基因工程及其應(yīng)用

（優(yōu)選）基因工程及其應(yīng)用當(dāng)前第1頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（重組DNA技術(shù)）；下游技術(shù)涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)及基因產(chǎn)物的分離純化過(guò)程。當(dāng)前第2頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

基因重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。供體、受體和載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。當(dāng)前第3頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計(jì)、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種基因工程的目的：當(dāng)前第4頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)工程細(xì)胞基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程發(fā)酵工程細(xì)胞工程分離工程酶酶工程分離工程天然細(xì)胞天然細(xì)胞生物活性物質(zhì)當(dāng)前第5頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表達(dá)經(jīng)典基因工程第二代基因工程蛋白編碼基因的定向誘變蛋白質(zhì)工程第三代基因工程代謝信息途徑的修飾重構(gòu)途徑工程第四代基因工程基因組或染色體的轉(zhuǎn)移基因組工程當(dāng)前第6頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

一基因工程育種

是運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)粒或其他載體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過(guò)細(xì)胞間的相互作用，使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)良性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另—個(gè)細(xì)胞的方法。當(dāng)前第7頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)基因克隆過(guò)程：１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；４、篩選、鑒定陽(yáng)性重組子；５、重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)。當(dāng)前第8頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第9頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)二基因工程常用的工具酶

基因工程所用到的絕大多數(shù)工具酶都是從不同微生物中分離和純化而獲得的。包括限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。當(dāng)前第10頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)限制（restriction)與修飾(modification)體系(R/M)：寄主是由兩種酶活性配合完成的:

一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶當(dāng)前第11頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。當(dāng)前第12頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

R/M體系的作用：

⑴保護(hù)自身的DNA不受限制；

⑵破壞外源DNA使之迅速降解。當(dāng)前第13頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)1、核酸限制性內(nèi)切酶的分類I型限制酶的基本特點(diǎn):反應(yīng)必須S-腺苷基蛋氨酸、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋，有特異識(shí)別位點(diǎn)但沒(méi)有特異切割位點(diǎn)，切割是隨機(jī)的。如EcoB和EcoKII型限制酶的基本特點(diǎn)：反應(yīng)必須ＡＴＰ和Ｍｇ２＋，具有特異性識(shí)別部位并切割。如EcoRI、HinfIIIIII型限制酶的基本特點(diǎn)：可以識(shí)別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24-26bp處切開DNA，切割位點(diǎn)沒(méi)有特異性。（一）限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）當(dāng)前第14頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則

第一個(gè)字母：大寫，表示所來(lái)自的微生物的屬名的第一個(gè)字母。第二、三字母：小寫，表示所來(lái)自的微生物種名的第一、二個(gè)字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來(lái)自的微生物的菌株號(hào)。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。例：EcoRI:來(lái)自于EscheriacoliRY13的第一個(gè)限制酶。當(dāng)前第15頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)形成粘性末端；形成平末端；

3、限制性內(nèi)切酶作用后的斷裂方式當(dāng)前第16頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第17頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第18頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

粘性未端：切開后的兩段DNA各留下一個(gè)尾，這2個(gè)尾的核苷酸順序完全一樣，方向相反。它們之間是互補(bǔ)的，在適當(dāng)條件下可以再連接一起。當(dāng)前第19頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)SelICGCGThaICGCGSau3AIGATCCTAGBamHIGGATCCCCTAGG同裂酶(來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列)同尾酶(來(lái)源不同，識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同粘性末端)當(dāng)前第20頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)4、限制片斷的末端連接作用分子間的連接：不同的DNA片斷通過(guò)互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來(lái)。分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。當(dāng)前第21頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第22頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)5、影響核酸內(nèi)切酶活性的因素⑴DNA的純度

DNase的污染(Mg2+)a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量

b.擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體系（稀釋）

c.延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當(dāng)?shù)臏囟取．?dāng)前第23頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)⑵DNA的甲基化程度⑶酶切消化反應(yīng)的溫度大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度37℃。⑷DNA的分子結(jié)構(gòu)某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性的DNA高29倍。當(dāng)前第24頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

⑸核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液ａ.氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：不正確的NaCl或Mg++濃度，會(huì)降低限制酶的活性，還可能導(dǎo)致識(shí)別序列的改變。ｂ.Tris-HCl：維持最適的pH值（pH＝7.4）。ｃ.β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：維持酶的穩(wěn)定性。ｄ.牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性。當(dāng)前第25頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)６、核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的消化作用⑴核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用。⑵核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的局部消化完全的酶切消化：識(shí)別序列n個(gè)堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對(duì)DNA的切割能達(dá)到每隔4n切割一次的水平。當(dāng)前第26頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

局部酶切消化：不讓核酸內(nèi)切限制酶對(duì)大量的DNA消化完全，就可以獲得平均分子量大小有所增加的限制片斷產(chǎn)物，進(jìn)行不完全的限制酶消化反應(yīng)。

a.縮短酶切的消化反應(yīng)的保溫時(shí)間

b.降低反應(yīng)的溫度（37--4）結(jié)束酶的活性

⑶核酸內(nèi)切限制酶對(duì)生物基因組的消化作用小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）大分子量的片斷-----多（基因文庫(kù)）當(dāng)前第27頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（二）其它工具酶當(dāng)前第28頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)１、末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）

能催化5’脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5’－3’方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA或雙鏈DNA。當(dāng)前第29頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第30頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

用途：ａ.催化[α-32P]-3’-脫氧核苷酸標(biāo)記DNA片斷的3’末端?？捎糜跍y(cè)序的終止，一位不含游離的3’-OH末端。ｂ.催化非放射性的標(biāo)記物摻入到DNA片斷的3’-末端：生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。ｃ.用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。當(dāng)前第31頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)２、堿性磷酸酶來(lái)自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過(guò)程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5’端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。當(dāng)前第32頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第33頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)３、S1核酸酶來(lái)自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。４、反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）這類酶來(lái)自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。當(dāng)前第34頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)５、連接酶⑴用ＤＮＡ連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片斷。⑵用Ｔ４ＤＮＡ連接酶將平末端的DNA片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ連接酶連接。⑶先在DNA片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ連接酶連接。當(dāng)前第35頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)ＤＮＡ連接酶：能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。

只能連接切口（nick），不能連接缺口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。當(dāng)前第36頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)切口切口缺口缺口當(dāng)前第37頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺鍵DNA的腺苷酸復(fù)合物3’-OH對(duì)P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機(jī)理此反應(yīng)是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵當(dāng)前第38頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

連接酶的來(lái)源(1)DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的(2)T4DNA連接酶：大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP當(dāng)前第39頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二酯鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)合起來(lái)。

DNA連接酶對(duì)具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對(duì)平末端的DNA分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。當(dāng)前第40頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第41頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

影響連接酶作用的因素（1）反應(yīng)溫度：連接缺口的溫度：37℃

連接粘性末端的最佳溫度：4～15℃

（2）Ｔ４ＤＮＡ連接酶的用量：平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個(gè)單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個(gè)單位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之間（3）提高外源片斷與載體的濃度的比值（10～20倍）當(dāng)前第42頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

粘性末端DAN片斷的連接由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。對(duì)載體的5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進(jìn)行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

當(dāng)前第43頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第44頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

平末端DNA片斷的連接（1）T4DNA連接酶（2）用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法當(dāng)前第45頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B中分別加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40個(gè)堿基當(dāng)前第46頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無(wú)法用原來(lái)的限制酶作特異性的切割。

當(dāng)前第47頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)銜接物連接法平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。BamHI或Sau3A/NotI當(dāng)前第48頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。雙銜接物：可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。當(dāng)前第49頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)銜接物連接法當(dāng)前第50頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過(guò)DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物EcolI當(dāng)前第51頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

在用DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。當(dāng)前第52頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)DNA接頭（adapter）連接法：

1978年，美國(guó)康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過(guò)堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì)DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。當(dāng)前第53頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第54頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)DNA接頭連接法當(dāng)前第55頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

熱穩(wěn)定的連接從嗜熱高溫放線菌的菌株中分離出來(lái)的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。(1)寡核苷酸連接測(cè)定（oligonucletideligationassay,OLA）用兩個(gè)寡核苷酸探針，同已知序列的靶DNA雜交，探針在靶DNA分子的位置是相鄰的。(2)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（lingasechainreaction,LCR）；也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)（lingaseamplicationreaction）用寡核苷酸探針通過(guò)DNA連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶DNA的方法。需要4種引物。當(dāng)前第56頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)寡核苷酸連接測(cè)定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGTTACCTTCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCTAGTGACCTACCT

待擴(kuò)增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP陽(yáng)性信號(hào)無(wú)信號(hào)酶抗生素蛋白由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵檢測(cè)單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性當(dāng)前第57頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)LCR：ligasechainreaction，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。樣品DNA、探針(4)94度變性當(dāng)前第58頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)6、DNA聚合酶(1)大腸桿菌DNA聚合酶(2)大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片斷酶(3)T4DNA聚合酶(4)T7DNA聚合酶(5)反轉(zhuǎn)錄酶當(dāng)前第59頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)共同點(diǎn)：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。當(dāng)前第60頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)(1)大腸桿菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）

DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）

PolⅠ和PolⅡ的主要功能參與DNA的合成；

PolⅢ的功能同DNA的復(fù)制有關(guān)；

PolⅠ同DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。當(dāng)前第61頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美國(guó)的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說(shuō)的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為1091000dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個(gè)片斷，一個(gè)具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一個(gè)具有全部

5’3’的外切酶活性。

當(dāng)前第62頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：a底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；bMg＋＋離子；c帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈；dDNA模板：?jiǎn)捂?，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個(gè)或多個(gè)斷裂）。

當(dāng)前第63頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第64頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性（a）5’3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；（b）切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距5’末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上發(fā)生；（c）DNA的合成可以增強(qiáng)5’3’的核酸外切酶活性；（d）5’3’核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及3’5’的水解作用位點(diǎn)是分開的。當(dāng)前第65頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性

能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開始向5’的方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。

對(duì)酶活的影響：

反應(yīng)物中缺乏dNTPs時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。但對(duì)于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時(shí)，這種降解活性將會(huì)被5’3’的聚合酶活性所抑制。

當(dāng)前第66頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

當(dāng)前第67頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通過(guò)DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。

DNA缺口轉(zhuǎn)移（nicktranslation）在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個(gè)5’核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個(gè)鍵，隨著5’一側(cè)的核苷酸不斷移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)。

當(dāng)前第68頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

DNA雜交探針的制備

典型的反應(yīng)體系是。在25μl總體積中含有1μg純化的特定DNA片斷，并加入適量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標(biāo)記的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的斷裂或缺口；

PolＩ

：進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物中的32p標(biāo)記的核苷酸取代原有的未標(biāo)記的核苷酸，最終從頭到尾都被標(biāo)記。當(dāng)前第69頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

dNTP對(duì)PolＩ酶活性的影響

在低濃度dNTPs的條件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs濃度時(shí)，PolＩ則能夠更有效的合成DNA。低濃度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高濃度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs參入DNA鏈（DnaseＩ數(shù)量）。

當(dāng)前第70頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)(2)Klenow片斷

Klenow片斷：是由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來(lái)的分子量為761000dal的大片斷分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性，失去了全酶的5’3’外切酶活性。

當(dāng)前第71頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)Klenow片斷的主要用途：a、修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；b、標(biāo)記DNA片斷的末端；c、cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成；d、DNA序列的測(cè)定。當(dāng)前第72頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)DNA片斷末端標(biāo)記：具有3’隱蔽末端的帶標(biāo)記得的DNA片斷

5’GATCT…3’3’A…5’在反應(yīng)物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道溫育后生成：

5’GATCT…3’3’32pGA…5’或是同時(shí)加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32pAGA…5’當(dāng)前第73頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

DNA片斷末端標(biāo)記可以作為用凝膠電泳法測(cè)定分子大小的標(biāo)記樣品。因?yàn)楸粯?biāo)記的DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無(wú)關(guān)。所以在限制酶消化過(guò)程產(chǎn)生的大小DNA片斷都得到了同等程度的標(biāo)記。不能夠有效的標(biāo)記帶有5’突出末端的DNA分子。當(dāng)前第74頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)(3)T4DNA聚合酶a從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性。b在沒(méi)有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨(dú)特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按3’5’的方向從3’-OH末端開始降解DNA。如果反應(yīng)物中存在一種dNTP時(shí)，它的水解作用進(jìn)行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的dNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)就會(huì)停止。c在反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)T4DNA聚合作用，反應(yīng)物中的α-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片斷上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

當(dāng)前第75頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

合成取代法優(yōu)于缺口轉(zhuǎn)移法：a不會(huì)出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而缺口轉(zhuǎn)移制備的探針會(huì)出現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)；b應(yīng)用適宜的核酸內(nèi)切限制酶切割，便可很容易的變成特定序列的探針。當(dāng)前第76頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)具EcoR1位點(diǎn)的DNA分子對(duì)DNA分子3‘端有控制的降解合成作用產(chǎn)生選擇性標(biāo)記T4DNA聚合酶的取代合成法標(biāo)記DNA斷末端及制備鏈的特異探針當(dāng)前第77頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)(4)反轉(zhuǎn)錄酶：具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA為模板合成cDNA；用來(lái)對(duì)5’突出末端的DNA片斷作末端標(biāo)記。當(dāng)前第78頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第79頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第80頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

合成cDNA的主要步驟：a應(yīng)用poly(A)mRNA為模板，以12~18個(gè)堿基長(zhǎng)的oligo(dT)片斷作為引物，加入反轉(zhuǎn)錄酶，合成出cDNA第一鏈;b用堿水解法除去mRNA模板，單鏈cDNA能自我折疊形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，作第二鏈的引物，用反轉(zhuǎn)錄酶或Klenow聚合酶催化第二鏈cDNA的合成；c用SＩ核酸內(nèi)切酶消化除去單鏈區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。d通過(guò)同聚物或合成的銜接物，使DNA分子克隆到適當(dāng)?shù)妮d體分子上。當(dāng)前第81頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)(5)T7DNA聚合酶：

1978年，S.Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來(lái)的一種核酸酶。具有5’3’的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3’5’核酸外切酶活性。當(dāng)前第82頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)T7DNA聚合酶的用途：a用于對(duì)大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，聚合能力較強(qiáng)可延伸合成數(shù)千個(gè)核苷酸）b通過(guò)延伸或取代合成法標(biāo)記DNA3’末端c將雙鏈DNA的5’或3’突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第83頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

修飾的T7DNA聚合酶對(duì)天然的T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。當(dāng)前第84頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)三克隆載體載體(vector)是攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的DNA；一般是通過(guò)改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。當(dāng)前第85頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)載體應(yīng)具備以下條件：１、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制；２、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源DNA插入；３、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽(yáng)性與陰性重組分子；４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時(shí)載體DNA與宿主DNA便于分離；５、對(duì)于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等基因表達(dá)元件。當(dāng)前第86頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

根據(jù)基因組的大小選擇合適的載體

載體

plasmidphageλcosmidBACYAC

插入片斷

(kb)523453501000當(dāng)前第87頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)pBR322plasmid當(dāng)前第88頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)左臂替換型載體右臂克隆位點(diǎn)phageλ應(yīng)用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶消化載體，除去可取代的DNA區(qū)段；同外源DNA片段連接；對(duì)重組體的λDNA分子包裝增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體。當(dāng)前第89頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)cosmid由λDNA片段（cos位點(diǎn)）和質(zhì)粒DNA共同組成具有λ噬菌體特性：克隆合適大小外源DNA后體外包裝可以導(dǎo)入大腸桿菌具有質(zhì)粒載體特性：能像質(zhì)粒樣復(fù)制，具有選擇性標(biāo)記基因高容量克隆能力：45kb與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力：重組形成共合體當(dāng)前第90頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)四常用的基因工程宿主1）大腸桿菌2）枯草芽孢桿菌3）釀酒酵母4）動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)：生長(zhǎng)迅速、極易培養(yǎng)、能在廉價(jià)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，遺傳學(xué)及分子生物學(xué)背景十分清楚當(dāng)前第91頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)宿主細(xì)胞必須符合以下條件１、對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒(méi)有嚴(yán)格的限制；２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過(guò)程中，不會(huì)對(duì)它進(jìn)行修飾；４、重組缺陷型，不會(huì)產(chǎn)生體內(nèi)重組；５、容易導(dǎo)入重組DNA分子；６、符合重組DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前第92頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)如何獲得目的基因？cDNA基因克隆基因組DNA文庫(kù)限制性內(nèi)切酶消化機(jī)械隨機(jī)切割PCR方法獲得目的基因五基因工程的常用技術(shù)和方法當(dāng)前第93頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（一）cDNA基因克隆

cDNA文庫(kù)是指得到足夠多的分別克隆的cDNA片段，匯集這些克隆應(yīng)包含某種細(xì)胞中各種mRNA的相應(yīng)順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。當(dāng)前第94頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)1、沒(méi)有原核生物的cDNA文庫(kù)原核生物的

mRNA

非常不穩(wěn)定；原核生物的基因組文庫(kù)比較容易構(gòu)建，能包含所有基因的序列。２、cDNA

文庫(kù)對(duì)于真核生物的基因分析

cDNA文庫(kù)是只含有編碼蛋白的基因文庫(kù)

cDNAs

沒(méi)有內(nèi)含子基因可以在E.coli

中直接表達(dá)

得到mRNA

反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA當(dāng)前第95頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)３、mRNA

分離原理當(dāng)前第96頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)１）

傳統(tǒng)的分離方法是用oligo(dT)-纖維素柱分離總RNA２）把oligo(dT)-磁珠同總RNA混合，在強(qiáng)磁場(chǎng)下分離mRNA３）用蔗糖梯度離心mRNA核糖體復(fù)合體（溶解細(xì)胞）來(lái)分離mRNA４、三種分離mRNA的方法當(dāng)前第97頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第98頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（二）基因組DNA文庫(kù)純化基因組DNA

基因組DNA的片斷化:物理切割和限制性內(nèi)切酶

eukaryotes:從細(xì)胞核中去除蛋白,脂類和其他雜質(zhì).prokaryotes:直接提取當(dāng)前第99頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)HaeIII：5’-…GG/CC…

3’,Sau3A:5’-/GATC-3’,AluI:5’-…AG/CT…

3’,

BamH1:5’-G/GATCC-3’（三）限制性內(nèi)切酶消化1、將片斷的末端(粘性或平頭)和酶消化的載體連接2、酶切位點(diǎn)是否被修飾3、內(nèi)切酶消化的時(shí)間和用量取決于要插入片斷的大小范圍當(dāng)前第100頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)兩個(gè)特點(diǎn):第一是假如所需的基因含有所用限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，那么這一基因?qū)⒈豢寺≡趦蓚€(gè)或數(shù)個(gè)片段中，給研究帶來(lái)一定的困難。第二一般常用的限制酶大多識(shí)別6個(gè)bp序列，切割DNA所產(chǎn)生的片段的平均大小相對(duì)比較小，因此整個(gè)基因文庫(kù)要含有非常大量的重組體，這樣應(yīng)用分子雜交法進(jìn)行篩選就十分費(fèi)事費(fèi)時(shí)。雖然可以用限制酶進(jìn)行部分消化，產(chǎn)生約20kb的片段，但這種方法必須掌握好酶解的條件。

當(dāng)前第101頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（四）機(jī)械隨機(jī)切割可以制備大片段的DNA（用噬菌體λ作載體約20kb，以cosmid作載體約45kb），從而克服上述的兩處缺點(diǎn)。不足之處：所制備的片段的末端順序是隨機(jī)的，還必須經(jīng)過(guò)末端修復(fù)，人工制造接頭等手續(xù)才能與載體DNA進(jìn)行連接。

當(dāng)前第102頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

有一些序列不能被克隆

Example:1)序列缺乏酶切位點(diǎn);2)目的基因包容在一個(gè)其大小范圍超出載體承載能力的DNA片斷上

Toolongforthevectorused當(dāng)前第103頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（五）PCR方法獲得目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）特點(diǎn)：在體外模擬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的DNA復(fù)制過(guò)程當(dāng)前第104頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)根據(jù)需擴(kuò)增片段的兩端設(shè)計(jì)引物。使DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長(zhǎng)）反應(yīng)。特點(diǎn)：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。當(dāng)前第105頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)PCR原理PCR儀當(dāng)前第106頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第107頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和克隆當(dāng)前第108頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

DNA分子的體外連接

DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。當(dāng)前第109頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)DNA連接酶DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來(lái)自T4噬菌體的DNA連接酶。T4DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的DNA片段；２、連接雙鏈DNA分子間的平端；３、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。當(dāng)前第110頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)重組DNA導(dǎo)入宿主菌

體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。當(dāng)前第111頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)原核生物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染E.coli的鈣轉(zhuǎn)化E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)前第112頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)真核生物的轉(zhuǎn)染1.磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)2.電穿孔法3.基因槍轉(zhuǎn)染法4.激光微束穿孔法5.顯微注射法6.脂質(zhì)體介導(dǎo)法7.多聚物介導(dǎo)法當(dāng)前第113頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（一）遺傳轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化是指受體細(xì)胞直接攝取供體細(xì)胞游離的DNA片段，將其同源部分進(jìn)行堿基配對(duì)，組合到自己的基因中，從而獲得供體細(xì)胞的某些遺傳性狀。當(dāng)前第114頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（二）自然轉(zhuǎn)化一般可人為地分為下列三個(gè)階段(1)感受態(tài)的出現(xiàn)

(2)DNA的結(jié)合與進(jìn)入

(3)DNA的整合當(dāng)前第115頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)(三)操作步驟質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入10ml肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。2．取0.5ml培養(yǎng)物接入50ml肉湯中，無(wú)菌添加0.4ml2.5mol／LMgCl2，于37℃振蕩培養(yǎng)。3．將o.1mol／LCaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。當(dāng)前第116頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)4．當(dāng)培養(yǎng)物OD600在o.5～o.8左右時(shí)，開始收獲細(xì)胞(大約需2～2.5h)．5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。6．取10ml培養(yǎng)物置2個(gè)冷離心管中棄去上清液。7．加入1ml0.1mol／LCaCl2，再加0.9mlCaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min離心10min，棄去上清液。當(dāng)前第117頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)9．加入1ml0.1mol／LCaCl2，重新懸浮細(xì)胞，置冰浴中保存。10．加入1～20μl待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒

DNA溶液。11．在冰上放置20min，在37℃處理2min。再插入冰中，加入0.9m1肉湯37℃靜置培養(yǎng)90min。12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。13．于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。當(dāng)前第118頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（四）常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)1、自然系統(tǒng)2、人工誘導(dǎo)（完整細(xì)胞）（1）二價(jià)陽(yáng)離子系統(tǒng)：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++輔助噬菌體，Tris+Ca2+（2）單價(jià)陽(yáng)離子系統(tǒng)：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）凍融系統(tǒng)（4）Triton處理：人工誘導(dǎo)（PEG/原生質(zhì)體）當(dāng)前第119頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（五）轉(zhuǎn)染和感染

利用噬菌體DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。當(dāng)前第120頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)重組克隆的篩選與鑒定

基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽(yáng)性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。當(dāng)前第121頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（一）抗藥性標(biāo)志的篩選

如果克隆載體帶有某種抗藥性標(biāo)志基因如ampr或tetr

，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來(lái)。如果重組DNA時(shí)將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，該標(biāo)志基因失活，通過(guò)有無(wú)抗菌素培養(yǎng)基對(duì)比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。當(dāng)前第122頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（二）β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選很多載體都攜帶一段細(xì)菌的lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端的146個(gè)氨基酸，稱為α－肽，它表達(dá)β－半乳糖苷酶的C-端肽鏈。當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的α－互補(bǔ)。而重組子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補(bǔ)，在含X-gal的平板上，含陽(yáng)性重組子的細(xì)菌為無(wú)色菌落或噬菌斑。當(dāng)前第123頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)（三）菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測(cè)載體質(zhì)粒大小，判斷有無(wú)插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。（四）內(nèi)切酶圖譜鑒定經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對(duì)于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。當(dāng)前第124頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)重組DNA的鑒定

遺傳學(xué)方法當(dāng)前第125頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)

應(yīng)用核酸探針?lè)蛛x克隆的目的基因1.獲得探針2.轉(zhuǎn)膜3.雜交當(dāng)前第126頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\2點(diǎn)探針的來(lái)源某種生物實(shí)驗(yàn)體系中分離到的基因序列，可作為從其它生物中分離相關(guān)基因的核酸探針。2.根據(jù)蛋白質(zhì)家族保守性，合成核酸探針。功能相同或相近的蛋白質(zhì)，存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段（保守區(qū)），往往由彼此相鄰的6~7個(gè)氨基酸組成。當(dāng)前