎn)生的末端EcoRⅠ高37℃G↓AATTC(5’突出粘性末端）---GAATTC------CTTAAG---HaeⅢ中37℃GG↓CC（平端）---GGCC------CCGG---MboⅠ高37℃↓GATC（5’突出粘性末端）---GATC------CTAG---PstⅠ中21~37℃CTGCA↓G（3’突出粘性末端）---CTGCAG------GACGTC---第九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五限制性內(nèi)切酶切割位點的多寡

如果DNA上的核苷酸順序是隨機的，則對于以4個bp為識別序列的Ⅱ型酶來說，平均44（256）個核苷酸就有一個靶序列；而對于以6個bp為識別序列的酶則平均46（4096）個核苷酸就有一個靶序列。第十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五同裂酶和同尾酶

具有相同識別序列的酶稱為同裂酶（isoschizomers），切割位點可以相同也可以不同。如MboⅠ和Sau3AⅠ的識別序列和切割位點均為↓GATC，XmaⅠ的識別序列和切割位點為C↓CCGGG，而具有與其相同識別序列的SmaⅠ的切割位點為CCC↓GGG。

識別序列不同，但切出的粘性末端相同的酶稱為同尾酶（isocaudamers）。例如

BamHⅠ

G↓GATCC

BglⅡ

A↓GATCT

BclⅠ

T↓GATCA

Sau3AⅠ

↓GATC第十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五Ⅱ型限制性內(nèi)切酶所需反應(yīng)條件①反應(yīng)溫度和時間：37℃保溫適當(dāng)長的時間，保溫時間一般從半小時到數(shù)小時，可通過預(yù)備實驗確定或按文獻(xiàn)資料進(jìn)行。②反應(yīng)體積：一般為幾十μl。③底物DNA：用無DNase的RNase除去可能污染的RNA；用乙醇多次沉淀可除去各種雜質(zhì)（如酚、SDS、EDTA等），最后吹干乙醇并溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。第十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五Ⅱ型限制性內(nèi)切酶所需反應(yīng)條件④反應(yīng)系統(tǒng)：緩沖液應(yīng)過濾除菌或高壓滅菌，根據(jù)不同的限制性內(nèi)切酶選擇高、中、低鹽濃度。當(dāng)用兩種以上的限制性內(nèi)切酶切割時，應(yīng)先用需低鹽濃度的酶，再用需高鹽濃度的酶。所加酶量要適當(dāng)。1單位酶的定義：在限定的溫度（一般為37℃）和緩沖液條件下，在20μl反應(yīng)液中，1小時消化1μgDNA所需的酶量。

第十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五限制性內(nèi)切酶的命名

第一個大寫字母（斜體）為產(chǎn)酶微生物屬名的第一個字母，第二、三兩個小寫字母（斜體）為種名的前兩個字母，第四個大寫或小寫字母（正體）為變種或株系名的第一個字母，最后的羅馬數(shù)字為序號（從同一種微生物中分離出了幾種限制性內(nèi)切酶時按發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序編號）。流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）Rd株：HindⅢ大腸桿菌（Escherichiacoli）Ry13株：EcoRⅠ淀粉液化芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）H株：BamHⅠ第十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五核酸的凝膠電泳

為了檢測酶切后DNA片段的大小，必須進(jìn)行凝膠電泳分離。往電泳體系中加溴化乙錠或電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，就可以在紫外光下看到DNA帶，靈敏度可達(dá)5ng。RNA電泳也可用溴化乙錠染色，但靈敏度低得多。

DNA凝膠電泳常以瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)，前者用于較大片段的分離，后者用于較小片段的分離和序列測定。第十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五溴化乙錠結(jié)構(gòu)式第十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五表5－3凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍凝膠種類凝膠濃度（%）分離線性DNA的有效范圍二甲苯青溴酚藍(lán)瓊脂糖0.30.60.91.21.52.05~60kb1~20kb0.5~7kb0.4~6kb0.2~4kb0.1~3kb1000bp150bp聚丙烯酰胺3.55.08.012.020.0100~2000bp80~500bp60~400bp40~200bp6~200bp460bp260bp160bp70bp45bp100bp65bp45bp20bp15bp第十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五DNA大小與遷移距離的關(guān)系

在一定范圍內(nèi)，DNA分子遷移的距離與其核苷酸對（bp）的對數(shù)成反比。第十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五DNA分子的狀態(tài)與遷移速度的關(guān)系

在無EB下電泳，cccDNA泳動速度最快，linear

DNA次之，ocDNA最慢。隨著EB濃度的增加，更多的EB結(jié)合到DNA上，cccDNA分子的負(fù)超螺旋逐漸解開，其分子半徑增加，遷移速率減小。達(dá)到游離染料的臨界濃度時，不再有超螺旋，cccDNA分子的遷移速率達(dá)最小值。繼續(xù)增加EB，便形成正超螺旋，DNA分子變得更加致密，遷移速率迅速增加。對絕大多數(shù)cccDNA分子而言，游離EB的臨界濃度介于0.1～0.5μg/ml。由于電荷的中和，以及EB賦予DNA較大的剛性，隨著EB濃度的增加，linearDNA和ocDNA的遷移速率也有不同程度的減小。

第十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五大分子DNA的電泳分離

在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳中，有效分離天然DNA分子的大小最大只能到15～20kb。更大的線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速率相同。此時凝膠不能再按分子大小分離DNA，DNA分子像通過彎管一樣，以其一端指向電場的一極而通過凝膠，這種遷移模式謂之“爬行”。第二十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五脈沖電泳

1983年，Schwartz等提出了脈沖電場凝膠電泳的設(shè)計思想，從而找到了解決這一問題的辦法。這一方法在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后，大DNA分子便滯留在爬行管里，直至沿新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。若DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA分子就可以按其大小分開。分子越大，轉(zhuǎn)向所需的時間越長，總的遷移距離就越短，從而達(dá)到分離的目的。

第二十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五交變脈沖垂直定向電場電泳

Schwartz和Cantor（1984）最先設(shè)計的脈沖電場凝膠電泳裝置采用了交變脈沖垂直定向電場和線電極。non-uniformfield（200V）intheN-Sdirectionuniformfield（85V）intheE-Wdirection第二十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五電場倒轉(zhuǎn)凝膠電泳，F(xiàn)IGE

Carle等（1986）設(shè)計的裝置為利于單個電場的周期性倒轉(zhuǎn)（電場倒轉(zhuǎn)凝膠電泳，field-inversiongelelectrophoresis，F(xiàn)IGE），舍棄了正交排列的兩個電場。電場在兩個方向上都是均一的，而正向脈沖稍長于反向脈沖，從而導(dǎo)致了DNA沿相當(dāng)筆直的軌跡運動。應(yīng)用微處理機增加電泳時脈沖的絕對長度并保持正反象脈沖的比例不變，可以使分辨力達(dá)到最大。FIGE可分辨長達(dá)2000kb的DNA片段。

10.5V/cm，λ/XhoⅠ兩個片段，15kb和33.5kb，在正向0.5sec，反向0.25sec分得很開；T5125kb，T4170kb，在正向3sec，反向1sec分得很開。第二十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五電場倒轉(zhuǎn)凝膠電泳的分離效果第二十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五垂直凝膠脈沖電泳

Gardiner等（1986）使用的是垂直凝膠裝置，鉑絲電極裝在凝膠的兩個對邊上。DNA先向一組電極移動，電場轉(zhuǎn)換后則向另一組電極移動。這種“之”字形運動的凈結(jié)果是從加樣孔指向凝膠底部的直線。由于凝膠中的所有泳道均處在相同的電場下，所以DNA的條帶不會發(fā)生水平變形。這種系統(tǒng)的分辨上限大約為9000kb。第二十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五鉗位均勻電場脈沖電泳

鉗位均勻電場電泳（CHEF）中，由多個在水平凝膠的周圍沿正方形或六邊形排列的電極產(chǎn)生電場，這些電極都被鉗制在預(yù)定的電位上。正方形排列的電極產(chǎn)生的電場互成90°，六邊形排列的電極產(chǎn)生的電場雖凝膠的位置和電極極性的不同而互成120°或60°。結(jié)合運用低電場強度（1.3V/cm）、低濃度瓊脂糖（0.6%）、延長轉(zhuǎn)換間隔（1小時）和延長電泳時間（130小時）等條件，有可能分離長達(dá)5000kb的DNA分子。第二十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五鉗位均勻電場電泳的電極分布（CHEF）

第二十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五物理圖譜的定義

標(biāo)明限制性內(nèi)切酶在DNA分子上的切割位點和切割位點間距離的圖譜，稱為DNA的物理圖譜，又叫限制性圖譜。第二十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五圖5－1多限制酶消化法制作物理圖譜第二十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五圖5－2部分消化法制作物理圖譜

ADDDB0.52.21.31.032P5.0kb4.02.70.5第三十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五DNA聚合酶的性質(zhì)酶3＇→5＇外切酶5＇→3＇外切酶聚合反應(yīng)速率持續(xù)合成能力大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ低有中低大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）低無中低逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中T4DNA聚合酶高無中低天然T7DNA聚合酶高無高高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶（測序酶）低或無無高高TaqDNA聚合酶無有高高第三十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五測序酶

化學(xué)修飾T7DNA聚合酶是將天然T7DNA聚合酶與O2、低濃度的Fe

2+

一起保溫數(shù)天，修飾T7DNA聚合酶的N端結(jié)構(gòu)域，使其喪失99%以上的3＇→5＇外切酶活性，而聚合酶活性不受影響，稱為測序酶（sequenase）。后來又發(fā)展出了基因工程手段產(chǎn)生出一種改進(jìn)的測序酶（測序酶2.0版），它完全喪失了3＇→5＇外切酶活性。第三十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五DNA聚合酶的5’→3’聚合酶活性第三十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五切口平移標(biāo)記核酸探針

帶有易檢測標(biāo)記的、已知其序列或來源的DNA片段稱為探針。探針的用途是通過堿基互補探尋能夠與之雜交的未知DNA片段。

先用DNaseⅠ（牛胰）輕微作用于DNA（在Mg

2+存在下），在雙鏈DNA上產(chǎn)生一些切口，然后用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ及4種dNTP（其中1種帶有32P標(biāo)記）進(jìn)行切口平移標(biāo)記。此法利用的是該酶的聚合酶活性和5＇→3＇外切酶活性。第三十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五圖5－4切口平移法制備32P標(biāo)記的探針第三十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五Klenow片段的產(chǎn)生

用枯草桿菌蛋白酶裂解完整的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，得到C端70%的分子量為76kD的片段，稱為Klenow片段。Klenowfragment具有聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性，沒有5＇→3＇外切酶活性。5＇→3＇外切酶活性位于全酶N端分子量為36kD的小片段中?，F(xiàn)已用基因工程的方法直接生產(chǎn)Klenow片段（Klenow酶）。第三十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五隨機引物標(biāo)記法制備探針

先使待標(biāo)記的雙鏈DNA變性成單鏈，再與6bp長的隨機引物混合物一起退火，加Klenow酶和4種dNTP（其中1種帶有32P標(biāo)記）合成模板的互補鏈。互補鏈從引物的3＇端延伸。第三十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五圖5－5采用Klenow酶的隨機引物標(biāo)記法第三十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五逆轉(zhuǎn)錄酶

已經(jīng)商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：一種是來自禽成髓細(xì)胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV），稱為禽源逆轉(zhuǎn)錄酶。它包括兩條多肽鏈，α鏈65kD，β鏈95kD，具有逆轉(zhuǎn)錄活性及很強的RNaseH活性（降解DNA:RNA雜交雙鏈中的RNA）。另一種是從一株能表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒（mouseleucocytosisvirus,Mo-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離得到的，稱為鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶。它是分子量為84kD的單鏈蛋白，具有逆轉(zhuǎn)錄活性和相對較弱的RNaseH活性。第三十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五逆轉(zhuǎn)錄酶

由于RNaseH活性對RNA模板有破壞作用，因此禽源逆轉(zhuǎn)錄酶制劑中高水平的RNaseH活性往往趨向于抑制cDNA的產(chǎn)量，并限制cDNA合成的長度。然而，與鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶相比，禽源逆轉(zhuǎn)錄酶能更有效地拷貝較復(fù)雜的mRNA。第四十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五T4DNA聚合酶

T4DNA聚合酶與Klenow酶相似，它們都具有5＇→3＇聚合酶活性及3＇→5＇外切酶活性，而且3＇→5＇外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA更強。T4DNA聚合酶的外切核酸酶活性要比Klenow酶強200倍。第四十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五T4DNA聚合酶

T4DNA聚合酶用于補平或標(biāo)記限制酶消化DNA后產(chǎn)生的3＇凹端，還用于對帶有3＇突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。（先切3＇突出端成凹端，再補上。這一從凹端或平端上循環(huán)往復(fù)地去除和加上3＇端核苷酸的反應(yīng)又稱為置換反應(yīng)。）第四十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

催化的反應(yīng)（同聚物加尾）

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量（34kD）的堿性蛋白質(zhì)，由一個26kD的大亞基和一個8kD的小亞基組成。底物是dNTP和具有3＇羥基的單鏈DNA或具有3＇羥基突出末端的雙鏈DNA。此酶簡稱末端轉(zhuǎn)移酶。它將dNTP加到3＇末端羥基上，可用來加多聚核苷酸尾。第四十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五堿性磷酸酶

催化單鏈或雙鏈DNA、RNA5＇端的磷酸基團水解，成為5＇－OH。它也能催化NTP和dNTP5＇磷酸的水解。第四十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五兩種堿性磷酸酶

有兩種堿性磷酸酶，即來自大腸桿菌的細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和小牛腸堿性磷酸酶（CIP）。CIP在SDS中加熱至68℃可完全失活，而BAP對去垢劑和高溫的耐受性更強，不便于反應(yīng)后除去酶活性。用CIP催化的反應(yīng)一般在pH9.3進(jìn)行。第四十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五堿性磷酸酶的用途堿性磷酸酶用于：①DNA或RNA5＇端標(biāo)記32P時，除去原有的5＇磷酸；②除去載體DNA的5＇磷酸以防自身連接，而不影響帶有5＇磷酸的外源DNA片段與載體的連接。第四十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五T4多核苷酸激酶

T4多核苷酸激酶催化的前向反應(yīng)（正向反應(yīng)）是將ATP的γ磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5＇－OH上，用于標(biāo)記5＇端（用γ－32PATP）。銨離子和磷酸是此反應(yīng)的抑制劑，所以應(yīng)該用Tris緩沖液（pH7.4~8.0）。該酶還可以在高濃度ATP和ADP存在下催化交換反應(yīng)，使ATP的γ－磷酸與DNA、RNA5＇端的磷酸基團交換。此反應(yīng)的首選反應(yīng)緩沖液是咪唑緩沖液（pH6.4）。此法標(biāo)記效率較低，不如正向反應(yīng)常用。

第四十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五T4多核苷酸激酶催化的反應(yīng)第四十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌DNA連接酶的特點

大腸桿菌DNA連接酶可催化含互相匹配的5＇突出端或3＇突出端的雙鏈DNA之間形成磷酸二酯鍵，還可催化切口的連接。該反應(yīng)需要NAD+參與催化，還需要ATP和Mg

2+。最初的研究表明，該酶不能催化平端雙鏈DNA間的連接，但隨后發(fā)現(xiàn)，在聚乙二醇或Ficoll（聚蔗糖）的存在下，該酶能催化平端的連接。

大腸桿菌DNA連接酶不能連接RNA。第四十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五DNA連接酶催化的反應(yīng)第五十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五T4DNA連接酶的特點

T4DNA連接酶為一分子量為68kD的蛋白，它催化互補粘性末端的連接或切口的連接。它還可以催化平端的連接，連接平頭末端所需的酶量為連接粘性末端的10~20倍。加入150~200mmol/L的NaCl及低濃度的PEG可大大提高平端連接的速率。T4DNA連接酶催化連接反應(yīng)也需要ATP和Mg2+。

37℃有利于DNA連接酶的活性，但對粘性末端的結(jié)合來說溫度太高，兩者折衷，一般以4~15℃下進(jìn)行連接反應(yīng)為宜。

第五十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五T4RNA連接酶

T4RNA連接酶催化單鏈DNA或RNA與另一單鏈DNA或RNA連接。

第五十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五S1核酸酶（米曲霉）

S1核酸酶是單鏈內(nèi)切酶，切割單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5＇磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。雙鏈DNA、雙鏈RNA及DNA:RNA雜交體對此酶相對不敏感，但如果所用S1核酸酶的酶量非常大，則雙鏈核酸可被完全消化。中等量的S1核酸酶可在缺口或切口處作用（第二式）。該酶在酸性條件下作用，以Zn2+為活化劑。

第五十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五Bal31核酸酶（AlteromonasespejianaBal31）

Bal31核酸酶既是單鏈內(nèi)切酶，與S1核酸酶有同樣的作用，又是雙鏈外切酶，可以從雙鏈DNA的兩端有節(jié)制地降解雙鏈DNA，產(chǎn)生縮短的雙鏈DNA。后一功能可用于產(chǎn)生不同缺失程度的突變體。

第五十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五Bal31核酸酶催化的反應(yīng)第五十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五

DNaseⅠ（牛胰）

DNA內(nèi)切酶，Mg

2+存在時可在雙鏈DNA上造成隨機切口，Mn2+存在時可在兩條鏈的大致同一位置上切割DNA，產(chǎn)生平端DNA片段，或產(chǎn)生只帶有1~2個核苷酸單鏈突出的片段。第五十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五外切酶Ⅲ（大腸桿菌）

此酶從雙鏈DNA的兩個3＇端逐個切下核苷酸，可作用于平端及3＇凹端的雙鏈DNA，不作用于單鏈DNA及帶有3＇突出端的雙鏈DNA。該酶持續(xù)作用不強，因此產(chǎn)物一般為一個被切割程度不相上下的DNA分子集群。

第五十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五分子雜交

用帶有標(biāo)記的已知核酸片段（稱為探針）與變性的未知核酸退火配對的過程就是分子雜交。雜交有DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA雜交。通過分子雜交可以在許多不同核酸片段中尋找或探測出特定的核酸片段。第五十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五印跡

分子雜交中的印跡，是將核酸分子從凝膠或細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到膜上的過程。雜交必須在膜上進(jìn)行，所以電泳分離的核酸或培養(yǎng)基上的菌落或噬菌斑必須先印跡到膜上。常用的膜有硝酸纖維素膜（nitrocellulosefiltermembrane，NC膜）和尼龍（nylon）膜。NC膜結(jié)合能力較強，雜交信號本底較低，缺點是膜質(zhì)脆易破，高溫下結(jié)合核酸分子不夠牢固。尼龍膜結(jié)合能力比NC膜強，柔性好可反復(fù)使用，但有時雜交信號本底較高。

第五十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五分子雜交Southern印跡Northern印跡斑點印跡和狹線印跡印跡種類雜交種類濾膜雜交原位雜交菌落或噬菌斑原位雜交組織、細(xì)胞空間定位原位雜交第六十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五Sothern雜交

Sothernblotting是1975年由Southern建立并以他的名字命名的一種DNA轉(zhuǎn)移方法。其基本方法是先將待測DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使DNA按片段大小分開成帶，再用NaOH溶液處理電泳后的凝膠，使其中的DNA變性成單鏈，然后通過毛細(xì)作用將單鏈DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）或尼龍膜上，膜晾干后在80℃（真空）烘烤2小時，使核酸片段結(jié)合得更牢固，再用標(biāo)記探針去雜交，通過放射自顯影或其他顯色方法找出雜交帶。第六十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五Southern印跡第六十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期五South