發(fā)酵分析色譜分析概述

發(fā)酵分析色譜分析概述第一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五一、色譜法的特點、分類和作用

混合物最有效的分離、分析方法。俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜法是一種分離技術(shù)，試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。第二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五碳酸鈣（固定相）色素混合液石油醚

(流動相）1906年，Tsweet

發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象色譜柱色帶第三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五植物色素分離圖示第四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五色譜法的特點（1）分離效率高

復(fù)雜混合物，有機同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高

可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣

氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。不足之處：

被分離組分的定性較為困難。第五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五色譜法的分類1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分類流動相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜超臨界流體色譜法——流動相為超臨界流體第六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五色譜法分類（續(xù)前）2．按固定相的固定方式分類3．按分離機制分類平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細管柱色譜

分配色譜吸附色譜離子交換色譜空間排阻色譜毛細管電詠法毛細管電色譜法毛細管電泳第七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五二、色譜過程、分離原理及特點㈠色譜過程指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過程以吸附色譜為例見圖示吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離第八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五圖示分配系數(shù)的微小差異→吸附能力的微小差異微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強的組分后流出back第九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五㈡色譜分離原理色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來衡量㈢色譜分離特點

1．不同組分通過色譜柱時的遷移速度不等→提供了分離的可能性

2．各組分沿柱子擴散分布→峰寬→不利于不同組分分離第十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五三、色譜流出曲線與術(shù)語1.基線

無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。2.保留值

（1）時間表示的保留值

保留時間（tR）：組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間；

死時間（tM）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時間；

調(diào)整保留時間（tR

＇）：tR＇=tR－tM

第十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

VR=tR×F0F0為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。

死體積（VM）：

VM=tM×F0

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

第十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五3.區(qū)域?qū)挾?/p>

用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354（3）峰底寬(Wb)：Wb=4第十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五四、分配系數(shù)與色譜分離㈠分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù)分配系數(shù)K(平衡常數(shù))：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達分配平衡后，在固定相與流動相中的濃度比（色譜過程的相平衡參數(shù)）注：K為熱力學(xué)常數(shù)與組分性質(zhì)、固定相性質(zhì)、流動相性質(zhì)及溫度有關(guān)實驗條件固定，K僅與組分性質(zhì)有關(guān)第十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五五、色譜定性與定量方法1.色譜定性分析(1)利用保留值及其規(guī)律定性各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標(biāo)。利用純物質(zhì)對照定性利用文獻值對照定性第十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五純物質(zhì)對照定性實現(xiàn)方法利用保留時間定性

第十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五用相對保留值定性

用已知物增加峰高法定性

第十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五文獻值對照定性分析（GC）實現(xiàn)方法測定保留指數(shù)I優(yōu)點：無需純物質(zhì)；保留指數(shù)具有較好的重現(xiàn)性和精密度；只與固定相和柱溫有關(guān)。缺點：對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物質(zhì)，缺乏數(shù)據(jù)。適用范圍：適用于簡單混合物，無需純物質(zhì)。第十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五（2）與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定:第十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五

外標(biāo)法外標(biāo)法也稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線法。特點及要求：外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高操作條件變化對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大對進樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析第二十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五

內(nèi)標(biāo)法原理：利用被測物與內(nèi)標(biāo)物校正因子的比值不變來進行定量的。首先用被測物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，求得校正因子比值：然后，樣品中加入內(nèi)標(biāo)物，再由它和樣品的峰面積來計算：fis＝fi/fs－內(nèi)標(biāo)物與被測組份校正因子的比值；mi－被測組份i的含量；ms－加入內(nèi)標(biāo)物的量；As－內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai－組份i的峰面積；第二十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五(a)內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進樣量的稍許變動對定量結(jié)果的影響不大。(b)每個試樣的分析，都要進行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析。內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：（a）試樣中不含有該物質(zhì)；（b）與被測組分性質(zhì)比較接近；（c）不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（d）出峰位置應(yīng)位于被測組分附近，且無組分峰響。內(nèi)標(biāo)法特點第二十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五與外標(biāo)法比較：1.外標(biāo)法：2.內(nèi)標(biāo)法：可以推導(dǎo)出：第二十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五思考題色譜分離的原理及過程。第二十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)薄層層析（Thin-layerchromatography）第二十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五1、基本原理薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種

一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動時，由于吸附劑對不同組分的吸附力不一樣，不同組分在展開溶劑中的溶解度不一樣，點在薄板上的混合樣品隨著展開劑的移動速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復(fù)進行，而將樣品各組分分離開來）第二十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五Thin-LayerChromatography:ATwo-ComponentMixtureMorepolar!Lesspolar!solvent

frontoriginmixturesolvent

frontcomponent

Bcomponent

Aoriginsolvent

frontcomponent

Bcomponent

AoriginIncreasingDevelopmentTime第二十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五Thin-LayerChromatography:DeterminationofRfValuesRfofcomponentA=dAdSRfofcomponentB=dBdSTheRfvalueisadecimalfraction,generallyonlyreportedtotwodecimalplaces第二十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五Thin-LayerChromatography:QualitativeAnalysis第二十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五固定相：氧化鋁Acidic:-Al-OHNeutral:-Al-OH+-Al-O-Basic:-Al-O-第三十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五硅膠吸附薄層層析吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠

硅膠：表達式為SiO2·XH2O。層析用硅膠是一種多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極性硅醇基（－Si－OH），這種極性的硅醇基能和許多化合物形成氫鍵而產(chǎn)生吸附.第三十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五硅膠吸附薄層層析的特點：

①硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負性相關(guān)。②硅醇基顯較弱的酸性，因而，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它分離。③硅膠的活化溫度通常為105℃－110℃，不能過高。第三十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五2、操作步驟

—薄層板的制備

1、調(diào)漿稱取硅膠3克，加0.5%的羧甲基纖維素鈉8毫升，調(diào)成均勻的糊狀。

2、涂布取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層。

3、干燥將玻璃板水平放置，室溫下自然涼干。

4、活化

70℃烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時取出。第三十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第三十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五展開劑的選擇第三十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五1、位置：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個點。每個樣品間相距約1cm。2、取樣：用毛細管分別吸取氨基酸溶液，取樣量為毛細管柱高5cm。3、點樣：點樣毛細管輕輕接觸薄層表面點樣。加樣后原點擴散直徑不超過2mm。

AlaArgGlyMix輕觸疾起操作步驟—點樣第三十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五

(a)點狀點樣(b)條狀點樣(c)頸部點樣(d)溝槽點樣第三十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五半自動點樣儀手動點樣器第三十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五操作步驟—

展層、顯色AlaArgGlyMix

將薄層板點樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應(yīng)低于點樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當(dāng)展層劑前沿離薄板頂端2cm時，停止展層，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線，用熱風(fēng)吹干或在85℃下烘干，即可顯出各層斑點。第三十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五物理顯色含有共軛雙鍵的有機物質(zhì)能吸收紫外光，將分離后的薄層板置于紫外燈下，組分薄層呈現(xiàn)暗色斑；如果采用硅腔GF(或其它含有熒光指示劑的吸附劑)鋪成的薄層，在紫外光照射下，整個薄層呈顯黃綠色熒光，斑點部分呈現(xiàn)暗色，更為明顯。利用蒸氣熏顯色時，常用的試劑有固體碘、濃氨水、液體溴。進行顯色時，把這些易揮發(fā)的試劑放置在密閉容器內(nèi)（例如標(biāo)本瓶、標(biāo)本缸、干燥器等），使它們的蒸氣充滿整個容器，將已展開并已揮發(fā)去溶劑的薄層板放入其中，使之顯色。第四十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五化學(xué)顯色的方式通常有直接噴霧法和浸漬法兩種。

化學(xué)顯色常用的顯色劑劑大致可以分為兩類，即通用顯色劑和專屬性顯色劑。通用顯色劑：對未知化合物的檢測，可以考慮先用通用顯色劑。這種顯色劑是利用它與被測組分的氧化還原反應(yīng)、脫水反應(yīng)及酸堿反應(yīng)等而顯色的，常用的有50％的硫酸溶液、酸堿指示劑溶液、5％磷鉬酸乙醇溶液、熒光顯色劑等。第四十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五：

第四十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五結(jié)果計算Rf=斑點至原點距離溶劑前緣至原點距離

小心量出斑點中心至原點中心距離，再量出原點中心至溶劑前沿的距離，計算出它們的Ｒｆ值。

根據(jù)Ｒｆ值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。第四十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五薄層色譜掃描儀第四十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五

定義：紙色譜分離法又稱紙層析法，是根據(jù)不同物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)不同而進行分離的一種微量分離方法。載體——層析紙（濾紙）；固定相——濾紙上的吸濕水分；流動相——有機溶劑（展開劑）。紙色譜第五十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五思考題簡述TLC的操作步驟。第五十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五概念：離子交換分離法是利用離子交換劑與溶液中的離子之間所發(fā)生的交換反應(yīng)進行分離的方法。（二）離子交換色譜第五十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五儀器設(shè)備簡介第五十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五離子交換全套裝置第五十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)-網(wǎng)絡(luò)骨架苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、環(huán)氧系第六十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五離子交換樹脂結(jié)構(gòu)骨架：接有功能基團，本身是惰性功能基團：連接在骨架上，可與相反離子結(jié)合待交換分子：在吸附階段可與活性離子交換，與骨架上的功能基團結(jié)合活性離子：與功能基團所帶電荷相反的可移動的離子第六十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五活性離子為陽離子，稱陽離子交換樹脂，與陽離子發(fā)生交換活性離子為陰離子，稱陰離子交換樹脂，與陰離子發(fā)生交換第六十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五基質(zhì)