血液核酸檢測SoGAT回顧課件

SoGAT

基因擴增技術標準化工作組

StandardisationofGenomeAmplificationTechniques

http://www.nibsc.ac.uk/spotlight/sogat.aspx確定血液病毒核酸檢測標準化的需要；促進血液病毒核酸檢測國際標準品的建立；將標準品用于血液病毒核酸檢測的標準化。1SoGAT歷史1994年11月23日，歐洲血漿分離法協(xié)會(EPFA)與英國國家生物制品檢定所(NIBSC)在芬蘭聯(lián)合舉辦了一個研討會；1995年4月11日，第1屆SoGAT會議在英國舉行；血液病毒核酸檢測的標準化，例如HCV、HIV、HBV、B19；新檢測技術的不斷涌現(xiàn)，商業(yè)化檢測的蓬勃發(fā)展，決定使用參比物質對血液病毒檢測進行標準化。1999年10月29日，第10屆SoGAT會議在英國舉行；1999年7月1日，歐洲血站系統(tǒng)正式開展HCVNAAT2009年5月28日，第21屆SoGAT會議在比利時舉行；2011年4月14-15日，第22屆SoGAT會議將在羅馬舉行。2SoGAT機構設置3SoGAT主要工作制定國際標準品和參比試劑；研發(fā)新一代的參比物質；制定核酸量(gEq)、抗原量(IU)、感染性(copy)的相關系數(shù)；舉辦合作研究；進行學術交流。4血液核酸檢測10年SoGAT回顧血液篩查NAAT應用歷史與經(jīng)驗輸血風險評估方法的演變NAAT策略：MPvs.ID的技術與經(jīng)濟問題血液病毒核酸檢測的標準品血液病毒檢測系統(tǒng)及其評價體系5血液篩查NAAT應用歷史與經(jīng)驗德國應用NAAT的歷史與經(jīng)驗英國應用NAAT的歷史與經(jīng)驗日本應用NAAT的歷史與經(jīng)驗臺灣應用NAAT的爭議6德國應用NAAT的歷史與經(jīng)驗

BloodScreeningNAATinGermany背景介紹HCVNAATHIVNAAT小結MichaNüblingPaul-Ehrlich-Institute7背景介紹時間：1999-2007檢測量：450萬/年檢測機構德國紅十字會 7centers 75%醫(yī)院協(xié)會 75centers 20%私立機構 5centers 5%檢測策略1999-2004HCVmainly96Pools；2004-2007HCV/HIVmainly96PoolsHome-made試劑檢測靈敏度HCV 5000IU/ml(20000copies/ml)HIV 10000IU/ml(5000copies/ml) 8HCVNAAT1999-2007共檢測4080萬標本檢出92例HCVNAAT陽性標本檢出率：1/440萬76個檢測中心檢測到HCVNAAT陽性標本高檢出率中心#47 6/202435=1/33700#15 16/587000=1/36700#08 9/427000=1/47400低檢出率中心#30 4/4415033=1/1100000#52 6/6713709=1/1120000#23 0/903948=0/9039489IntroductionofNAATAmpliScreenHCV/24漏檢HCV輸血感染HCVNAAT陽性102004-10 上一次的獻血

antiHCV(Ortho3.0)陰性 HCV-RNA(AmpliScreen/24)陰性2005-01 重復獻血者: 血清轉換(anti-HCV,HCVRNA)

HCVgenotype2b

回溯

受血者

(紅細胞)

HCVRNA陽性 HCVgenotype2b 血漿進行IDNAAT Plasmareplicatetesting(n=5)inallavailable NAATsystems11HCV輸血傳播NAAT檢測系統(tǒng)95%LODIU/ml(WHOIS,Genotype1)IDNAAT陽性結果血篩NAATsCobasAmpliScreenHCVTestv2.0291/5CAPCobasTaqScreen115/5ProcleixHIV/HCVAssay20/5ProcleixUltrioAssay32/5臨床診斷NAATsCobasAmplicorHCVTestv2.0431/5HPSCobasTaqManHCVTest153/5CAPCobasAmplicorHCVTestv2.0113/5CAPCobasTaqManHCVTest133/5VersantHCVRNAQual100/5AbbottRealtimeHCV114/512HIVNAAT2004-20071900萬donations11個HIVNAAT陽性標本檢出率：1/170萬13HIV輸血傳播2007-01 上一次的獻血

antiHIV1/2陰性 HIV1RNA(CAPCTM/96)陰性2007-04 重復獻血者: 血清轉換(antiHIV1/2)

HIV1subtypeB

回溯

受血者(紅細胞)

HIV1血清轉換 HIV1subtypeB,variantasindonor

儲存的血漿

HIVAg/Abtest陰性(Abbott) 147IU/mlIDCAPCTM

142007-04 重復獻血者：NAAT2007-01

儲存的血漿

HIVAg/Abtest陰性(Abbott) 147IU/mlID(CAPCTMHIV)

作為原料血漿匯集：HIVRNA陰性HIVNAAT定性HIVNAAT定量CobasTaqScreenCobasAmpliScreenHIV(MP)ProcleixUltrioAbbottRealTimeHIV-1(IU/ml)CAMHIV(IU/ml)HPSCTMHIV

(IU/ml)CAPCTMHIV

(IU/ml)pospos(2/2)pos(5/5)924<LLQnegneg15ForwardprimerCAPCTMHIVTest (nt1788–nt1819)CTMPrimer:

5′AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA3′Donor:

5′AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA3′

ProbeCAPCTMHIVTest

(nt1821–nt1856)

CTMProbe:

5′TCTGCAGCTTCCTCATTGATGGT

A

TCTTTTAAC3′

Donor:

5′TCTGCAGCTTCCTCATTGATGGT

T

TCTTTTAAC3′ReverseprimerCAPCTMHIVTest

(nt1921–nt1950)CTMPrimer: 5′G

G

TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC3′

Donor:

5′G

T

TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTACC3′16小結德國現(xiàn)有的血液安全系統(tǒng)控制策略可以保證較高的血液安全性；低病毒載量標本和病毒核酸變異可能導致NAAT的漏檢，導致輸血感染事件；與其增加

NAAT分析敏感性，不如提高NAAT的對各基因型的敏感性；輸血零風險是一個高不可攀的理想，NAAT只能近一步降低殘余風險。17英國應用NAAT的歷史與經(jīng)驗

BloodScreeningNAATinEngland時期1998-20002000-2003核酸提取QiagenBiorobot+RNAextractionQiagenBiorobot+virusextraction核酸擴增與檢測RocheAmplicoreRocheAmpliscreen95%檢測限25IU/ml14IU/ml無效實驗率5%5%無效運行率13%3%3.5IU/mlcontrol檢出率35%45%殘余風險1in10,000,0001in50,000,00018時期1999.04.01-2001.06.302001.07.01-2003.03.31獻血者類型重復獻血者新獻血者重復獻血者新獻血者篩查實驗數(shù)5,117,292587,9613,938,618440,735TotalAnti-HCV(+)86(1/59503)320(1/1837)36(1/109406)202(1/2182)Anti-HCV(+)NAAT(-)(%)31(36%)75(37.1%)5(13.9%)34(16.8%)Anti-HCV(+)NAAT(+)(%)46(53.5%)223(69.7%)25(69.4%)165(81.7%)Anti-HCV(+)NAAT(未檢測)92263Anti-HCV(-)NAAT(+)2(1/2558646)1(1/587961)5(1/787724)0(0/440735)19小結血清學檢測與NAAT是不同層次的檢測；血清學檢測擴大排除潛在風險，陽性就有感染的可能；血清學檢測不能完全排除輸血風險，存在血清學窗口期；NAAT陰性未必不具有感染性；NAAT也有NAAT窗口期，能檢出的基因型和時間也有限，其作用是關閉一定的血清學窗口期。20小結制定核酸檢測策略時應該考慮疾病的感染率和流行率。感染率(IncidenceRate)是指一定時期內(nèi)疾病在風險人群中的新感染率；

Theincidencerateisthenumberofnewcasesperpopulationorunitofperson-timeatrisk.流行率(Prevalence)是指一定時期內(nèi)疾病患者的總數(shù)，包括已經(jīng)感染和新感染兩種情況；

Prevalenceisdefinedasthetotalnumberofcasesofthediseaseinthepopulationatagiventime.21日本應用NAAT的歷史與經(jīng)驗

BloodScreeningNAATinJapan1997年11月，將NAAT用于原料血漿篩查；1999年4月，將NAAT用于血站獻血者篩查，成為最早在全國范圍內(nèi)對血液進行HBV、HCV、HIV核酸檢測的國家；2002年，針對本國流行的基因型設計檢測引物并建立國家標準品；國際標準品國家標準品檢測限HCV(基因型)1.0x105(1)1.0x105(1b)74HBV(基因型)1.0x106(A)4.4x105(C)15HIV-1(基因型)1.0x105(B)1.4x105(B)134IU/mL2223血清學篩查陽性率HBsantigen0.1%HBcantibody0.4%HCVantibody0.1%HIV-1/2antibodies0.05%HTLV-1antibody0.1%ALT(GPT)2.0%Serologicaltestforsyphilis0.2%HumanparvovirusB190.01%24NAAT檢出率1999.7-2000.4(500Pool)HCVNAAT:9/2,560,977，1/28.4萬HIV-1NAAT:0/2,561,000HBVNAAT:26/2,560,977，1/9.8萬2000.2-2002.12(50Pool)HCVNAAT:46/16,012,175，1/34.8萬HIV-1NAAT:16,012,175，1/266.9萬HBVNAAT:308/16,012,175，1/5.2萬25IDNAAT對轉換前標本的檢出率HBV轉換數(shù)IDNAAT陽性數(shù)ID-NAAT陽性率MPNAAT8033.75%HBsAg12453.7％HBcAb3269331.0%Total3473411.16％26小結針對本國流行的基因型設計引物并建立國家標準品，選擇適合本國流行基因型的NAAT試劑；因地制宜開展集中化、自動化檢測；血清學檢測以及之前的措施可以排除大部分風險；核酸檢測仍就存在窗口期27臺灣應用NAAT的爭議2009年上半年，獻血者Anti-HIV陽性比率為4.88/10萬，比前年同期的激增近一倍，其中以學生群體比例最高，占兩成。臺灣消費者文教基金會痛批臺衛(wèi)生署“草菅人命”，23年來已有18人因輸血而感染艾滋，但衛(wèi)生署卻未采取適當措施。消基會呼吁：衛(wèi)生署應立即編列預算，使用更NAAT全面篩檢血液，避免悲劇重演。據(jù)臺灣血液基金會估計，臺灣現(xiàn)行使用血清學檢測，平均每年使一人因輸血而感染HIV，607人感染HCV和HBV，每年支付3.3億醫(yī)療費。28臺灣應用NAAT的爭議目前，臺灣是“亞洲四小龍”中唯一未全面采用

NAAT

的地區(qū)；近年來，NAAT在臺灣始終停留在試辦階段，由政府補助每年僅隨機篩檢10萬人次；2009年起，雖然血液基金會將投入5千萬，把篩檢人次提高到15萬，但臺灣每年有180萬人次捐血，兩者差距懸殊；衛(wèi)生署以輸血感染艾滋個案甚少，并且“不符合成本效益”為由，決定維持現(xiàn)行的血清學檢測；29臺灣應用NAAT的爭議衛(wèi)生署醫(yī)事處處長石崇良表示，“用NAAT篩檢一年要花5億，每年卻不到1人因輸血感染艾滋病，機率比中樂透還低，這5億與其用來做血液篩檢，不如分給感染者，可能還比較有意義”。血液基金會業(yè)務處處長林敏昌指出，“NAAT本來就不符合成本效益，各國還不是照做，因為健康與血液安全是無價的！”至少加拿大、美國、新加坡等國，NAAT檢驗費是由政府全部或部分支付；艾滋病感染者權益促進會秘書長林宜慧表示︰“應以一件都不能出錯的理想為目標，拿5億來改善臺灣血液安全算多嗎？”30小結血液安全Vs.成本效益輸血風險究竟來自哪里？血清學窗口期/血清學試劑不夠靈敏/血站管理問題血液安全系統(tǒng)策略是否完善？高危行為發(fā)生后尋求病毒檢測的心理會使處于感染窗口期的獻血者增加；團體獻血，個體易在同伴壓力下捐血，否則“會被別人認定是有問題”；獻血代替婚檢；獻血員篩選/問卷調(diào)查/自信排除殘余風險率Vs.成本效益率31輸血風險評估方法的演變回溯性研究時期(1970-1985)直接度量時期(1985-1990)模型評估時期(1991至今)32模型評估風險1991至今度量風險1985-1990回溯性研究1970-198533HCV輸血風險的直接度量80年代后期，F(xiàn)ACTS(FrequencyofAgentsCommunicatedbyTransfusionsStudy)利用庫存標本對HCV的輸血風險進行了直接度量。篩查之前，HCV輸血風險為1:2,000；ALT和HBcAb篩查，HCV輸血風險為1:5,000；Anti-HCV1.0篩查之后，HCV輸血風險為1:30,000；進行Anti-HCV2.0篩查之后，HCV輸血風險急劇下降，而不能直接度量了。34風險評估(IR-WP)模型90年代初，IR-WP模型被提出和初步完善；理論基礎：輸血安全最大威脅是處于感染窗口期的獻血者，其他因素(病毒變異、免疫靜默攜帶者、檢測錯誤)只占很小的一部分；通過獻血者感染率(IncidenceRate,IR)和窗口期(WindowPeriod,WP)相乘來評價殘余風險率(ResidualRisk,RR)，RR=IR×WP；殘余風險率可以理解為感染者在窗口期獻血的概率。35風險評估Busch模型2005年，MichaelBusch針對經(jīng)典模型的局限性進行改進，提出的風險評估的新策略——Busch模型。該模型仍然以IR-WP模型為基礎，利用新理論和新方法對感染率和窗口期進行闡述和推算。MichaelP.Busch美國血液系統(tǒng)研究所所長加利福尼亞大學教授36T-IT-IT-IT-IIT-IIT-IIT-IIIT-IIIT-IIIEIA3.037血清學殘余風險率計算血清學RR=IR×WPIR=MP-NAAT檢出數(shù)/(獻血次數(shù)×T-III)WP=T-I+T-II血清學RR=MP-NAAT檢出率×(T-I+T-II)/T-III38中國輸血風險的評估中國不適合采用模型評估的方法重復獻血率低；輸血感染事件發(fā)生率高；血清學檢測沒有達到堅實的質量水平，輸血風險沒有降低到殘余風險的程度；中國應該采用直接度量的方法計算輸血風險輸血風險率=輸血感染率39NAAT策略：MPvs.ID的技術

與經(jīng)濟問題MPvs.ID的技術問題窗口期殘余風險率檢出率MPvs.ID的經(jīng)濟問題成本工作量成本效益分析40MPvs.ID的技術問題HCVHIVHBVIDMPIDMPIDMP窗口期(天)4.917.415.619115-34240-502殘余風險率1in2,700,00011in1,800,00011in3,700,00011in2,300,00011in769,00031in526,0003檢出率Add1in6.7million4—Add1in5million4—1in125,00031in500,00031Busch,2005,Transfusion

45,254-2642Comanor,2006,Voxsanguinis

91,1-123Kleinman,2006,JClinVirol

36Suppl1,S23-294Stramer,2007,Archivesofpathology&laboratorymedicine

131,702-70741來自SusanL.Stramer的統(tǒng)計假陽性MPNAAT:0.001-0.0025%(1:40,000-1:100,000)IDNAAT:0.08-0.18%(1:555-1:2150)32-180X(80Xmean)每10萬次檢測會導致130donations的損失導致可觀的經(jīng)濟損失，珍貴標本無法挽回的損失MPNAAT的分辨過程使其比IDNAAT多進行一輪檢測42MPvs.ID

的經(jīng)濟問題成本:Pool=PoorIDNAAT比MPNAAT高3-5$/人份；工作量適當?shù)腜oolingsize可以減少檢測工作量，提高工作效率；成本效益分析(Cost-effectivenessanalysis)

43血液安全核酸篩查的成本效益分析血液安全核酸篩查的成本一方面來自篩查實驗的花費，另一方面來自篩查過程中由于假陽性結果造成的血液廢棄和獻血推遲等損失。標本采集、保存和運輸篩查實驗與驗證實驗延遲、淘汰與報廢血液安全核酸篩查的效益主要來自篩查所避免的輸血感染。經(jīng)濟層面：治療費用社會層面：生活質量的損失44生活質量改善指數(shù)

(Quality-adjustedLifeYears,QALY)QALY是用來評價醫(yī)療措施效果的指數(shù)，既包括生活的數(shù)量，也包括生活的質量。健康生活一年的QALY為1，死亡的QALY為0，殘疾或疾病狀態(tài)的QALY為0-1。生活質量損失指數(shù)

(Disability-adjustedLifeYear,DALY)DALY是用來衡量疾病危害的指數(shù)，由WHO首先提出，既包括失去生活的數(shù)量，也包括失去的生活質量。健康生活一年的DALY為0，死亡的DALY為1，殘疾和疾病狀態(tài)的DALY為0-1。45成本效益分析模型MarkovDecisionModelCost-effectivenessrate

=(CER)Costs–BenefitsQALYgained≈DALYDisability-adjustedLifeYear篩查方法確立篩查費用統(tǒng)計篩查成本確立疾病轉歸模型確立殘余風險率評估確定疾病轉換與死亡概率治療費用計算QALY計算46篩查方法確立基礎篩查:anti-HIV,anti-HCV,HBsAg,anti-HBc,HIVp24antigenNAATforHCVandHIVMP-NAATforHIVandHCVMP-NAATforHIVandHCVMP-NAATforHIVandHCVdeleteHIVp24antigenID-NAATforHIVandHCVID-NAATforHIVandHCVID-NAATforHIVandHCVdeleteHIVp24antigenNAATforHCV,HIVandHBVMP-NAATforHIV,HCVandHBVMP-NAATforHIV,HCVandHBVMP-NAATforHIV,HCVandHBVdeleteHIVp24antigenID-NAATforHIV,HCVandHBVID-NAATforHIV,HCVandHBVID-NAATforHIV,HCVandHBVdeleteHIVp24antigen*FromJackson,2003,Transfusion

43,721-72947篩查策略成本效益率成本效益率低于$50,000/QALY時的NAAT最高成本(美金/標本)MP-NAATforHIVandHCV$5.8million/QALY(4.7-7.0)$0.13ID-NAATforHIVandHCV$8.4million/QALY(7.6-9.2)$0.18MP-NAATforHIV,HCV,andHBV$7.6million/QALY(5.7-10.6)$0.13ID-NAATforHIV,HCV,andHBV$9.1million/QALY(7.8-11.2)$0.19MP-NAATforHIVandHCV;discontinueHIVp24$4.3million/QALY(2.7-5.8)$4.13ID-NAATforHIVandHCV;discontinueHIVp24$7.3million/QALY(6.2-8.4)$4.18MP-NAATforHIV,HCV,andHBV;discontinueHIVp24$6.1million/QALY(3.8-9.5)$4.13ID-NAATforHIV,HCV,andHBV;discontinueHIVp24andanti-HBc$7.3million/QALY(5.5-9.9)$7.19*FromJackson,2003,Transfusion

43,721-72948血液病毒核酸檢測的標準品三級標準品一級標準品國際標準品(InternationalStandards)國家標準品(NationalStandards)地方標準品(LocalStandards)廠級標準品二級標準品49一級標準品(國際標準品)

InternationalStandards,IS由WHO-NIBSC制備發(fā)放，通常以IU為單位，一般只發(fā)給各國政府指定的實驗室，供各國標定二級標準品；IS是已經(jīng)確定的均一、穩(wěn)定的物質，所含標志物以及雜志都已精確定量；指定實驗室有義務參加WHO組織的國際標準品協(xié)作標定研究(合作研究)，無償提供標定數(shù)據(jù)，且不得先于WHO發(fā)表載有相關數(shù)據(jù)的論文。50二級標準品(國家/地方標準品)

NationalStandards,NS/LocalStandards,LS由各國相應機構自行制備，根據(jù)國際標準品為其賦值；制備、標定三級標準品；校準試劑；系統(tǒng)能力評價(PerformanceEvaluation)；治療指南；51/FDA-CBERhttp://www.pei.dePaulEhrlichInstitute,Germanyhttp://www.iss.it/IstitutoSuperiorediSanita,ItalyEuropeanPharmacopoeiahttp://www.edqm.eu/52三級標準品(廠級標準品)由實驗室配制，相關標志物由參考方法或二級標準定值，主要用于檢測方法的標準化和校準試劑盒的“校準試劑”。http://www.bioQC53血液病毒核酸檢測系統(tǒng)的評價體系敏感性Sensitivity分析敏感性AnalyticalSensitivity臨床敏感性ClinicalSensitivity特異性Specificity魯棒性Robustness基因型敏感性GenotypeSensitivity統(tǒng)計學分析StatisticalAnalysis多中心性能評價

54敏感性Sensitivity分析敏感性(AnalyticalSensitivity)一級或二級標準品(StandardMaterials)統(tǒng)計學分析*計算得出95%檢測限(LOD)或50%檢測限(LOD)可以得出抗原量

(IU)與核酸量

(gEq)、

感染性

(copy)的換算系數(shù)臨床敏感性(ClinicalSensitivity)三級標準品——轉換血清盤(SeroconversationPanel)窗口期縮短(WindowPeriodReduction)大量臨床標本敏感性/特異性/無效實驗率*商業(yè)化檢測系統(tǒng)的說明書中應明確指出用來計算敏感性的統(tǒng)計學方法。55魯棒性Robustness魯棒性又稱穩(wěn)健性，是指一個系統(tǒng)或某項設計對外界不利因素(包括樣本性質、操作規(guī)程以及操作環(huán)境的改變)的承受能力。有效域值(GuardBand)分析無效實驗率(InviladTestRate)交叉污染分析(CrossContaminationAnalysis)棋盤交叉實驗56基因型敏感性

(GenotypeSensitivity)各流行基因型的一級或二級標準品HCV:1a,1b;2a,2b,2c;3a,3e;4a,4c,4d,4h; 5a;6aHIV-1:GrupoMsubtypeA,B,C,D,E,F,G,H; GroupO;HIV-2HBV:A,B,C,D,E,F,G57Performanceevaluationofcobass201Vs.

Tigris

2007.AABB*Forclinicalsensitivity,samplesweretestedindividuallyontheTigris(IDNAAT)orinpoolsof6onthes201(MPNAAT).FeatureCobass201TIGRIS檢測限(IU/mL)95%(50%)

HCV1