2023年分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

〔生物科技行業(yè)分子生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)分子生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)2023，2分子生物學(xué)試驗(yàn)留意事項(xiàng)1．課前要提前預(yù)習(xí)試驗(yàn)內(nèi)容，了解試驗(yàn)設(shè)計的原理，理清試驗(yàn)挨次，制定試驗(yàn)方案〔沒有方案或方案不合理者不能進(jìn)入試驗(yàn)操作。2．由于試驗(yàn)內(nèi)容多，時間短，多數(shù)試驗(yàn)需要同時或穿插進(jìn)展，壹定要做好統(tǒng)籌安排。3．試驗(yàn)課中的全部單項(xiàng)試驗(yàn)都屬于壹個整體流程。試驗(yàn)時間安排上沒有上下午晚上等嚴(yán)格的作息安排，壹切聽從試驗(yàn)進(jìn)度，必需在理論課上課期間完成。4．試驗(yàn)的每壹步都要具體地記錄操作內(nèi)容、時間、步驟、結(jié)果等，以備查詢！5．對任何自己不生疏的試驗(yàn)儀器都不要隨便操作〔。在操作的過程中覺察任何意外的現(xiàn)象都要準(zhǔn)時向任課教師匯報。6．寫作試驗(yàn)報告或試驗(yàn)論文壹定要文理通順、規(guī)律清楚、圖表說明具體，爭論分析透徹。在試驗(yàn)室內(nèi)不能大聲喧嘩。在試驗(yàn)的過程中制造的任何垃圾都要丟到垃圾筐里〔或先放在自己的桌面壹角地丟棄！特別留意對廢棄細(xì)菌的殺滅和有毒垃圾的定點(diǎn)投放。試驗(yàn)完畢后要把用過的器皿清洗后歸放整齊且清點(diǎn)數(shù)目，向教師匯報征得同意前方可離開試驗(yàn)實(shí)。值日組的同學(xué)最終離開，等待清掃試驗(yàn)室的衛(wèi)生，關(guān)閉門窗水電。試驗(yàn)時損壞的任何物品都要準(zhǔn)時申報。DNA目的學(xué)會最常用的小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法。原理依據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分別。在pH12.012.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA雙螺旋構(gòu)造解開而被變性。盡管在這項(xiàng)的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會變性，但倆條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會嚴(yán)密結(jié)合在壹起。當(dāng)參加pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，經(jīng)過離心和蛋白質(zhì)和大分子RNA器材超凈工作臺，接種環(huán)，酒精燈，臺式離心機(jī)，旋渦混合器，微量移液取樣器，1.5ml微量離心管，恒溫?fù)u床，搖菌試管，雙面微量離心管架，試管架，標(biāo)簽紙，磁力攪拌機(jī)。試劑pMD18-T-F載體菌，LB培育基 1000ml〔含100ug/ml氨芐青霉素〕，葡萄糖〔溶液ISc溶液〕〔。試驗(yàn)預(yù)備氨芐青霉素儲存液〔無菌水配制C保存，配制B培育基〔胰化蛋白10g5g，NaCl10g200mLddwater200L5NNaOH調(diào)H至0，加r至L1n滅菌；溶液IL葡萄糖，；溶液；溶液〔r至C保存；〔A酶A溶于，l中；搖菌試管洗凈且蓋上棉花塞、1.5ml離心管裝入鋁制飯盒、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒， 壹起高壓滅菌〔。操作步驟在超凈工作臺中取〔，參加滅菌的搖菌管中。從超低溫冰箱中取出保存pMD-18T-F的菌種〔操作完后快速把菌種放回超低溫冰柜中，切不行將菌溶化，在超凈工作臺上用燒紅的接種環(huán)刮壹下，再把接種環(huán)于無菌B培育液〔100ug/ml〕中攪拌壹下，37C20h。取1.5ml1.5ml離心管中，15000rpm1min〔盡量棄干凈，留沉淀備用。在沉淀中參加100l溶液I，蓋上蓋后馬上在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min?！驳却耐瑫r，取壹個塑料盒，裝上適量的冰塊備用〕參加200l溶液II，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min。參加150l溶液III，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min?！瞞離心，留神吸取l上清液于另壹個干凈的l〔不要將白色沉淀物帶入，參加5min。〔8〕15000rpm離心10min，留神棄掉上清液，參加500l70%乙醇，蓋上蓋后馬上在渦旋混合器上混勻。15000rpm10min，留神棄掉上清液，盡量倒置棄干凈再參加500l7015000rpm離心10min，留神棄掉上清液，盡量倒置棄干凈離心管倒置于37C培育箱中〔或室溫〕空氣枯燥〔管底的沉淀質(zhì)粒DNA用肉眼幾乎見不見。pMD18-T-F參加30l無菌蒸餾水或TE緩沖液，用記號筆標(biāo)記后放入冰箱中備用。在剩余的菌液中倒入少許84消毒液，待溶液變清亮后隨廢液和剩余的冰塊壹起倒入下水池。清理桌面，清洗儀器，撰寫試驗(yàn)報告思考〔1〕影響本試驗(yàn)結(jié)果的因素有哪些？DNA目的學(xué)會用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA。原理II型限制性內(nèi)切酶能識別雙鏈DNA內(nèi)部的特別序列且在識別位點(diǎn)處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過電用酶切后的DNA器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，水漂，恒溫水浴。試劑F，內(nèi)切酶緩沖液試驗(yàn)預(yù)備配制E〔儲存液〔加樣緩沖液，1.5ml〔滅菌、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒〔滅菌〕操作步驟混合以下溶液于壹個無菌的1.5ml微量離心管中：pMD18-T-FDNApUCm-T-F)6μL10×酶切緩沖液〔用EcoRI的緩沖液〕2μLddwater30μLEcoRI1μLBamHI1μL40μL-20℃冰柜中取出限制性內(nèi)切酶，馬上插入冰塊中。用壹只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部〔以免手指的給酶液加溫1μL在酶切樣品混合液中參加限制性內(nèi)切酶后〔，輕輕震驚微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機(jī)中1000rpm離心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推舉的最適酶切溫度水浴中溫育〔壹般是℃。酶切后取少量酶切產(chǎn)物和適宜的分子量的DNA〔如從前的PCR產(chǎn)物〕比照電泳，以確認(rèn)切下的片斷是否為自己想要的片斷。酶切后的質(zhì)粒能夠回收備用。清理桌面垃圾，清洗試驗(yàn)儀器。撰寫試驗(yàn)報告。思考酶切反響混合物的體積是否對酶切效果有影響？為什么？如何估量DNA用量和酶的用量？在吸取內(nèi)切酶的時候如何操作才能別免鋪張？DNAPCR目的學(xué)會PCR操作的根本技術(shù)。原理是將待擴(kuò)增的DNA模板加熱變性，和其倆側(cè)互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物復(fù)性，然后經(jīng)過耐熱的An次循環(huán)后A〕nt的引物退火溫度〔〕〔。器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，0.2mlPCR微量管，雙面微量離心管架，PCR試劑AR緩沖液，引物，pMD18-T-Fddwater。試驗(yàn)預(yù)備P混合液〔每種E溴化乙錠儲存液加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒〔滅菌、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒〔滅菌。合成的引物：Senseprimer5”-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3”Antisenseprimer5”-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3”目的基因模板質(zhì)粒：已經(jīng)克隆在pMD18-T-F載體上的781bpNDV-F基因。待擴(kuò)增的F837bp。操作步驟在0.2mlPCR微量離心管中配制50μl反響體系。ddwater32μl10×PCRbuffer〔不含MgCl2〕5μl25mMMgCl23μl2.5mmol/LdNTP4μl〔dNTP0.2mM〕10μmol/LPrimer12μl〔12.5—25pmoles〕10μmol/Lprimer22μl〔12.5—25pmoles〕1μl〔1×10-3pmoles〕3U/μlTaq1μl〔3u〕50μl依據(jù)廠商的操作手冊設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序：①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min50s⑤goto②29times⑥72℃10minPCR完畢后，取10μl產(chǎn)物進(jìn)展瓊脂糖凝膠電泳。觀看膠上是否有估量的主要產(chǎn)物帶。清理桌面，撰寫試驗(yàn)報告。思考復(fù)性溫度如何確定？為什么要在最終延長10min？是否有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物〔或引物二聚體，如何才能消退？試驗(yàn)四、DNA目的學(xué)會常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳原理DNA雙螺旋分子骨架倆側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根，在電場中會向正極方向移動。不同長DNA器材電泳儀，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊，250ml三角瓶，微波爐，臺式離心機(jī)，旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，分光光度計，微量移液取樣器，1.5ml離心管，雙面微量離心管架，試管架等。試劑pMD18-T-FTAE1000溴化乙錠儲存液，電泳級瓊脂糖粉，10加樣緩沖液〔或加樣緩沖液A分子量標(biāo)準(zhǔn)，。試驗(yàn)預(yù)備配制TAE電泳緩沖液〔50儲存液，pH約8.5Tris堿242g57.1ml冰乙酸，O，r定容至L，溴化乙錠儲存液溴化乙錠溶于100mLddwater4C避光儲存〕10加樣緩沖液〔20%Ficoll400，蔗糖水溶液l離心管裝入鋁制飯盒〔滅菌、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒〔滅菌6．操作步驟稱取0.5g瓊脂糖粉，放入三角瓶，參加50mlTAE電泳緩沖液(1)，放入微波爐中燒開l正好倒倆塊小膠。留意觀看燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停頓微波爐〔切不行讓膠溶液溢出到微。戴上線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻致不燙手〔約C。把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至和模具的矮邊緣相平即可，不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置10-20分鐘待膠完全凝固〔剩下的膠溶液封口后留待以后再熔化使用。在水平電泳槽中加滿 1TAE電泳緩沖液。依據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至170V(10V/cm)，留意正負(fù)電極的位置連接正確。待膠完全凝固后0分鐘，留神拔出梳子。用手指捏住模具倆側(cè)的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺上，凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的壹側(cè)要朝向電泳槽的負(fù)極。剪1〔或封口膜6l1l103l質(zhì)粒DNA10lDNA在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10l的吸液頭分別將管中的樣品參加凝膠的加樣孔中〔假設(shè)需要時，在相鄰的加樣孔中參加1.5-3lDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。加樣時持移液器的手以肘部固定在桌上，用另壹只手扶住這只手的手腕，以削減移液器的抖動。見到藍(lán)色的樣品吸管尖頭伸進(jìn)加樣孔后〔不能伸得太深，以免穿破凝膠的底部〕緩緩將藍(lán)色的樣品壓入加樣孔中。切不行使藍(lán)色樣品流到孔外。翻開電源開關(guān)，