木質(zhì)素降解研究樣本

資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考，如有不當(dāng)或者侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系改正或者刪除。本科畢業(yè)論文木質(zhì)素降解的研究LIGINIDEGRADATIONOFRESEARCH學(xué)院(部):化學(xué)工程學(xué)院專業(yè)班級(jí):學(xué)生姓名:指導(dǎo)教師:年3月26日木質(zhì)素降解的研究摘要評(píng)述了木質(zhì)生物降解的最新研究進(jìn)展,主要包括木質(zhì)素的生物降解機(jī)制、降解木質(zhì)素的微生物種類及其產(chǎn)生的相關(guān)酶類、微生物的代謝調(diào)控和分子生物學(xué)。此外,對(duì)木質(zhì)素降解生物的實(shí)際應(yīng)用和應(yīng)用前景也進(jìn)行了評(píng)論。關(guān)鍵詞:木質(zhì)素;生物降解;秸桿;白腐真菌;環(huán)境保護(hù)LIGINIDEGRADATIONOFRESEARCHABSTRACTThequalityofthewoodthatthesolutionoftheborndownnewgrindinvestigateintotheexhibition,TheLordwillincludingwoodgrainlifequalitythatmachinesystem,dropdownsolutionofgrainofwoodsolutionmicroscopicthingskindofclassanditsproductionwasbornofenzymeinclose,microscopiccontentofthegenerationxthecontrolandpointsthesonborntolearnthings.Theoutside,towoodqualitygraindropsolutionwhichshallbebornofborderwithandshouldbebeforeusingthescenealsointothelineevaluationtheory.KEYWORDS:woodqualitativeelement;Borncontentdropsolution;Strawpole;White-rotfungusreally;Theenvironmentthecare目錄摘要 -2-緒論 -1-1．簡(jiǎn)介 -2-1.1基本概念 -2-1.2單體與結(jié)構(gòu) -3-1.3發(fā)展前景 -3-2.木質(zhì)素的降解簡(jiǎn)略 -4-2.1概況 -4-2.2木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) -4-3.木質(zhì)素降解微生物的種類 -5-3.1三種重要木質(zhì)素降解酶 -5-I．木質(zhì)素過氧化物酶(LiP) -5-II．錳過氧化物酶(MnP) -7-III．漆酶 -9-3.2三種木質(zhì)素降解酶協(xié)同作用 -10-4應(yīng)用全景 -10-4.1木質(zhì)素降解酶的全景 -10-4.2木質(zhì)素降解酶的特性 -12-4.3木質(zhì)素的降解微生物的酶活性調(diào)控機(jī)理 -13-4.4木質(zhì)素的生物降解的應(yīng)用 -16-結(jié)論 -17-參考文獻(xiàn) -18-謝辭 2緒論木質(zhì)素資源十分豐富,是植物光合作用制造的總量?jī)H次于纖維素的有機(jī)化合物,估計(jì)全球的木質(zhì)素年產(chǎn)量可達(dá)1500億t。然而,木質(zhì)素資源并沒有得到有效的利用,大量的木質(zhì)素作為造紙工業(yè)的副產(chǎn)物而排放,不但是資源的一大浪費(fèi),而且嚴(yán)重污染環(huán)境。采用物理和化學(xué)處理法,可減少約50%的木質(zhì)素排放,但治理成本高,易造成二次污染。利用生物技術(shù)降解木質(zhì)素,能夠減少環(huán)境污染,變廢為寶,實(shí)現(xiàn)資源再利用。因此,認(rèn)識(shí)木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和了解其生物降解的研究進(jìn)展,對(duì)于木質(zhì)素資源的合理化利用將具有一定的指導(dǎo)意義。1．簡(jiǎn)介1.1基本概念木質(zhì)素(lignin)是由四種醇單體(對(duì)香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇)形成的一種復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一,具有使細(xì)胞相連的作用。在植物組織中具有增強(qiáng)細(xì)胞壁及黏合纖維的作用。其組成與性質(zhì)比較復(fù)雜,并具有極強(qiáng)的活性。不能被動(dòng)物所消化,在土壤中能轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)。如果簡(jiǎn)單定義木質(zhì)素的話,能夠認(rèn)為木質(zhì)素是對(duì)羥基肉桂醇類的酶脫氫聚合物。它含有一定量的甲氧基,并有某些特性反應(yīng)。木質(zhì)素是由聚合的芳香醇構(gòu)成的一類物質(zhì),存在于木質(zhì)組織中,主要作用是經(jīng)過形成交織網(wǎng)來硬化細(xì)胞壁。木質(zhì)素主要位于纖維素纖維之間,起抗壓作用。在木本植物中,木質(zhì)素占25%,是世界上第二位最豐富的有機(jī)物(纖維素是第一位)。1.2單體與結(jié)構(gòu)\o"查看圖片"

木質(zhì)素單體的分子結(jié)構(gòu)木質(zhì)素是由四種醇單體(對(duì)香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇)形成的一種復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一,具有使細(xì)胞相連的作用。木質(zhì)素是一種含許多負(fù)電集團(tuán)的多環(huán)高分子有機(jī)物,對(duì)土壤中的高價(jià)金屬離子有較強(qiáng)的親和力。因單體不同,可將木質(zhì)素分為3種類型:由紫丁香基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的紫丁香基木質(zhì)素(syringyllignin,S-木質(zhì)素),由愈創(chuàng)木基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(guajacyllignin,G-木質(zhì)素)和由對(duì)-羥基苯基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的對(duì)-羥基苯基木質(zhì)素(hydroxy-phenyllignin,H-木質(zhì)素);裸子植物主要為愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G),雙子葉植物主要含愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質(zhì)素(G-S),單子葉植物則為愈創(chuàng)木基-紫丁香基-對(duì)-羥基苯基木質(zhì)素(G-S-H)。從植物學(xué)觀點(diǎn)出發(fā),木質(zhì)素就是包圍于管胞、導(dǎo)管及木纖維等纖維束細(xì)胞及厚壁細(xì)胞外的物質(zhì),并使這些細(xì)胞具有特定顯色反應(yīng)(加間苯三酚溶液一滴,待片刻,再加鹽酸一滴,即顯紅色)的物質(zhì);從化學(xué)觀點(diǎn)來看,木質(zhì)素是由高度取代的苯基丙烷單元隨機(jī)聚合而成的高分子,它與纖維素、半纖維素一起,形成植物骨架的主要成分,在數(shù)量上僅次于纖維素。木質(zhì)素填充于纖維素構(gòu)架中增強(qiáng)植物體的機(jī)械強(qiáng)度,利于輸導(dǎo)組織的水分運(yùn)輸和抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。木質(zhì)素在木材等硬組織中含量較多,蔬菜中則很少見含有。一般存在于豆類、麥麩、可可、巧克力、草莓及山莓的種子部分之中。其最重要的作用就是吸附膽汁的主要成分膽汁酸,并將其排除體外。1.3發(fā)展前景隨著人類對(duì)環(huán)境污染和資源危機(jī)等問題的認(rèn)識(shí)不斷深入,天然高分子所具有的可再生、可降解等性質(zhì)日益受到重視。廢棄物的資源化與可再生資源的利用,是當(dāng)代經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展的重大課題,也是對(duì)當(dāng)代科學(xué)技術(shù)提出的新要求。在自然界中,木質(zhì)素的儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素,而且每年都以500億噸的速度再生。制漿造紙工業(yè)每年要從植物中分離出大約1.4億噸纖維素,同時(shí)得到5000萬噸左右的木質(zhì)素副產(chǎn)品,但迄今為止,超過95%的木質(zhì)素仍以”黑液”直接排入江河或濃縮后燒掉,很少得到有效利用?；茉吹娜找婵萁?、木質(zhì)素的豐富儲(chǔ)量、木質(zhì)素科學(xué)的飛速發(fā)展決定木質(zhì)素的經(jīng)濟(jì)效益的可持續(xù)發(fā)展性。木質(zhì)素成本較低,木質(zhì)素及其衍生物具有多種功能性,可作為分散劑、吸附劑/解吸劑、石油回收助劑、瀝青乳化劑,木質(zhì)素對(duì)人類可持續(xù)發(fā)展最為重大貢獻(xiàn)就在于提供穩(wěn)定、持續(xù)的有機(jī)物質(zhì)來源,其應(yīng)用前景十分廣闊。研究木質(zhì)素性能和結(jié)構(gòu)的關(guān)系,利用木質(zhì)素制造可降解、可再生的聚合物。木質(zhì)素的物化性能和加工性能、工藝成為當(dāng)前木質(zhì)素研究的障礙。2.木質(zhì)素的降解簡(jiǎn)略2.1概況2.2木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)木質(zhì)素是由苯丙烷單元通過醚鍵和碳碳鍵聯(lián)接的復(fù)雜的無定形高聚物,,難以被酸水解,是天然高聚物中最難搞清楚的一個(gè)領(lǐng)域’其原因有兩個(gè)方面,一是木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)單元之間除醚鍵聯(lián)接外還有C—C鍵;另一方面是不可能把整個(gè)木質(zhì)素分子以其完整狀態(tài)分離出來。典型木質(zhì)素是由松柏醇(Coniferyalcohol),芥子醇(Sinapylalcohol)和對(duì)—香豆醇(p-Coumarylalcohol))這3種不同的醇作為先體結(jié)構(gòu)物質(zhì)組成基本的結(jié)構(gòu)單元,這些木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元常常以它們的糖苷形式貯存在細(xì)胞中,一旦需要合成木質(zhì)素,它們便從這些糖苷中釋放出來’這些木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元之間主要是通過醚鍵和碳碳鍵的方式聯(lián)接%醚鍵包括酚醚鍵、烷醚鍵和二芳醚鍵。在酚醚鍵中愈創(chuàng)木基-甘油-β-芳基醚鍵(β-0-4)數(shù)量最多,占酚醚鍵的1/2左右,其次是愈創(chuàng)木基-甘油-α-芳基醚鍵(β-0-4)。而木質(zhì)素的C-C鍵的連接類型主要有β-5,β-β,β-1,β-2和5-5.3.木質(zhì)素降解微生物的種類3.1三種重要木質(zhì)素降解酶木質(zhì)素是造紙工業(yè)排放黑液COD和色度形成的主要原因,其結(jié)構(gòu)是由甲氧基取代的對(duì)-羥基肉桂酸聚合而成的異質(zhì)多晶三維多聚體,分子間多為穩(wěn)定的醚鍵、C-C鍵,是當(dāng)前公認(rèn)的微生物難降解芳香化合物之一。自1934年Boruff和Buswell首次發(fā)現(xiàn)能降解木質(zhì)素的微生物種群,人們對(duì)木質(zhì)素的生物降解進(jìn)行了大量研究,1983年和1984年發(fā)現(xiàn)了木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶(MnP),由日本吉田首次在生漆中發(fā)現(xiàn)的漆酶(Laccase),也始終引起著人們的關(guān)注。這三種酶被公認(rèn)為是木質(zhì)素重要的降解酶。=1\*ROMANI.木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)=1.1\*ROMANI.=1.1\*ROMANI分布及種類LiP是第一個(gè)從黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素降解酶,在木質(zhì)素降解中起關(guān)鍵性作用。LiP的產(chǎn)生菌在自然界分布相當(dāng)廣泛,許多腐朽木材的白腐菌、褐腐菌都能夠產(chǎn)生LiP,主要產(chǎn)生菌見表1=1.1\*ROMANI.=2\*ROMANII結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)LiP代表一系列含F(xiàn)e3+、卟啉環(huán)(IX)和血紅素附基的同工酶,由不同微生物產(chǎn)生的酶的種類和理化性質(zhì)各不相同。LiP是一種帶有糖基的胞外血紅蛋白,晶體結(jié)構(gòu)已有報(bào)道,確定血紅素(heme)埋在蛋白質(zhì)內(nèi),可連接至少一個(gè)VA。木質(zhì)素大分子不能接近該酶的活性中心,其結(jié)合位點(diǎn)是一段有序的糖殘基,位于接近活性中心通道表面的裂縫中。光譜學(xué)研究表明LiP有五種氧化狀態(tài),自然狀態(tài)LiP含有高自旋Fe3+,被H2O2氧化兩個(gè)電子后形成LiP=1\*ROMANI(氧帶鐵卟啉環(huán)自由基含+Fe4+),LiP=1\*ROMANI經(jīng)單電子還原形成LiP=2\*ROMANII(氧帶鐵卟啉環(huán)含F(xiàn)e4+),再經(jīng)一次單電子還原,回到自然狀態(tài),His82在活性中心通道表面的裂縫的開口處,Trp170在酶蛋白表面,其電子傳遞可能有兩個(gè)不同的途徑:底物-His82-Ala83-Asn84-His47-Heme或底物-Trp170-Leu171-Heme。LiP的特點(diǎn)是能氧化富含電子的酚型或非酚型芳香化合物,在經(jīng)過電子傳遞體攻擊木質(zhì)素時(shí),它能從苯酚或非酚類的苯環(huán)上奪取一個(gè)電子,將其氧化成自由基,繼而以鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生許多不同的自由基,導(dǎo)致木質(zhì)素分子中主要鍵斷裂。此過程需要H2O2的驅(qū)動(dòng),反應(yīng)如下:LiP+H2O2→LiP=1\*ROMANI+H2OLiP=1\*ROMANI+SH2→SH+LiP=2\*ROMANIILiP=2\*ROMANII+SH2→SH+LiP2SH·+2木質(zhì)素→2木質(zhì)素自由基+2SH2其中,SH2為專一電子傳遞體。H2O2可由白腐菌胞內(nèi)H2O2產(chǎn)生酶系產(chǎn)生,且其胞內(nèi)還存在過氧化物水解酶,保證其不會(huì)受到毒害。=1.1\*ROMANI.=3\*ROMANIII作用機(jī)制木質(zhì)素分子間主要鍵型是β-O-4,β-O-4模式復(fù)合物中有A,B兩個(gè)苯環(huán),均可被LiP氧化。LiP催化β-O-4模型物的主要反應(yīng)是Cα-Cβ斷裂形成VA和2-甲氧基苯酚。另一個(gè)重要的分支反應(yīng)是Cα-氧化產(chǎn)物的形成,結(jié)果表明:Cα-氧化產(chǎn)物是酚型Cα-氧合芳香化合物時(shí),可由漆酶催化,酚氧化酶介導(dǎo)的氧化反應(yīng)降解;當(dāng)Cα-氧化產(chǎn)物是非酚型Cα-氧合芳香化合物時(shí),由于其非各種氧化酶的底物,氧化降解非常困難。VA是LiP的誘導(dǎo)劑,還能夠保護(hù)LiP不受H2O2的損害。對(duì)VA的氧化當(dāng)前認(rèn)為主要是由LiP催化,過氧化氫離子和H2O同時(shí)參與芳香環(huán)的開裂。開環(huán)產(chǎn)物可被進(jìn)一步代謝CO2。整個(gè)反應(yīng)中生成的甲氧基酚衍生物,由LiP和漆酶共同氧化,形成醌,在纖維二糖/醌還原酶系、芳香環(huán)開裂酶系的協(xié)同作用下,生成酚,最后形成環(huán)開裂產(chǎn)物,進(jìn)入Kerb循環(huán),或者纖維二糖酸內(nèi)脂的形式進(jìn)入磷酸戊糖途徑,最終代謝為CO2。而非酚型的芳香醛酸,由于其氧化還原電位太高,需先被芳香醛酸還原酶還原成相應(yīng)的醇,然后才能被LiP氧化成開環(huán)產(chǎn)物或醌。在木質(zhì)素的模式復(fù)合物中,已被深入研究的還有β-1型,LiP氧化其它鍵型如β-5、β-O-4模式復(fù)合物,產(chǎn)物尚未被證實(shí)。=1.1\*ROMANI.=4\*ROMANIV基因結(jié)構(gòu)及表示在分子生物學(xué)領(lǐng)域,研究較多的是P.chrysosporium、Trametesversicolor、Bjerkanderaadusta等。在P.chrysosporium中已經(jīng)克隆出至少7個(gè)相近的LiP基因家族,定名為L(zhǎng)iPA-LiPJ,同源性很高。核型分析表明,異源真核菌株約含10個(gè)染色體,而LiP基因至少被分布在兩個(gè)染色體上。LiP序列排列緊密且高度保守,氨基酸相似性53%~98%,每個(gè)LiP基因編碼一個(gè)由343~345個(gè)氨基酸組成的成熟蛋白質(zhì),分子量約36360~36607Da。N端有一個(gè)21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽,且有6或7個(gè)氨基酸的前體肽。已測(cè)序的LiP基因均含有8或9個(gè)內(nèi)含子,大小49~78bp,5'端非編碼區(qū)包含一個(gè)TATA框(-66~-81bp)和一個(gè)CAAT框(-107~-228bp)的調(diào)節(jié)序列。在基因表示方面,其轉(zhuǎn)錄明顯受到C,N水平的影響,LiP的同工酶種類和數(shù)目隨培養(yǎng)條件變化而改變,至少有五種:H1、H2、H6、H8、H10。其分子量大小、等電點(diǎn)、光譜特性、穩(wěn)定性均有差別,N端氨基酸序列也不相同。非限制性N源條件下,H8是主要的同工酶,其cDNA序列被命名為ML-1,H2的表示也稍占優(yōu)勢(shì),但H6的表示較限制性N源條件下大大下降。在異源表示上,已得到許多重組LiP,但重組LiP的功能有所改變,如催化能力改變,不再受Mn2+抑制等。=2\*ROMANII錳過氧化物酶(MnP)=2\*ROMANII.=1\*ROMANI分布及種類MnP與LiP一樣,都是代表一系列帶有糖基的胞外過氧化物酶,因二者都含有血紅素,又稱血紅素過氧化物酶。MnP的主要產(chǎn)生菌見表2,主要是一些白腐真菌,多屬擔(dān)子菌亞門,無隔擔(dān)子菌亞綱,無褶菌目的多孔菌科。=2\*ROMANII.=2\*ROMANII結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)MnP的晶體結(jié)構(gòu)中包括17%的中性糖類和大量酸性氨基酸,血紅素上僅有一個(gè)Mn2+的結(jié)合位點(diǎn),MnP能將其氧化,消耗一分子的H2O2,產(chǎn)生兩分子的Mn3+。Mn3+從MnP上脫離后,如果沒有合適的螯合物與其結(jié)合,保證其穩(wěn)定性,其能夠在溶液中發(fā)生反應(yīng),生成MnO2。在木質(zhì)素降解過程中,MnO2可保護(hù)LiP免受H2O2的損傷。而在LiP-MnP組合酶體系中,高濃度的Mn2+或Mn3+,加上合適的螯合物,會(huì)導(dǎo)致LiP的抑制,MnP的誘導(dǎo)?？梢?Mn對(duì)LiP和MnP都具有重要的作用,且作用大小與猛離子的濃度及添加時(shí)間有關(guān)。MnP的特點(diǎn)是只能氧化酚型木質(zhì)素。氧化苯酚的過程中,MnP和H2O2的啟動(dòng)下,氧化Mn2+為Mn3+,然后,Mn3+氧化苯酚生成苯氧殘基。這與LiP氧化苯酚的方式有明顯不同。=2\*ROMANII.=3\*ROMANIII作用機(jī)制MnP降解木質(zhì)素的作用機(jī)制尚不清晰,當(dāng)前認(rèn)為是一個(gè)循環(huán)催化過程見圖1,AH代表酚型底物。隨著研究的逐漸深入,它在木質(zhì)素降解過程中的作用越來越受到重視。=2\*ROMANII.=4\*ROMANIV基因結(jié)構(gòu)及表示從P.chrysosporium的胞外液中分離出至少六種MnP的同工酶,均由多基因編碼。經(jīng)過全部RNA的反轉(zhuǎn)錄PCR,能得到MnP的三個(gè)不同基因的mRNA:MnP1、MnP2、MnP3。靜置培養(yǎng)條件下,MnP2是主要的MnP表示基因,而攪拌培養(yǎng)時(shí),MnP1是主要的表示基因,MnP3的表示較穩(wěn)定。MnP基因有6或7個(gè)內(nèi)含子,N端有21或24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽,但無前體肽?；钚晕稽c(diǎn)附近的序列非常保守,MnP的5非編碼區(qū)包括1個(gè)TATAA單元(-81bp)及3個(gè)反向的CCAAT單元。啟動(dòng)區(qū)包括大量熱休克元件和序列,這些元件與哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白基因中的金屬調(diào)節(jié)元件相同[4~5]。在基因表示方面,MnP的產(chǎn)生明顯依賴Mn2+濃度、培養(yǎng)基、熱休克、C和N源變化,且調(diào)節(jié)是在轉(zhuǎn)錄水平上。菌株P(guān).chrysosporiumOGC101MnP1編碼一個(gè)357個(gè)氨基酸的成熟蛋白,內(nèi)含子6個(gè),大小57~72bp。=3\*ROMANIII漆酶=3\*ROMANIII.=1\*ROMANI分布及種類1883年漆酶被首次發(fā)現(xiàn),一百多年來,人們經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛存在于多種植物和菌類的分泌物中。在真菌中,漆酶大多分布在擔(dān)子菌(Basidimycetes)、多孔菌(Polyporus)、柄孢殼菌(Podospora)等中。另外,一些動(dòng)物腎臟和血清中也發(fā)現(xiàn)了漆酶,近來,人們發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌也能產(chǎn)生漆酶[6],如生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)。漆酶的主要高產(chǎn)白腐真菌王佳玲等曾作過統(tǒng)計(jì)。=3\*ROMANIII.=2\*ROMANII結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)漆酶的分子量在64~390kD之間,除Podosporaanserina產(chǎn)生的一種漆酶是四聚體外,其它漆酶一般是單一多肽,由約500個(gè)氨基酸組成。不同種類的漆酶含銅數(shù)并不相同。一般含有四個(gè)銅離子,根據(jù)光譜和磁性特征可分為三類:=1\*ROMANI型Cu2+一個(gè),單電子受體,順磁性,藍(lán)色,λ614nm處有特征吸收蜂;=2\*ROMANII型Cu2+一個(gè),單電子受體,順磁性,非藍(lán)色,無特征,吸收光譜;=3\*ROMANIII型Cu24+兩個(gè),雙電子受體,反磁性,是偶合的離子對(duì)(Cu2+-Cu2+),λ330nm處有寬的吸收帶。漆酶的三維結(jié)構(gòu)尚不清晰,但證實(shí)銅離子位于酶的活性部位,在催化氧化過程中起決定性作用。漆酶是單電子氧化還原酶,據(jù)統(tǒng)計(jì)它催化氧化的底物達(dá)250多個(gè),最重要的是酚及其衍生物,約占其底物總數(shù)的一半。另外漆酶還能催化芳胺、羧酸及其衍生物,甾體激素和其它非酚類底物,如抗壞血酸等。=3\*ROMANIII.=3\*ROMANIII作用機(jī)制漆酶是一類以O(shè)2為電子受體的蛋白酶,對(duì)其作用機(jī)理,當(dāng)前研究較透徹的是其催化多酚化物如氫醌,此過程須經(jīng)過四次單電子傳遞。首先,底物氫醌向漆酶轉(zhuǎn)移一個(gè)電子,生成半醌-氧自由基中間體。而后,兩分子半醌生成一分子氫醌和一分子苯醌,氧自由基中間體還能轉(zhuǎn)變成碳自由基中間體,它們能夠相互結(jié)合或相互偶連,故在菌體內(nèi),漆酶與其它氧化木質(zhì)素酶系協(xié)同降解木質(zhì)素。而在體外實(shí)驗(yàn)中,木質(zhì)素單體在Laccase/O2條件下會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)。O2存在條件下,還原態(tài)漆酶被氧化,O2被還原成水,此過程是經(jīng)過四個(gè)銅離子協(xié)同傳遞電子和價(jià)態(tài)變化來實(shí)現(xiàn)的:Cu2+Cu2+Cu24+→2e底物→Cu+Cu+Cu24+→分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移→Cu2+Cu2+Cu22+→2e底物→Cu+Cu+Cu2+→2H+O2H2O快→Cu2+Cu2+(Cu2O)3+→2H+H2O慢→Cu2+Cu2+Cu24+=3\*ROMANIII.=4\*ROMANIV基因結(jié)構(gòu)及表示漆酶是由一個(gè)結(jié)構(gòu)相近的基因家族編碼,許多真菌的漆酶基因已被克隆和測(cè)序,如Agaricusbisporus、Neurosporacrassa。從Coprinuscinerens中克隆出3個(gè)漆酶基因Lcc1、Lcc2和Lcc3。其中Lcc1含7個(gè)內(nèi)含子,大小為54~70bp,成熟蛋白約521個(gè)氨基酸,有三個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn),C端有23個(gè)氨基酸的延伸序列,富含Arg和Lys,其酶蛋白成熟至少需剔除信號(hào)肽、前體肽和C端延伸區(qū)。Lcc2和Lcc3均有13個(gè)內(nèi)含子,表示出的成熟蛋白氨基酸同源性80%。Lcc3和Lcc1的氨基酸同源性58%,Lcc2和Lcc1的氨基酸同源性59%,而Lcc3與Aspergillusnidulan漆酶的氨基酸同源性只有18%。因此,異源真菌漆酶之間的氨基酸同源性較低,但在銅結(jié)合區(qū)具有較高保守性。在異源表示上,曲霉是一個(gè)很好選擇,A.oryazeTATAamylase和Pichiapasti系統(tǒng)已成功表示若干不同來源的漆酶,Lcc1在米曲霉中表示成功,90%以上的轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出漆酶活性,當(dāng)前,已有許多漆酶基因在酵母菌等真核生物中表示。3.2三種木質(zhì)素降解酶協(xié)同作用對(duì)上述三種酶的研究主要集中在液體培養(yǎng)方式上,結(jié)果顯示采用靜置培養(yǎng),深層培養(yǎng)利于酶的產(chǎn)生。已證明,木質(zhì)素降解酶活性受C源、N源、微量元素、誘導(dǎo)物、培養(yǎng)溫度和pH值等因素影響。而P.cinnabarinus的漆酶產(chǎn)量卻不受一些小分子芳香化合物的誘導(dǎo)。確定單一一種酶在木質(zhì)素降解中的功能非常困難,因?yàn)槊恳环N白腐菌所產(chǎn)生的都不是一種木質(zhì)素降解酶,如Laccase和MnP單獨(dú)存在都不能很好的降解木質(zhì)素,而兩種酶同時(shí)存在時(shí),木質(zhì)素卻能得到很好降解,表明兩種酶具有協(xié)同作用。有趣的是當(dāng)體系中一些條件變化時(shí),體系中的兩種或幾種木質(zhì)素降解酶會(huì)發(fā)生相互抑制現(xiàn)象,如液體培養(yǎng)條件下,Mn2+濃度增加會(huì)導(dǎo)致LiP活力大大降低,而MnP和Laccase的活力卻相應(yīng)增加,這啟示我們這種協(xié)同作用可能存在正負(fù)兩種機(jī)制。不同白腐菌木質(zhì)素降解酶系的組成大不相同,可分為四類:LiP-MnP,如P.chrysosporium;LiP_MnP_Laccase,如Trametesgibbosa;MnP_Laccase,如Lentinulaedodes;LiP_Laccase,如Pleurotusostreatus。最新研究表明,不同降解酶系成分之間的比例將直接影響木質(zhì)素降解效果。各種酶系具體如何分工協(xié)作降解木質(zhì)素,尚不清楚,將是今后研究的一個(gè)熱點(diǎn)。4應(yīng)用全景4.1木質(zhì)素降解酶的全景在自然界中,能降解木質(zhì)素并產(chǎn)生相應(yīng)酶類的生物只占少數(shù)。木質(zhì)素的完全降解是真菌、細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果,其中真菌起著主要作用。降解木質(zhì)素的真菌根據(jù)腐朽類型分為:白腐菌———使木材呈白色腐朽的真菌;褐腐菌———使木材呈褐色腐朽的真菌和軟腐菌。前兩者屬擔(dān)子菌綱,軟腐菌屬半知菌類。白腐菌降解木質(zhì)素的能力尤于其降解纖維素的能力,這類菌首先使木材中的木質(zhì)素發(fā)生降解而不產(chǎn)生色素。而后兩者降解木質(zhì)素的能力弱于其降解纖維素的能力,它們首先開始纖維素的降解并分泌黃褐色的色素使木材黃褐變,而后才部分緩慢地降解木質(zhì)素。白腐菌能夠分泌胞外氧化酶降解木質(zhì)素,因此被認(rèn)為是最主要的木質(zhì)素降解微生物。目前,研究最多的白腐菌有:黃孢厚毛平革菌(Phanerochetechrysosporium)、彩絨草蓋菌(Coridusversicolor)、變色栓菌(Thametesversicolor)、射脈菌(Phlebiaradiata)、鳳尾菇(Pleurotuspulmononanus)、朱紅密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)等.這些菌多屬于擔(dān)子菌亞門,無隔擔(dān)子菌亞綱、無褶菌目的多孔菌科.王佳鈴等曾評(píng)述過1981～1995年間研究報(bào)道過的主要高產(chǎn)漆酶白腐真菌(表1)。褐腐菌的軟腐菌中的有些種類也可以分泌一些降解木質(zhì)素的酶類,但它們分解木質(zhì)素的能力不是很強(qiáng),因此,研究報(bào)道較少.降解木質(zhì)素的原核生物以放線菌為主,如鏈霉菌屬(Streptomyces)、節(jié)桿菌屬(Arthrobaeter)、小單孢菌屬(Micromonoyticum)和諾卡氏菌(Nocardia)等。細(xì)菌中有厭氧梭菌(Clostridumxylanoyticum)、假單孢菌(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)和芽孢桿菌(Bacillus)等原核生物對(duì)于在土壤中木質(zhì)素的轉(zhuǎn)化和降解具有重要作用,但土壤中木質(zhì)素的降解據(jù)報(bào)導(dǎo)是土壤微生物區(qū)系多種類型微生物協(xié)同進(jìn)行的結(jié)果,而且進(jìn)程緩慢,單一微生物純培養(yǎng)的商業(yè)用途前景不很清晰,且這類原核生物的多酚氧化酶是胞內(nèi)酶,這也決定了其在木質(zhì)素降解菌的研究中處于一個(gè)相對(duì)從屬的地位.此外,很多植物病原微生物如RhizoctoniasolaniR.praticola等也具有分解木質(zhì)素的能力,但這類微生物在處理秸稈上的應(yīng)用前景不大.在木質(zhì)素降解微生物中,研究得最多最徹底和最具應(yīng)用前景的是黃孢原毛平革菌。這種微生物的特點(diǎn)是培養(yǎng)溫度高(37℃左右),無性繁殖迅速,菌絲生長(zhǎng)快且分泌木質(zhì)素降解酶能力強(qiáng),它已經(jīng)成為研究白腐真菌的一種模式微生物’它的培養(yǎng)條件、代謝調(diào)控、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)及其在生產(chǎn)實(shí)踐上的應(yīng)用等均已被研究的相當(dāng)仔細(xì)。4.2木質(zhì)素降解酶的特性目前,關(guān)于木質(zhì)素降解酶的研究工作主要集中在白腐菌所產(chǎn)生的酶系。研究得較多,并認(rèn)為最為重要的木質(zhì)素降解酶有3種,即木質(zhì)素過氧化物酶(Ligninperoxidases/Lip)、錳依賴過氧化物酶(Manganeseperxidases/Mnp)和漆酶(Laccase).LiP,MnP和Laccase只是分別代表一系列的同功酶。但各種微生物所產(chǎn)生的酶的種類和一些理化特性是有所不同的。其中LiP是第一個(gè)從黃孢原毛平革菌發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素降解酶,以后又分別從射脈菌,彩絨革蓋菌,變色栓菌中發(fā)現(xiàn).Laccase沒有在黃孢原毛平革菌中發(fā)現(xiàn),而在Phlebia,Trametes,Coriolus等菌中發(fā)現(xiàn)。木質(zhì)素的降解酶系是非常復(fù)雜的一個(gè)體系,很多問題至今還不十分清楚.除了上述3種重要的酶外,其它的一些酶如芳醇氧化酶(AAO)、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶及一些還原酶、甲基化酶和蛋白酶等都參與或?qū)δ举|(zhì)素的降解產(chǎn)生一定的影響.LiP和Mnp都是帶有糖基的胞外血紅素蛋白.又稱血紅素過氧化物酶(HemePeroxidase),它們?cè)诜磻?yīng)中從苯酚或非酚類的苯環(huán)上奪取一個(gè)電子而使后者形成一個(gè)陽離子基團(tuán),從而導(dǎo)致木質(zhì)素分子中主要鍵的斷裂.LiP主要是氧化苯酚使之成為苯氧殘基.Mnp主要是從Mn2+和H2O2的氧化中得到Mn3+,然后Mn3+氧化苯酚使之成為苯氧殘基’而每種酶在木質(zhì)素降解中的具體作用還不甚清楚.漆酶(Laccase)是含銅的多酚氧化酶,主要來源于生漆和真菌。由于Laccase的含糖量高,難得到X-衍射分析用的漆酶單晶,它的三維空間結(jié)構(gòu)尚不清楚.但已經(jīng)證實(shí),漆酶中的銅離子在催化氧化反應(yīng)中起決定作用.根據(jù)磁學(xué)和光譜性質(zhì)可將漆酶中的4個(gè)銅離子分為3類:=1\*ROMANI型Cu2+和=2\*ROMANII型Cu2+各1個(gè),是單電子受體,呈順磁性,可以用核磁共振控測(cè);=3\*ROMANIII型Cu2+2個(gè),是雙電子受體,反磁性,用核磁共振不能檢測(cè).!=1\*ROMANI型Cu2+呈藍(lán)色,在λ614nm特征吸收峰;=2\*ROMANII型Cu2+為非藍(lán)色,沒用特征吸收峰;=3\*ROMANIII型Cu24+的離子對(duì)(Cu2+…Cu2+),在30處有寬的吸收峰.在木質(zhì)素降解過程的機(jī)制和作用至今人們還不完全清楚。作為一種多酚氧化酶,它可催化氧化酚類或芳胺類等多種底物的氧化作用。氧化酚或芳胺先失去一個(gè)電子生成自由基,后者發(fā)生一系列非酶反應(yīng),氧化成醌,在有O2存在時(shí),還原態(tài)漆酶被氧化,O2還原成水’底物自由基不穩(wěn)定,可進(jìn)一步發(fā)生鍵的斷裂或生成,導(dǎo)致裂解或聚合反應(yīng)。因此,底物分子可進(jìn)一步合生成復(fù)雜的產(chǎn)物,也可催化芳香環(huán)支鏈Cα-Cβ斷裂。GALIANO等發(fā)現(xiàn),當(dāng)Laccase和MnP分別單獨(dú)存在時(shí),都不能有效地降解木質(zhì)素,而2種酶同時(shí)存在時(shí)則木質(zhì)素得到有效的降解,這表明2種酶在催化木質(zhì)素生物降解反應(yīng)中具有協(xié)同作用.此外還發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)中加入其它的酶,如葡萄糖氧化酶時(shí),可顯著提高木質(zhì)素的降解程度.她們認(rèn)為,這是由于Laccase既有解聚,又有聚合木質(zhì)素的能力,加入葡萄糖氧化酶可原Laccase氧化多酚產(chǎn)生的醌等阻止木質(zhì)素的聚合作用,從而提高Laccase的降解能力.確定每一種酶在木質(zhì)素降解過程中的作用和功能是困難的,因?yàn)橹辽倌壳澳举|(zhì)素被微生物所產(chǎn)生的單一胞外酶徹底、完全地催化解聚和降解的情況還沒被發(fā)現(xiàn).每一種白腐真菌所產(chǎn)生的都不只是一種能降解木質(zhì)素的酶,在缺陷任一種酶的體系中木質(zhì)素仍能夠較好的降解,而這些酶之間又相互作用和影響,使其存在于一個(gè)協(xié)同作用體系中.雖然現(xiàn)在已能用14C標(biāo)識(shí)的合成木質(zhì)素來研究木質(zhì)素降解酶在木質(zhì)素降解中的作用機(jī)理,但由于木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,木質(zhì)素的徹底降解需依賴微生物區(qū)系中多種微生物在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)相互交替的生長(zhǎng)繁殖才能完成.4.3木質(zhì)素的降解微生物的酶活性調(diào)控機(jī)理在白腐菌產(chǎn)酶的培養(yǎng)方式上,研究最多的是液體培養(yǎng).國(guó)內(nèi)外曾利用多種不同有機(jī)、無機(jī)或復(fù)合碳源和氮源來研究它們對(duì)微生物的木質(zhì)素降解能力和產(chǎn)酶能力的影響.還研究了碳源或氮源限制對(duì)它們的影響.結(jié)果表明,碳源和氮源是微生物降解木質(zhì)素和產(chǎn)酶的一個(gè)極為重要的影響因素.不同的單糖、雙糖作碳源的礦質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)豹斑革菌時(shí),用麥芽糖生物的生長(zhǎng)量最高.標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下,以葡萄糖作對(duì)照,甘露糖和麥芽糖使MnP分別增2倍和3.8倍。酵母汁、牛肉膏等復(fù)合氮有利于LiP活性的提高,而甘氨酸、檸檬酸銨、乙醇胺等則抑制LiP的生成和活性.毛平革菌等白腐菌的木質(zhì)素降解和木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生是發(fā)生在氮源或其它營(yíng)養(yǎng)被消耗的次級(jí)代謝過程中.而細(xì)菌則與之相反,高濃度的有機(jī)或無機(jī)氮源都不能抑制木質(zhì)素降解,所產(chǎn)生的過氧化物酶也具有與生長(zhǎng)相聯(lián)和不受高水平氮抑制的特點(diǎn).我國(guó)學(xué)者李越中等曾對(duì)黃孢原平革菌合成木質(zhì)素過氧化物酶的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控進(jìn)行過較為詳細(xì)的研究報(bào)道(表2、表3)。微量元素對(duì)于白腐菌相關(guān)酶類的產(chǎn)生是有較大影響的。漆酶是一種含銅的多酚氧酶,因此,Cu對(duì)于漆酶的產(chǎn)生和酶活性是相當(dāng)重要的Mn對(duì)LiP和MnP都具有重要的作用,對(duì)漆酶的影響也是顯著的.BINNARME等認(rèn)為,Mn2+對(duì)LiP有抑制作用,而對(duì)MnP則有誘導(dǎo)作用,其作用的大小與Mn2+的濃度及添加時(shí)間有關(guān).C.subuermispora在Mn2+濃度為11×10-6mol·L-1時(shí),木質(zhì)素礦化速率最大,而MnP和Laccase的活性在4.0×10-6mol·L-1時(shí)最高.不添加Mn2+可使Agaricuscampestris的Laccase活性顯著降低,但Mn2+對(duì)其影響是以Cu2+的存在為前提,如果沒有Cu2+存在,那么Laccase的活性則與Mn2+濃度無關(guān)且酶活性始終很低.有報(bào)道,高濃度的Mn2+會(huì)提高Phlebiabreispora的Laccase活性,但對(duì)Dichomitus來說,Laccas活性都不受Mn2+的影響.結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素有關(guān)的低分子芳香化合物或木質(zhì)素降解的碎片化合物,可誘導(dǎo)Laccase產(chǎn)生并提高其酶產(chǎn)量,這類化合物如香草酸、藜蘆醇、愈創(chuàng)木酚、吐溫、甲苯胺等.在豹斑革耳菌上還發(fā)現(xiàn)了專一的MnP誘導(dǎo)物3-甲基芐醇.培養(yǎng)溫度、通氣狀況,PH值乃至環(huán)境濕度等,也是影響木質(zhì)素降解酶產(chǎn)生的因素.如黃孢原毛平革菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃,最適產(chǎn)酶溫度為30℃豹斑革耳菌增加通氣可使木質(zhì)素礦化率有所提高,而對(duì)于Phlebiaradiata來說,通氧則抑制其酶活性.培養(yǎng)溫度和PH值對(duì)Laccas的影響因具體菌種而異,不同的菌種有不同的適宜培養(yǎng)溫度和PH值.4.4木質(zhì)素的生物降解的應(yīng)用木質(zhì)素的生物降解目前成功地用于生產(chǎn)實(shí)踐的實(shí)際應(yīng)用尚不多見,但在有些方面的研究已經(jīng)顯現(xiàn)出誘人的前景.1)造紙工業(yè)分解木質(zhì)素的酶類在造紙工業(yè)上的應(yīng)用有兩個(gè)方面,一是用改造舊的造紙工藝,用于生物制漿、生物漂白和生物脫色-黃孢原毛平革菌和P.brevispora等在國(guó)外已經(jīng)得到成功利用-如用P.brevispora進(jìn)行生物制漿預(yù)處理可降低47%的能耗并增加了紙漿的張力,但它們的木質(zhì)素降解率和產(chǎn)酶量都還是極為有限的,處理時(shí)間過長(zhǎng),距大規(guī)模推廣應(yīng)用尚有一定的距離.二是木質(zhì)素分解菌或酶類用于造紙廢水的處理,這方面的國(guó)內(nèi)外研究報(bào)告已有很多且已取得了一定的實(shí)效.2)飼料工業(yè)木質(zhì)素分解酶或分解菌處理飼料可提高動(dòng)物對(duì)飼料的消化率-實(shí)際上,木素酶和分解菌的應(yīng)用已經(jīng)突破了秸稈僅用于反芻動(dòng)物飼料的禁地,已有報(bào)道飼養(yǎng)豬、雞的實(shí)驗(yàn)效果-目前,以木素酶、纖維素酶和植酸酶等組成的飼料多酶復(fù)合添加劑已達(dá)到了商品化的程度3)發(fā)酵與食品工業(yè)