分子生物學(xué)常用技術(shù)及其應(yīng)用

分子生物學(xué)常用技術(shù)及其應(yīng)用第一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)基因工程一基因工程的基本概念DNA重組——不同來源的DNA分子通過末端共價連接而形成重新組合的DNA分子的過程?；蚬こ獭捎萌斯し椒▽⒉煌瑏碓吹腄NA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程。生物技術(shù)——包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、、細(xì)胞工程?？寺　ㄟ^無性繁殖所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。第二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五二、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶：能從中間有選擇性地切割DNA分子特異序列。DNA連接酶DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶多核苷酸激酶堿性磷酸酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶第三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五三、載體載體必須符合以下幾點(diǎn)要求：（1）能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并具有較高的拷貝數(shù)（2）容易進(jìn)入宿主細(xì)胞（3）具有多個限制性核酸內(nèi)切酶單一的酶切位點(diǎn)（4）容易從宿主細(xì)胞中分離純化（5）有容易被識別篩選的標(biāo)志常用的載體包括：質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒、病毒由質(zhì)粒與λ噬菌體構(gòu)成第四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五四、重組DNA技術(shù)的基本原理制備DNA片段，并通過載體將其導(dǎo)入受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以獲得單一DNA分子的大量拷貝。第五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五五、重組DNA技術(shù)的基本過程（一）制備目的基因和載體；（二）DNA的重組；（三）重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（四）DNA重組體的篩選和鑒定（五）DNA重組體的擴(kuò)增和表達(dá)第六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五（一）目的基因的制備：目的基因的篩選和分離可采用以下方法進(jìn)行：1．直接從染色體DNA中分離：僅適用于原核生物基因的分離，較少采用。

第七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五2．人工合成：根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。

第八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五3．從mRNA合成cDNA：采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ)DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補(bǔ)DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法通常可得到可表達(dá)的完整基因。

第九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五4．從基因文庫中篩選：將某一種基因DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(genomicDNAlibrary)。將某種細(xì)胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(cDNAlibrary)。C-文庫具有組織細(xì)胞特異性。

第十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五5．利用PCR合成：(聚合酶鏈反應(yīng)）如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因。第十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五（二）目的基因與載體連接(DNA的重組）

主要通過DNA連接酶和雙鏈DNA粘性末端序列互補(bǔ)結(jié)合。1、粘性末端連接利用同種限制性內(nèi)切酶切開載體和DNA分子，能產(chǎn)生相同的粘性末端，在T4連接酶作用下遍可互補(bǔ)。2、同聚物加尾連接在酶的催化下人為在DNA鏈3‘末端添加多聚脫氧單核苷酸，制造粘性末端。3、平末端連接在T4DNA連接酶的作用下，直接連接DNA平端末端，效率較低。4、人工接頭連接在平端DNA末尾加上人工合成的具有限制性DNA內(nèi)切酶的DNA片段，再用內(nèi)切酶作用產(chǎn)生粘性末端。第十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五（三）將外源性DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞常用的方法兩種：1、轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化——指將質(zhì)?；蚱渌庠葱訢NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。包括CaCl2制備感受態(tài)宿主細(xì)胞、法電穿孔法、顯微注射法、基因槍法等2、感染感染——以噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)胞或病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖的過程。用滅活的噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)外殼包裹重組的DNA分子，使其進(jìn)如宿主細(xì)胞。第十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五（四）目的基因的篩選和鑒定常用的方法包括：遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR、核苷酸序列測定、DNA限制內(nèi)切酶圖譜分析法等。遺傳學(xué)法：載體經(jīng)常帶有抗藥基因，利用含有該藥物的培養(yǎng)基直接分離。分子雜交法：利用32P標(biāo)記的探針與被檢對象進(jìn)行雜交鑒定。免疫學(xué)法：利用特異性抗體與基因表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合的方法。第十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五（五）克隆基因的表達(dá)不同的目的基因在真核和原核表達(dá)體系中表達(dá)結(jié)果不同。真核細(xì)胞可用于表達(dá)原核基因原核細(xì)胞表達(dá)的真核基因產(chǎn)物還需要進(jìn)一步加工處理，如甲基化、糖基化、折疊第十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五六、基因工程在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究疾病的診斷和基因治療生產(chǎn)基因工程藥物：既可改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)，提高產(chǎn)量，也可用于新蛋白類藥物的生產(chǎn)。制造轉(zhuǎn)基因動物：可用于藥物蛋白生產(chǎn)、器官移植人類基因工程組計(jì)劃蛋白質(zhì)工程：通過基因工程改變蛋白質(zhì)第十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)核酸的分子雜交核酸分子雜交——依據(jù)兩條單核苷酸鏈之間的堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性的原理，用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針，檢測待測樣品中是否存在與其互補(bǔ)的同源核苷酸序列的方法。第十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五一、核酸分子雜交的基本原理探針核酸分子與變性的被檢核酸分子復(fù)性，通過堿基互補(bǔ)的原則，形成雜交分子。探針必須帶有標(biāo)記，可用于定性和定量分析第十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五（二）核酸分子雜交的基本方法Southern印跡雜交待測核酸是DNA片段，是DNA與DNA雜交，指將酶切并經(jīng)電泳分離的DNA片段固定在載體上，與探針進(jìn)行雜交。Northern印跡雜交待測核酸是RNA片段，指將待測RNA經(jīng)分離后固定在載體上，與探針進(jìn)行雜交。斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交直接將變性核酸固定在載體上，用探針進(jìn)行雜交。優(yōu)點(diǎn)是一張膜同時可用多種不同探針檢測原位雜交直接用探針和細(xì)胞內(nèi)的核酸進(jìn)行雜交第十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五三、探針的特征（一）探針的特征1、要帶有標(biāo)記物2、應(yīng)是單鏈3、具有高度的特異性4、探針長段不一，短探針雜交速率快且特異性強(qiáng)5、標(biāo)記的探針應(yīng)具有高度的靈敏性、穩(wěn)定、標(biāo)記方法簡便、安全第二十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五（二）探針的種類與制備1、基因組DNA探針——直接從基因組分離2、cDNA探針——通過逆轉(zhuǎn)錄生成3、寡核苷酸探針——人工聚合成4、RNA探針——轉(zhuǎn)錄生成第二十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五（三）探針的標(biāo)記物放射性標(biāo)記物：32P、35S、3H、125I、131I非放射性標(biāo)記物：生物素、地高辛、熒光素、酶（四）標(biāo)記方法體內(nèi)標(biāo)記法：將標(biāo)記物摻入培養(yǎng)基體外標(biāo)記法：化學(xué)法或酶法第二十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)

polymerasechainreaction聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

——體外高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因或DNA片段的技術(shù)。第二十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五一、PCR的基本原理其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間等，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增第二十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：模板DNA（基因組DNA），隨機(jī)小分子RNA引物，dNTPs酶：DNA聚合酶，解旋酶，引發(fā)酶反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，37℃反應(yīng)過程：模板DNA解旋、引發(fā)體的形成、延長（三階段）產(chǎn)物：模板DNA（基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍

原料：模板DNA（基因組DNA，cDNA）一對特異性寡核苷酸引物，dNTPs酶：TaqDNA聚合酶反應(yīng)條件：合適的緩沖液，三種變化的溫度（94，50-70，72℃），一定的循環(huán)數(shù)（25-35）反應(yīng)過程：DNA模板變性（解鏈）、模板與引物退火、引物延伸（三階段，多循環(huán)）產(chǎn)物：目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍.PCR第二十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五二、過程（經(jīng)典操作過程）

1、高溫變性（DNA模板變性）與體內(nèi)DNA解鏈過程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過95℃左右的高溫使其發(fā)生變性，形成單鏈DNA

第二十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五2、低溫退火（模板與引物退火）

PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時的引物（primer）,這兩個引物分別與待擴(kuò)增模板DNA的目標(biāo)片段兩端的序列互補(bǔ)。在降低溫度的過程中（一般為70-75℃，通過控制退火條件，引物就能準(zhǔn)確地與擴(kuò)增區(qū)域的兩端配對。primers第二十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五⑴引物短，不易纏繞；⑵設(shè)計(jì)的引物是與模板DNA兩端序列互補(bǔ)；⑶引物的量遠(yuǎn)大于模板分子的量，引物與模板DNA形成雙鏈的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA分子自身的復(fù)性。

第二十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五3、適溫延伸（72℃）在PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按堿基配對的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補(bǔ)的復(fù)制鏈。Taq酶dNTPS

新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。

第二十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)每一循環(huán)后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。理論上講，擴(kuò)增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，即n個循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。而實(shí)際上，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為（1+X）n，X為擴(kuò)增效率，平均為75%熱變性-復(fù)性-延伸25-35次循環(huán)百萬倍擴(kuò)增第三十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五盡管PCR擴(kuò)增DNA非常有效，但目的DNA序列的指數(shù)擴(kuò)增并不是一個無限制的過程。在正常的反應(yīng)條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，就會出現(xiàn)平臺效應(yīng)

(Plateau)

，產(chǎn)物的量不再增加?！捌脚_效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度等多種因素。第三十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五RT—PCR以mRNA為原始模板的PCR，亦稱逆轉(zhuǎn)錄PCR。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42℃進(jìn)行，隨后將反應(yīng)混合物加熱至95℃5min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，取2ul反應(yīng)產(chǎn)物，按DNA為模板的PCR反應(yīng)步驟，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。第三十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五三、PCR在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

對人類遺傳信息的認(rèn)識和研究基因工程藥物與疫苗生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物和植物制造基因診斷與基因治療第三十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五鐮刀型紅細(xì)胞貧血第三十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五Chehab等設(shè)計(jì)一對引物把含有突變的DNA片段（共294bp）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶OxaNI消化，瓊脂糖凝膠電泳后染色觀察：正常人有2個片段，191和103bp，鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的

純合子，僅有一個片段294bp

雜合子有191、103和294bp3個片段第三十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五綜合了分子生物學(xué)、微電子學(xué)、微加工和計(jì)算機(jī)等學(xué)科知識本質(zhì)：在固定的玻片等載體上的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，芯片上每平方厘米可排列成千上萬生物分子，能快速準(zhǔn)確地檢測核酸，并獲取樣品中的有關(guān)信息。第四節(jié)DNA芯片技術(shù)第三十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五一、DNA芯片技術(shù)的概念和主要類型DNA芯片技術(shù)——指將大量已知寡核苷酸或DNA探針（不標(biāo)記）按特定的排列方式固化在固相支持物（多用計(jì)算機(jī)硅芯片）表面，按堿基互補(bǔ)配對的原則，與標(biāo)記的特異的單鏈DNA或RNA（待測樣品）分子雜交形成雙鏈，通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品分子的數(shù)量和序列信息。第三十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五DNA芯片主要類型原位合成芯片