淺論人端粒酶啟動(dòng)子(hTERTp)真核表達(dá)載體的構(gòu)建

淺論人端粒酶啟動(dòng)子（hTERTp）真核表達(dá)載體的構(gòu)建【摘要】目的克隆人端粒酶催化亞單位(hTERT)的啟動(dòng)子，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-hTERT。方法以人類基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增hTERT上游序列長(zhǎng)約1135bp的啟動(dòng)子片段，克隆入綠色熒光蛋白GFP的基因上游，測(cè)序鑒定。結(jié)果DNA測(cè)序結(jié)果與GenBank中hTERT啟動(dòng)子DNA序列完全一致，片段長(zhǎng)度為1135bp。結(jié)論人端粒酶啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pEGFP-hTERT構(gòu)建成功，為hTERTp調(diào)控元件用于腫瘤靶向性基因治療奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】端粒酶啟動(dòng)子；熒光蛋白；腫瘤

Abstract：ObjectiveTocloneDNAsequenceofhumantelomerasereversetranscriptasepromoter(hTERTp),andtoconstructeukaryoticexpressionplasmidofpEGFP-hTERT.Methods1135bphTERTpromoterwereamplifiedwithpolymerasechainreaction(PCR)method,utilizinghumangenomeastemplate.ThehTERTpromoterwasinsertedintopEGFPtoreconstructarecombinantplasmidnamedpEGFP-hTERTp,andthesequencewasdetected.ResultsDNAsequencingshowedasamesequenceasregisteredinGeneBank.Thesequencecontained1135bp.ConclusionsTheconstructionandtheexpressionofeukaryoticplasmidpEGFP-hTERTphavebeenachievedsuccessfully.TheresearchpavedthewayfortumorgenetherapyofregulatoryelementsofhTERTp.

Keywords:hTERTp;GFP;cancer

端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)兩部分組成。以自身RNA為模板合成端粒酶重復(fù)序列，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它的活性不依賴于DNA聚合酶，對(duì)RNA酶、蛋白酶和高溫均敏感。端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長(zhǎng)度，抑制細(xì)胞的衰老，在生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中可檢測(cè)到高水平的端粒酶活性。端粒酶具有使腫瘤細(xì)胞系持續(xù)復(fù)制生存的特點(diǎn)，成為近期生命科學(xué)界關(guān)心與研究的一個(gè)熱點(diǎn)。端粒缺陷的染色體不穩(wěn)定性使其通過促進(jìn)半合子化、轉(zhuǎn)位、擴(kuò)增及重組裝而加速腫瘤進(jìn)程。端粒磨耗的最終結(jié)果是端粒酶的活化，以彌補(bǔ)端粒的丟失而使細(xì)胞無限增殖，成為永生細(xì)胞。端粒酶活化使腫瘤進(jìn)入晚期，而啟動(dòng)子的激活是細(xì)胞永生的關(guān)鍵一步，因此端粒酶的啟動(dòng)子(humantelomerasereversetranscriptasepromoter,hTERTp)已經(jīng)逐漸成為學(xué)者們研究的焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用PCR方法克隆了hTERTp的DNA序列,并將其替換綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-N1上游的啟動(dòng)子,以便為研究以hTERTp為靶點(diǎn)的腫瘤靶向性基因治療奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

細(xì)菌和質(zhì)粒大腸桿菌DH5α購買于Takara公司；熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-N1購買于Promega公司。

主要試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)備DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小量提取純化試盒、kbMarker、PCR產(chǎn)物純化試劑盒為北京威格拉斯技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR引物由大連寶生物有限公司合成；限制性內(nèi)切酶AseⅠ、BamHⅠ、Taq聚合酶、DNA連接試劑盒DNALigationKitVer.為TaKaRa公司產(chǎn)品；LipofectamineTM2000、Trizol購買于Invitrogen公司；主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備有:Biometrapersonal公司生產(chǎn)的PX2型96孔PCR擴(kuò)增儀,Bio-RAD公司生產(chǎn)的PCA300型電泳儀。

主要試驗(yàn)步驟

hTERTp的PCR擴(kuò)增及鑒定根據(jù)GenBank中hTERT序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。DLM1：上游引物5‘-GCACCCATAATACTGGGGTGTCTTC-3‘,下游引物5‘-CGCGCTCGCACAGCCTCTG--3‘；DLM2：上游引物:5‘-TAATTAATCTGTCCTGCGGTTGTGCCGG-3‘下游引物:5‘-CGGGATCCGAGCGCACGGCTCGGCAG-3‘；DLM2引物5‘端分別引入限制性內(nèi)切酶AseⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。先以基因組為模板，以DLM1為引物，退火℃進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物為2068bp；再以第一次PCR產(chǎn)物為模板，以DLM2為引物,退火66℃進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的片段為1135bp。PCR產(chǎn)物用%瓊脂糖凝膠(TAE緩沖液配制)電泳,并用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化［1］。

pEGFP-hTERTp重組質(zhì)粒的構(gòu)建用AseⅠ和BamHⅠ雙酶切帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收約1135bp的DNA條帶；用AseⅠ和BamHⅠ雙酶切pEGFP-N1質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物用%瓊脂糖凝膠電泳回收；上述兩種回收產(chǎn)物按質(zhì)量比為4∶1作連接反應(yīng)，采用LigationKitDNA連接試劑盒，16℃過夜。將連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于含50mg/L卡那青霉素的LB瓊脂板，倒置于37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)，次日挑單菌落，接種于10mL含50mg/L卡那青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取5mL菌液，用質(zhì)粒純化試劑盒制備少量質(zhì)粒，用AseⅠ和BamHⅠ雙酶切和PCR兩種方法鑒定，并取含pEGFP-hTERTp的菌液1mL送上海生工做DNA序列分析。

田力，等：人端粒酶啟動(dòng)子真核表達(dá)載體的構(gòu)建遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2008年12月，29(6)

2結(jié)果

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果以人類基因組為模板,PCR擴(kuò)增hTERTp，經(jīng)%瓊脂糖凝膠電泳，得到清晰的1135bp大小的DNA片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果吻合。M：Marker1：PCR產(chǎn)物

真核表達(dá)載體的鑒定PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物分別取5μL與6×LoadingBuffer1μL混勻上樣，進(jìn)行%瓊脂糖凝膠電泳。

PCR鑒定以pEGFP-hTERTp質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物預(yù)期產(chǎn)生1135bp條帶，而電泳結(jié)果與預(yù)期相符，見圖2。

酶切鑒定pEGFP-hTERTp經(jīng)AseⅠ和BamHⅠ雙酶切預(yù)期產(chǎn)生1135bp和3986bp兩條帶，見圖3，說明該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確。M：Marker1：質(zhì)粒PCR結(jié)果

測(cè)序鑒定構(gòu)建的hTERTp序列與hTERTp原始序列(AF098956)進(jìn)行比對(duì)，測(cè)序結(jié)果說明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3討論

GFP是從水母中分離出來的一種發(fā)光蛋白，它可在450～490nm的藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠光。而GFP作為一種基因表達(dá)的標(biāo)記物其優(yōu)點(diǎn)在于：攜帶GFP的融合蛋白既具有GFP的綠色熒光，又保持靶蛋白的生理功能，而且對(duì)細(xì)胞無毒性作用；將GFP融合基因轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中表達(dá)后，分析已知或未知基因表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的分布和定位。因此，GFP作為一種極具有潛力的標(biāo)記物為研究基因功能及表達(dá)調(diào)控提供了極大的便利。

端粒酶(telomerase)是一種RNA依賴的DNA多聚酶，其功能是以自身的RNA為模板，合成位于染色體末端的一段富含5′-TTAGGG-3′的特殊DNA序列,即端粒，補(bǔ)償細(xì)胞分裂過程中端粒的丟失，使細(xì)胞得以無限分裂。端粒酶激活是細(xì)胞獲得永生化和惡性變的重要機(jī)制。有研究顯示，端粒酶在85%以上的腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)陽性表達(dá)，而在幾乎所有的正常人體細(xì)胞中無活性。這一現(xiàn)象提示，hTERT基因表達(dá)的調(diào)控是端粒酶活性調(diào)控的中心環(huán)節(jié)，hTERTp在腫瘤細(xì)胞中的特異性轉(zhuǎn)錄使人們意識(shí)到hTERTp在腫瘤細(xì)胞中的激活也是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素。研究表明，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于hTERTcDNA首位核苷酸上游-19bp，在hTERTp區(qū)域沒有TATA盒和CAAT盒，但是包含轉(zhuǎn)錄起始元件CCTCTCC，因此，稱轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游180～208bp為核心啟動(dòng)子區(qū)，神經(jīng)酰胺能夠阻斷該核心區(qū)，而抑制hTERTp的功能［2］。但是，hTERTp具體哪一部分序列是啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的必需元件目前還在探索中。

近年來，一些學(xué)者在這方面作了一些探索。李帆等人通過PCR的方法獲得了335bp長(zhǎng)度的啟動(dòng)子，并證明它能夠啟動(dòng)LacZ基因的表達(dá)［3］。王艷等人通過人工合成的方法獲得了258bphTERTp，啟動(dòng)了黑色素瘤分化相關(guān)基因-7的表達(dá)［4］。采用PCR方法克隆了長(zhǎng)度為1135bp的hTERTp片段，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1135bp到起始密碼子之間，我們將克隆的hTERTp插入到綠色熒光蛋白GFP基因上游，PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果均證明重組質(zhì)粒pEGFP-hTERTp構(gòu)建成功。下一步我們將通過PCR的方法利用已經(jīng)構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pEGFP-hTERTp獲得250bp、500bp、800bp、1135bp等不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子再插入到綠色熒光蛋白GFP基因上游，觀察它們是否具有啟動(dòng)綠色熒光蛋白GFP基因表達(dá)的活性，確定hTERTp的具體啟動(dòng)必需序列的位置，從而為調(diào)控hTERTp在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)的研究奠定基礎(chǔ)。應(yīng)用hTERTp驅(qū)動(dòng)腫瘤相關(guān)因子凋亡或表達(dá)增強(qiáng)，可以獲得對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)明顯的抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用［5］，也為研究hTERTp功能和為臨床基因治療腫瘤提供了新的思路。

【參考文獻(xiàn)】

［1］SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社,1996:486-491.

［2］LeslieGWooten-Blanks,PengfeiSong,CanESenkal，etofceramide-mediatedrepressionofthehumantelomerasereversetranscriptasepromoterviadeacetylationofSp3byhistonedeacetylase1［J］.20