版藥典微生物限度檢查法操作要點

０5林麗英05前版本的藥典沒有要求對檢驗方法進展必要的驗證，所以大家都覺得不好理解、不0驗證時的操作要點與大家作個探討。一、驗證的目的由于制劑在投料和加工過程中，或有抑菌成份存在，或由于各種成份相互作用的結果,將可能對某些類型的微生物的檢出產(chǎn)生影響。對所建立的微生物限度檢查法進展驗證的目的,就是要對每個樣品使用適宜的檢驗方法，順當?shù)臋z出樣品中污染的各種類型的菌。細菌計數(shù)驗證所用的菌株:大腸埃希菌［ＣMCC(B〕4４102]：代表革蘭陰性菌；[CMＣC〔Ｂ)2600３]：代表革蘭陽性球菌;枯草芽孢桿菌[CＭＣC〔B〕63501]:代表革蘭陽性桿菌;霉菌計數(shù)驗證所用的菌株：[CMCC(F〕９800１]：代表酵母菌;黑曲霉［CＭCＣ(F)980０3:代表霉菌；由于每個菌株代表不同類型的菌，所以只有這五個菌株的回收率均到達要求,才說明樣品中污染的各種類型的菌都可能檢出來，否則，所得的結果是不能真實地反映樣品的污染狀況的。菌液的制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的穎培育物至養(yǎng)分18～２4,24~48.含菌數(shù)為５0～ｌ００cfu的菌懸液。接種黑曲霉的天，參加３～5ｍl0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后，吸出胞子懸液〔用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾)至無菌試管內(nèi),用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)50~l00cfu的孢子懸液。二、方法的驗證全部驗證方法的操作均應在陽性接種間?！惨?、細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)法的驗證驗證方法3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌株每次試驗的回收率。常規(guī)法50～１001個平皿中，馬上傾,2個平皿,培育,計算各菌株的回收率。,需要多少個平皿呢？試驗組：5×2=1０個,2ml共需１０個；菌液組:5×2=１0個,即每個菌株的加菌量，每株2個皿。 本底菌組：2個細菌計數(shù),2個霉菌和酵母菌計數(shù)。146,6,4,2傾注玫瑰紅鈉瓊脂培育基(虎紅瓊脂培育基)?；厥章?[〔試驗組菌數(shù)－本底菌組菌數(shù))／菌液組菌數(shù)]細菌計數(shù)用該驗證的方法檢驗。當白色念珠菌和黑曲霉27０%以上時,霉菌計數(shù)用該驗證的方法檢驗。培育基稀釋法2mllm1ｍl供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)章報告菌數(shù);掌握菌檢查時，可加大增菌培育基的用量。具體操作:(1mｌ5個皿為例〕1:１01mｌ50．2mｌ，每株試驗菌平行制備2ml的平皿數(shù),,計算各菌株的回收率。,需要多少個平皿呢？試驗組：5×10=50２ｍｌ50個；菌液組:5×2=10個,即每個菌株的加菌量,每株２個皿。 本底菌組:10個細菌計數(shù)，1０個霉菌和酵母菌計數(shù)。離心沉淀集菌法取肯定量的供試液，3０00轉/20分鐘〔供試液如有沉淀,5０0轉/〕，棄去上清液,2mｌ，加稀釋液補至原量。然后用此稀釋液進展檢驗。薄膜過濾法1glml供試品的供試液,1ｇlml所含的菌數(shù)較多時,可取適宜稀釋級的供試液ｌｍl,過濾。無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗后取出濾7個膜。(52個本底菌〕〔二〕掌握菌檢查方法的驗證菌株，驗證大腸菌群檢查法時，應承受大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的制備和掌握菌檢查法的規(guī)定及以下要求進展。菌種對試驗菌種的要求同細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證。大腸埃希菌(Escｈｅriｃhiａcoli)[CMCＣ〔B〕44102]金黃色葡萄球菌(Stａｐhylｏcｏccuｓaurｅuｓ〕(ＣＭCC(Ｂ)2600３)乙型付傷寒沙門菌(SaｌmonelｌaｐaratyphiＢ〕(ＣＭCC〔B〕５0094〕銅綠假單胞菌(Psｅudomｏnａs ａerugmosa)〔CMCC(B)10104)生孢梭菌(Closｔｒidiuｍsporoｇenｅs)(ＣMCC(B)6494１)菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的穎培育物至養(yǎng)分肉湯培育基或養(yǎng)分瓊脂培育基中，生孢梭菌的穎培育0．9%無菌氯化鈉溶液制成每驗證方法,取規(guī)定量供試液,過濾,應加在最終一次沖洗液中,過濾后，注入增菌培育基或取出濾膜接入增菌培育基中?！?〕陰性菌比照組設立陰性菌比照組是為了驗證該掌握菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性比照菌承受金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性比照菌承受大腸埃希菌。陰性比照菌不得檢出。結果推斷,按此供試液制備法和掌握菌檢查法進展供試品的該掌握菌檢查;假設試驗組未檢出試驗菌，應承受培育基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消退供試品的抑菌活性,并重進展方法驗證。三、檢驗方法(一〕計數(shù)法的檢驗計數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時,按已驗證的計數(shù)方法進展供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。平皿法查。承受平皿法進展菌數(shù)測定時,應取適宜的連續(xù)2～3個稀釋級的供試液?！才嘤♂尫?1ml供試液均勻個或以上的平皿中),1５～20mｌ45℃的溶化的養(yǎng)分瓊脂培育基或玫瑰紅鈉瓊脂培育基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培育基,混勻,凝固,倒置培育2個平板。陰性比照試驗取試驗用的稀釋液lmｌ，置無菌平皿中,注入培育基,凝固，倒2個平板，均不得有菌生長。培育和計數(shù)除另有規(guī)定外，細菌培育48小時，逐日點計菌落數(shù),48小時的菌落數(shù)報告;霉菌、酵母菌培育72小時,逐日點計菌落數(shù)，一般以72小時的菌5~7天進展菌落汁數(shù)并報告。菌落集中生告規(guī)章報告菌數(shù)。假設同稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于１５，則兩個平板的菌1倍或以上。;玫瑰紅鈉瓊脂培育基用于霉菌及酵母菌計數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培育基用于酵母菌計數(shù)。在特別狀況下,假設養(yǎng)分瓊脂培育基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培育基上長有細菌，則應分別點汁霉菌和酵母菌、細菌菌落數(shù)。然后將養(yǎng)分瓊脂培育基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培育基上的細菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培育基中的霉菌和酵母菌數(shù)或養(yǎng)分瓊脂培育基中的細菌數(shù)進展比較，以菌落數(shù)高的培育基中的菌數(shù)為計數(shù)結果。胨葡萄糖瓊脂培育基測定酵母菌數(shù)，合并計數(shù)。30~300,作為菌數(shù)報告〔取兩位有效數(shù)字)的依據(jù)。(１)1個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定,以該級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。(比值為高稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值除以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值)而定。假設比2但不超過５時，以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù);5，或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等特別狀況時，應查明緣由再行檢查，必要時,應進展方法的重驗證。３30,數(shù)的值報告菌數(shù)。(４)如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生1時，以<１乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。薄膜過濾法承受薄膜過濾法,濾膜孔徑應不大于０.４５μｍ,直徑約為５0mm。選擇濾膜材質(zhì)時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應承受適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分枯燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應留意保持供試品溶液及沖洗液掩蓋整個濾膜外表,100ml。每片濾膜的總過濾量不宜過大，以避開濾膜上的微生物受損傷。1g或ｌmｌ供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中,混勻,1ｇlｍｌ所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液ｌmｌ,過濾。用pＨ7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數(shù)方法的驗證玫瑰紅鈉瓊脂培育基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培育基平板上培育。每種培育基至少制備一張濾膜。陰性比照試驗 作,作為陰性比照。陰性比照不得有菌生長。培育和計數(shù)培育條件和計數(shù)方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數(shù)應不超過100個。菌數(shù)報告規(guī)章以相當于1g或ｌmｌ落生長,以<1報告菌數(shù)(每張濾膜過濾1g或1ｍl供試品),或<１乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告(二)掌握菌檢查法,增菌培育基的實際用量同掌握菌檢查方法的驗證。陽性比照試驗供試品進展掌握菌檢查時,應做陽性比照試驗。陽性比照試驗的菌。陰性比照試驗取稀釋液10m1照相應掌握菌檢查法檢查，作為陰性比照。陰性比照應無菌生長。根本程序:供試液制備 增菌培育 選擇性培育基培育 似菌落 生化試驗 報告結果１．大腸菌群的檢查ｍ、1：１0０0lml(0．０01g0．001m１1lml1８～２４小時。,判該管未檢出大腸菌群;假設產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應將發(fā)酵管中的培育物分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培育基或麥康凱瓊脂培育基的平板上,18~24小時。假設平板上無菌落生長,2所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭2所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌,應進展確證試驗。表２大腸菌群菌落形態(tài)特征培育基培育基曙紅亞甲藍菌落形態(tài)瓊脂滑，潮濕麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起,邊緣整齊，外表光滑,潮濕確證試驗從上述分別平板上選擇4~5個疑似菌落,分別接種于乳糖發(fā)酵管中,培育菌群。31glmｌ供試品中的大腸菌群數(shù)。各供試品量的檢出結果可能的大腸菌群數(shù)各供試品量的檢出結果可能的大腸菌群數(shù)N/gｍl)0.1g0.1０．01g0．001gｍl0.0１mｌ0.0０1mｌ+++>103++-１０2<N<１03+--1０<N<１０2－--<1０注:+代表檢出大腸菌群；一代表未檢出大腸菌群。2.梭菌檢查8010分鐘后100ml的穎庖肉培育基中。7２～9６小時。如試驗管不消滅渾濁、產(chǎn)氣、消化碎0.2m1,涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培育基平板上,在厭氧條件下培育４8~７２小時。假設平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；假設平板上有菌落生長，應選擇２～３個菌落分別進展革蘭染色和過氧化氫酶試驗。,3%過氧化氫試液,