快速斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)診斷日本血吸蟲(chóng)病的初步研究

快速斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)診斷日本血吸蟲(chóng)病的初步研究【摘要】目的探討快速斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)診斷日本血吸蟲(chóng)病的實(shí)用價(jià)值，尋找適用于該實(shí)驗(yàn)的最佳診斷抗原。方法(1)分別制備日本血吸蟲(chóng)雌、雄成蟲(chóng)及蟲(chóng)卵粗抗原與組分抗原，并預(yù)制成抗原片。(2)采用FDIFA和常規(guī)ELISA法分別檢測(cè)血吸蟲(chóng)病患者血清33份，健康人血清32份，肝吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病及豬囊蟲(chóng)病患者血清各5份，比較了日本血吸蟲(chóng)雌、雄蟲(chóng)及蟲(chóng)卵抗原的敏感性和特異性。(3)以χ2檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析。結(jié)果日本血吸蟲(chóng)雌、雄成蟲(chóng)及蟲(chóng)卵的組分抗原用于FDIFA，其敏感性好于粗抗原，且特異性亦較好；同時(shí)，雄蟲(chóng)抗原好于雌蟲(chóng)抗原，蟲(chóng)卵抗原好于成蟲(chóng)抗原，但它們之間并差異無(wú)顯著性。結(jié)論日本血吸蟲(chóng)卵組分抗原用于FDIFA診斷日本血吸蟲(chóng)病，具有較好的敏感性和特異性；但抗原分離、純化方法及實(shí)驗(yàn)過(guò)程仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

【關(guān)鍵詞】日本血吸蟲(chóng)；快速斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)(FDIFA)；ELISA；組分抗原

【Abstract】ObjectiveToexplorediagnosticeffectofschistosomiasisjaponicumbyfast-dot-immunofiltrationassay(FDIFA)andlookforoptimalantigenstodiagnosethisTheroughandfractionalantigensofmaleandfemaleandeggofSchistosomajaponicumwereprepared.FDIFAandroutineELISAwereappliedtodetectingpatientserumsof33schistosomiasisand32healthycontrolsandotherparasitoses(15cases).ComparedthesensitivityandspecificityoftheseAllfractionalantigenshavegoodsensitivityandFractionalantigensofeggofSchistosomajaponicummaybeappliedtodiagnosisofwasagoodmethodfordiagnosisofschistosomiasis.

【Keywords】Schistosomajaponicum；FDIFA；ELISA；fractionalangtigens；ELISA

日本血吸蟲(chóng)病分布廣泛，危害嚴(yán)重。近年來(lái)由于受多種因素影響，我國(guó)江湖洲灘地區(qū)有螺面積時(shí)有增加，人群感染血吸蟲(chóng)人數(shù)明顯增多，疫情仍呈上升趨勢(shì)。傳統(tǒng)的病原學(xué)方法和常規(guī)免疫診斷技術(shù)在診斷病人、監(jiān)測(cè)疫情和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查方面難以適應(yīng)血防工作的需要。因此，研制簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉，便于在疫區(qū)推廣應(yīng)用、具有普查、臨床實(shí)驗(yàn)診斷和療效考核價(jià)值的檢測(cè)方法是當(dāng)前搞好血防工作的前提條件之一。

常規(guī)ELISA法自20世紀(jì)70年代開(kāi)始應(yīng)用于血吸蟲(chóng)病診斷，具有較好的敏感性和特異性。但因操作步驟多，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，且需要一定的設(shè)備，故較難在基層和現(xiàn)場(chǎng)推廣使用。為了提高ELISA檢測(cè)速度，更便于基層及現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查時(shí)使用，筆者根據(jù)ELISA的實(shí)驗(yàn)原理和本室在測(cè)姜片蟲(chóng)病時(shí)的免疫學(xué)方法［1］，稍加改進(jìn)，建立了快速斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)(Fast-dot-immunofiltrationassay，F(xiàn)DIFA)，應(yīng)用于血吸蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)診斷，并與常規(guī)ELISA法作比較，取得了初步效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

血清來(lái)源(1)33份血吸蟲(chóng)病患者血清均由湖南省血吸蟲(chóng)病防治研究所提供。(2)32份健康人血清采自本校2004年入學(xué)體檢的非疫區(qū)新生。(3)肝吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病及豬囊蟲(chóng)病患者血清各5份，均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生病預(yù)防控制所提供。所有血清均置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑

硝酸纖維素膜，為Schleicher&Schuell產(chǎn)品。

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的金黃色葡萄球菌A蛋白由美國(guó)進(jìn)口，工作濃度為1：10000。

四甲基聯(lián)苯胺為Sino-AmericanBiotechnologyCo產(chǎn)品，由上海華美生物工程公司供應(yīng)。臨用前1h配制：先將加入1ml二甲亞砜(DMS)液中溶解，然后加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，再加入25μl30%H2O2，混勻。

封閉液為含1%BSA的pHPBS-Tween20(TBS)緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

血吸蟲(chóng)抗原的制備

動(dòng)物模型的建立成年新西蘭家兔10只，以常規(guī)方法感染1000條日本血吸蟲(chóng)尾蚴，于感染后42天剖殺，采用門(mén)靜脈灌注法收集成蟲(chóng)。新鮮活蟲(chóng)立即用生理鹽水漂洗3次，然后分別收集雌、雄蟲(chóng)。采用朱明東等［2］改進(jìn)的蟲(chóng)卵分離新方法［2］，自兔肝獲得純凈日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵，并收集、分裝在潔凈離心管內(nèi)，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血吸蟲(chóng)雌、雄蟲(chóng)和蟲(chóng)卵粗抗原的制備取雌蟲(chóng)450條、雄蟲(chóng)320條、蟲(chóng)卵，分別置勻漿器內(nèi)勻漿15min；再置冰浴中超聲粉碎，頻率1500Hz，每次3min，間歇1min，共5次。然后置冰箱冷凍室，反復(fù)凍融3次；最后于4℃下離心1h，上清液即為粗抗原。經(jīng)UV-210紫外分光光度計(jì)280/260nm波長(zhǎng)測(cè)定，計(jì)算出各蛋白濃度分別為/ml、/ml、/ml，分裝置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

血吸蟲(chóng)組分抗原的制備取雌、雄蟲(chóng)和蟲(chóng)卵粗抗原各，分別沿管壁緩緩加入層析管，使纖維素與抗原物質(zhì)之間形成界面混勻狀態(tài)。待粗抗原滲入層析柱后，再用/LpH緩沖液不斷滴入層析管，進(jìn)行洗脫。層析管下端用華氏試管收集洗脫液，每管收集3ml，每種抗原各收集18管。測(cè)定3組各管內(nèi)洗脫液的OD值，分別得出3個(gè)峰值；各收集峰值前后OD值較高的2～3管洗脫液混合，即可獲得雌、雄蟲(chóng)和蟲(chóng)卵3種純化組分抗原。通過(guò)SDS和Westernblot分析，組分抗原含有粗抗原的主要免疫反應(yīng)成分，去除了多數(shù)與日本血吸蟲(chóng)免疫無(wú)關(guān)蛋白。經(jīng)島津UV-210紫外分光光度計(jì)280/260nm波長(zhǎng)測(cè)定，計(jì)算出各組分蛋白濃度分別為/ml、/ml和/ml，分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

快速斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)

稀釋抗原用mol/L碳酸鹽緩沖液分別稀釋3種抗原，其中雌、雄蟲(chóng)組分抗原稀釋至2μg/ml；蟲(chóng)卵組分抗原稀釋至μg/ml。

NC圓片制作用內(nèi)徑的打孔器將NC片切割成小圓片，在蒸餾水中浸泡1h，取出晾干。

抗原片制作用6個(gè)等大的大頭針柄分別蘸取6種稀釋抗原，印滴在硝NC正面的中央，點(diǎn)樣直徑為，晾干后備用。然后，將晾干的NC小圓片浸于封閉液中2h，晾干后即為抗原片。試驗(yàn)前，用細(xì)胞培養(yǎng)板作載體，將抗原片貼在該自制的FDIFA反應(yīng)板孔中的墊料上，孔內(nèi)墊料為吸水性強(qiáng)的紙質(zhì)。再用雙面膠將抗原片貼于中央帶有小圓孔的橡膠墊圈，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)板孔中墊料的上面，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用細(xì)滴管在抗原片上滴加TBS，每片3滴，逐一緩滴，置28～30℃1min。

按序號(hào)將1：10的稀釋血清50μl滴加在抗原片上，待干。

用細(xì)滴管在抗原片上滴加TBS，每片3滴，逐一緩滴，洗滌。

用移液器將1：10000酶標(biāo)結(jié)合物，每片50μl，待滲入。

用細(xì)滴管向抗原片上滴加TBS，每片3滴，逐一緩滴，洗滌。

用移液器在抗原片上滴加50滴底物溶液，待5min。若硝酸纖維素膜的中央出現(xiàn)灰藍(lán)色斑，即為陽(yáng)性；而無(wú)色或僅為極淡藍(lán)色斑，則為陰性。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

稀釋抗原用mol/L碳酸鹽緩沖液分別稀釋3種抗原，其中雌、雄蟲(chóng)組分抗原稀釋至2μg/ml；蟲(chóng)卵組分抗原稀釋至μg/ml。

包被酶標(biāo)反應(yīng)板用稀釋過(guò)的3種抗原各100μl分別包被酶標(biāo)反應(yīng)板，平放濕盒內(nèi)，置4℃下8h。

取出反應(yīng)板，棄去包被液，用含1%BSA的TBS100μl封閉，4℃下過(guò)夜。

棄去封閉液，用TBS洗滌液沖洗3遍，甩干。然后，于每孔加入1：100稀釋樣本血清，每孔100μl，并設(shè)陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，置37℃孵育1h。

棄去樣本液，用TBS沖洗3遍，拍干。加1：10000酶標(biāo)結(jié)合物，每孔100μl，置37℃孵育1h。

以上法沖洗、甩干后，加入現(xiàn)配制的底物，每孔100μl，置暗盒(密封)，室溫下15min。

目測(cè)結(jié)果若出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)則為陽(yáng)性。深藍(lán)色為+++，明顯藍(lán)色為++，淡藍(lán)色為+；無(wú)色或極淡藍(lán)色則為陰性。

機(jī)測(cè)結(jié)果每孔加50μl2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，用DG-3022酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定結(jié)果。樣本OD值≥陰性對(duì)照倍即判為陽(yáng)性。

2結(jié)果

6種抗原檢測(cè)的敏感性見(jiàn)表1、表2

表16種抗原用于FDIFA的敏感性比較*

注：*χ2測(cè)驗(yàn)結(jié)果：P＞，差異無(wú)顯著性表26種抗原用于常規(guī)ELISA檢測(cè)的敏感性比較*注：*χ2測(cè)驗(yàn)結(jié)果：僅雌蟲(chóng)組分抗原與粗抗原之間差異有顯著性

用FDIFA檢測(cè)血吸蟲(chóng)病人血清33份，雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、蟲(chóng)卵3種粗抗原檢測(cè)的陽(yáng)性符合率分別為91%、94%、94%；3種組分抗原檢測(cè)的陽(yáng)性符合率分別為94%、97%、100%。同時(shí)，用ELISA法檢測(cè)上述血清，結(jié)果3種粗抗原檢測(cè)的陽(yáng)性符合率分別為76%、94%、94%；3種組分抗原檢測(cè)的陽(yáng)性符合率分別為61%、97%、100%。表明FDIFA法略?xún)?yōu)于ELISA法。

6種抗原檢測(cè)的特異性

6種抗原用于FDIFA的特異性比較用6種抗原檢測(cè)32份正常人血清，結(jié)果除雌蟲(chóng)組分抗原試驗(yàn)組顯示3例(%)假陽(yáng)性外，其余5種抗原試驗(yàn)組均出現(xiàn)4例(%)假陽(yáng)性反應(yīng)。

6種抗原用于ELISA的特異性比較用6種抗原檢測(cè)32份正常人血清，結(jié)果均出現(xiàn)3例假陽(yáng)性反應(yīng)。

6種抗原檢測(cè)其他寄生蟲(chóng)病人血清采用FDIFA法和ELISA法分別用6種抗原檢測(cè)肝吸蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)及豬囊蟲(chóng)病人血清各5份，結(jié)果均出現(xiàn)1例交叉反應(yīng)，即特異性為80%。因例數(shù)太少，很難說(shuō)明問(wèn)題。

3討論

在血吸蟲(chóng)病防治工作中，尋找簡(jiǎn)易、快速、準(zhǔn)確，既具有療效考核價(jià)值，又能用于疫情監(jiān)測(cè)的免疫學(xué)診斷方法，是一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題。以往，在常規(guī)免疫學(xué)診斷中，多以粗抗原進(jìn)行試驗(yàn)，故特異性不盡如人意。據(jù)報(bào)道，有人對(duì)部分現(xiàn)有血吸蟲(chóng)病診斷試劑進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果都有不同程度的交叉反應(yīng)或假陽(yáng)性出現(xiàn)，尤其是與肝吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病、豬囊蟲(chóng)病之間的交叉反應(yīng)更甚，因而導(dǎo)致部分病例被誤診，耽擱了診斷和治療［3，4］。

本研究表明：FDIFA的敏感性略好于常規(guī)ELISA，雄蟲(chóng)抗原好于雌蟲(chóng)抗原；而蟲(chóng)卵組分抗原則是最好的抗原，此與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［5］。在用ELISA法檢測(cè)時(shí)，雌蟲(chóng)組分抗原的敏感性明顯低于粗抗原，二者之間差異有顯著性；在應(yīng)用雌蟲(chóng)粗抗原或組分抗原進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，F(xiàn)DIFA的敏感性則明顯好于ELISA法，二者之間亦差異有顯著性。

FDIFA與常規(guī)ELISA有相似的敏感性和特異性，不過(guò)卻大大簡(jiǎn)化了操作步驟。全部操作過(guò)程可在10min內(nèi)完成，且取材簡(jiǎn)便，成本低廉，無(wú)需特殊設(shè)備，其敏感性也有所提高，特別適合于基層和現(xiàn)場(chǎng)使用，具有較好的推廣價(jià)值和發(fā)展前景。至于在用該法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，與其他寄生蟲(chóng)病之間存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象，其特異性略遜于ELISA法，既表明本法更為敏感，亦提示在其實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)上亟待改進(jìn)；同時(shí)，抗原分離、純化方法和實(shí)驗(yàn)過(guò)程亦有待進(jìn)一步優(yōu)化。然而，按敏感性≮90%、特異性≮80%；Yauden指數(shù)≥即符合免疫診斷要求的一般規(guī)定，F(xiàn)DIFA法仍不失為一較好的免疫學(xué)診斷方法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】

1仇錦波，邵英遠(yuǎn)，傅行禮，等.斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)診斷姜片蟲(chóng)病的研究.臨床檢驗(yàn)雜志，19